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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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Q. cdna 합성시 total rna 3과 5의 차이
안녕하세요 초짜 대학원생입니다. 실험실에서 사용하는 protocol과정에서 왜 이렇게 하는지 공부중입니다. cDNA합성시 RNA농도가 낮을시 total rna 3ug 이용, 높을시 5ug 이용하여 cdna합성키트를 이용합니다. 3,5를 구별해서 사용하는데 왜 나눠서 사용하는지 모르겠습니다. cDNA합성키트는 takara 6110A를 사용하는데 설명서 읽어봐도  <5ug로 나와서 잘 모르겠습니다. 왜 3,5를 구별해서사용하는지 궁금합니다.  
회원작성글 토짜  |  2020.04.02
Q. RNA를 확인할 때 어떤 gel을 주로 사용하시나요?
안녕하세요. RNA 관련 실험을 하고 있는 석사 과정생입니다. 실험실에 RNA 실험을 하시는 선배가 없어 bric에 질문하게 되었습니다. 저는 in vitro transcription을 통해 mRNA를 만들고 agarose gel에서 확인하고 있습니다. 타겟 band만 관찰될 때도 있고, 그 이하 사이즈의 여러 band가 보일 때도 있습니다. 해당 mRNA를 바탕으로 한 translation이 잘 되는것을 보아, native gel를 사용했기 때문이라 생각하고 실험을 진행해왔습니다. 허나, multi band의 원인이 secondary structure가 파괴되지 않아 그런 것인지 RNA 자체가 degradation된 것인지 확인해야 할 것 같아, RNA 실험하실 때 어떤 gel을 주로 사용하시는지 여쭤보고 싶습니다. formadehyde-agarose gel을 쓰시는 분들도 계시고, polyacrylamide gel을 사용하시는 분들도 계시는 것 같은데, 둘 다 초보자가 쉽게 만들 수 있을까요?? 감사합니다.
회원작성글 HunZii  |  2020.03.22
Q. nucleotide나 amino acid variation 정리할때
여러 샘플을 한눈에 비교할 수 있게 그래프/표로 만들때 좋은 프로그램이 있나요?
회원작성글 dongss  |  2020.03.18
Q. 프라이머 짜려하는데 Isoform1, Isoform2 차이점좀알려주세요!
프라이머를 짜려고하는데 Aquaporin-3의  isoform1, isoform2이 두개의 차이점이 어떤건가요?? 어떤시퀀스를 짜서 픽을할지.. 도와주세요!!
회원작성글 구구갸갸  |  2020.03.13
Q. Realtime PCR 질문있습니다!
  Realtime PCR을 진행을하는데 픽이너무안떠서요 ㅠ_ㅠ 도움부탁드립니다!   진행순서는 프라이머(10Pm)  Reverse, Forward, SBYR를  한 튜브에 넣어 섞은후 가벼운볼텍싱  CDNA를 DEPC Water에 섞은후  PCR plate에 6ul씩분주후 혼합한 프라이머를 9ul씩 분주후 total volume 15ul 125 RCF로  2분정도 Centrifuge한다음에 PCR 을진행을하였는데 GAPDH는 잘나오는데 나머지 프라이머들이 너무안나오네요아예 픽이안뜨고 none 으로뜹니다.. Gradient를 먼져 진행을한다음 그 TM값으로 Realtime PCR을 진행을하는데 Gradient에서는 픽이뜨는데 왜 Reatime PCR만 진행하면 아예 픽이안뜰까요 GAPDH는 잘뜨는 걸로봐서는 CDNA문제는아닌거같고 Gradient 에서 뜨는걸봐선 primer문제도아닌거같구.. 그냥 단순히 기술적인 문제가 클까요??   
회원작성글 구구갸갸  |  2020.03.09
Q. 논문 해석 중에 'mRNA 유전자 발현' 관련 벤다이어 그램 해석을 도통 못하겠네요. 첨부파일
카테코리도 맞게 질문하는 건지모르겠지만 우선, 질문을 해보겠습니다. 스트레스 관련 논문에서, 만성적인 스트레스를 받으면 뇌를 구성하는 피질의 유전자의 변화가 일어난다는 내용입니다. (벤다이어 그램은 파일 첨부에 올려놓았습니다.) 'Stress and prefrontal cortical plasticity in the developing brain'  이 논문 이구요. 여기에 벤다이어 그램이 있는데, 이 내용을 해석한게, Mychasiuk, Muhammad, and Kolb (2016) compared the mRNA gene expression in the mPFC, OFC, and HPC following 14 days of platform stress followed by a 14 day recovery period, and found areal differences in gene expression patterns. As in the morphological studies (Fig. 4) the mPFC and OFC exhibited contrasting effects in gene expression. Somewhat surprisingly, given that most previous studies of stress and PFC plasticity have been on the mPFC and HPC, it was the OFC that showed the most extensive changes in gene expression. Overall,this study found gene expression changes that are likely related to the changes in neuronal morphology and cognition associated with chronic stress. -  만성적 인 성인 스트레스에 따른 광범위한 후 성적 변화도 있습니다. Mychasiuk, Muhammad 및 Kolb (2016)는 14 일의 플랫폼 스트레스 후 14 일의 회복 기간에 이어 mPFC, OFC 및 HPC에서 mRNA 유전자 발현을 비교하고 유전자 발현 패턴에서 면적 차이를 발견했다. 형태 연구 (그림 4)에서와 같이 mPFC와 OFC는 유전자 발현에서 대조 효과를 나타냈다. 놀랍게도 스트레스와 PFC 가소성에 대한 이전의 대부분의 연구가 mPFC와 HPC에 관한 것이라는 점을 감안할 때 OFC는 유전자 발현에서 가장 광범위한 변화를 보여주었습니다. 전반적으로,이 연구는 만성 스트레스와 관련된 신경 형태 및인지의 변화와 관련이있는 유전자 발현 변화를 발견했다. - 이 내용입니다. 벤다이어 그램 안에 있는 ↑, ↓ 이렇게 되어 있는게 어떤 의미 인지 모르겠습니다. 그리고 공통 적으로 원두개에 겹치는 부분의 의미도요. 14일 이후의 스트레스를 받아 새로운 유전자가생성 되었다는 의미가 빨간색 화살 표 이며, 기존의 유전자가 사라졌다는게 파란색 화살표를 의미하는 건가요? 그리고 공통부분은 공통된 유전자가 나타난다. 이런 말인지.. 모르겠네요. 답변해주시면 감사하겠습니다. 그럼 수고하세요!        
회원작성글 나이스타이밍  |  2020.03.06
Q. primer efficiency 와 melting curve
리비워가 the primers efficiency  테스트 했는지 물어 봤는데요.  검색을 해보니 starndard curve 를 확인들 하시드라고요  저희 랩은 melting curve 에서 피크가 하나만 나오면 잘 짜진 프라이머라고 믿고 쓰는데요. ^^;; 사실 제가 피시알의 기본이 많이 모자라서 ㅠ 찾아도 감이 없구 지금 저희랩은 피시알 잘하는 사람이 없어서... 여기 분들에게 문의해요.앞서 감사드려요.  1. melting curve 로 충분 할까요, standard curve 그려서 내야할까요 ?  2. 멜팅커브로 해도 된다면, 저희가 보는건 one peak 인데... 혹시 온도는 상관이 없는지 갑자기 궁금해졌습니다. gene들의 Tm 온도의 차이가 있습니다.  2. 제가 확인했던 Melting curve 를  기계에서 그대로 그림으로 리포트해서 보여주고 이렇게 확인 했다 해도 될까요 ?  3. melting curve 는 프라이머만 (단백질 없이) 찍은걸 보여주는건가요, 아니면 제 모든 쌤플의 멜팅컬브를 보여주는건가요? )  4. 혹 standard curve 를 그려야 한다면.. 어떻게 그리는건지 알려주실수있나요? 여기저기 유툽으로 그리는 방법및 값을 찾으니 뭔가 복잡하고, 너무 옛날 방법같아서요.    
회원작성글 셀살리기  |  2020.02.20
Q. gene과 mRNA
최종 목적은 새로운 유전자를 찾아 식물에 형질전환 하려고 합니다. 논문에 밝혀진 arabidopsis 유래 유전자를 NCBI에 검색을 하였고, 그 유전자를 blast를 통해서 제가 원하는 식물종에서 mRNA가 비슷하다는 것을 확인하였습니다. 제가 원하는 식물종은 full 시컨싱이 되어있는데 유전자 기능은 밝혀지지 않았습니다. 그래서인지 blast 결과 원하는 종에서는 mRNA가 검색됩니다. 그런데 mRNA에서 염기서열을 orf 영역을 확인하였는데 짧은 엑손부분과 인트론 그리고 긴 엑손 부분이 있습니다.  mRNA는 엑손만 존재해야되는데 왜 인트론 부분도 있는거죠? 유전자 기능을 알려면 형질전환 해야되는데 그러면 어떻게 해야되는지 궁금합니다.  
회원작성글 사시루  |  2020.02.15
Q. nanodrop으로 c-DNA 농도 측정 가능한가요?
RNA 추출해서 샘플들 정량해서 동일하게 맞추어 c-DNA 합성했습니다. 그리고 qRT-PCR 진행하려고 하는데 c-DNA 농도가 너무 높아도 안좋다고 알고있는데 그러면 c-DNA 농도를 어떻게 측정하나요? nanodrop으로 가능한가요? 안된다고 알고있는데... 혹시, 된다면 농도는 어느정도 맞춰서 qrt-pcr 하면 될까요? 그리고 안된다면 어떻게 농도를 맞춰서 사용하나요?
회원작성글 뿌뿌  |  2020.02.15
Q. qPCR threshold 질문입니다.
target gene이 많아 96well plate에 한번에 실험을 진행하기 어려운 상황입니다. 따라서 각각 샘플의 target gene과 house keeping gene만 넣어 각각의 threshold를 잡아 Ct값을 구해도 괜찮을까요? 예로 모든 샘플값의 threshold를 잡으면 auto 시 RFU 값 2000의 threshold와 각 Ct값이 나옵니다. 하지만 한 샘플의 taget gene 1개(2반복) house keeping gen 1개(2반복) 만 넣어 threshold값을 잡으면 auto 시 1700 RFU 가 나오며 이때 taget gene과 house keeping gene의 ct값을 구한 뒤 이런식으로 구한 다른 target gene 들과 ddCt법을 통한 상대정량을 해도 괜찮을까요?아니면 모든 샘플의 threshold 값을 일정하게 맞춰주어야 할까요? 정리하자면 RT-qPCR을 통한 상대정량 시 96well을 넘어가는 실험에서 threshold 값을 어떻게 설정하는게 좋을까요? 1. 각각의 샘플에 대해 1개의 target gene과 house keeping만 넣어 각각 다른 auto threshold 값을 부여하여 상대정량하여야 할지? 2. 모든 샘플의 threshold 값을 통일하여 Ct 값을 읽어야할지? 궁금합니다.
회원작성글 신망고  |  2020.02.11
Q. qRT-PCR 장비 구매 고려사항 질문
안녕하세요, 이번에 연구실에 qRT-PCR 장비를 구매하려고 합니다. 논문에서 data만 봤지 실험은 직접 해본적이 없어서 장비 구매시에 무엇을 고려해야하는지 잘 모르는 상태입니다.   선배님들의 장비 구매 고려사항 및 추천 모델에 대해서 알려주셨으면 합니다.   감사합니다.
회원작성글 알러지  |  2020.01.30
Q. Calcein,DAPI, EtheD staining 후 PCR sampling
Confocal 촬영을 위해 세포에 Calcein AM, DAPI, Ethe-D homodimer staining 후 그 셈플을 RNA extraction 한 뒤 qRT-PCR 진행해도 결과에 영향이 없을까요?
회원작성글 냐하하하하  |  2020.01.29
Q. polysome profiling 질문 합니다 첨부파일
이 그림에서 컨트롤만 봐주시길 바랍니다!  컨트롤을 보면 나중으로 가다가 mRNA 양이 감소되는데 왜 gradient 값이 높아지는데 점점 감소하는 건가요? ㅠㅠ  그래프에서 픽 마다 의미 알려주시면 더 감사하겠습니다 ㅠㅠㅠ   감사합니다.
회원작성글 밍맹뭉  |  2020.01.15
Q. cDNA 질문
안녕하세요. 예전에 제가  배우기로는 cDNA를 single strand로 합성하여 qPCR 을 했었는데요.   최근에 다른 랩에 가보니, cDNA synthesis kit가 double strand로 합성하더라구요. 이 때 먼저 single로 만든다음 다시 RNaseH 이용하여 double strand로 합성하던데, single strand까지만 만들고 qPCR해도 될까요?   RNA work을 잘하지 않아 질문드려봅니다. 답변 미리 감사드립니다.
회원작성글 ecosci  |  2019.12.29
Q. mRNA 주문 제작
mRNA와 RT-PCR을 위한 프라이머를 주문 제작하려고 하는데요, cDNA를 합성해서 형질전환을 하려고 하기 때문에 제한효소 자리를 포함한 프라이머를 만들려고 합니다. 제한효소 자리와 겹치는 서열이 mRNA에 없다면 제한효소 자리를 포함하는 프라이머를 제작해도 아무 문제 없나요??
회원작성글 이윤비  |  2019.12.16
Q. real time pcr에서 첨부파일
real-time PCR을 돌리고 나서 melting curve를 확인했을때, 보통 curve가 하나로 나와야하는데 두개로 나올 때는 어떻게 생각해야될까요!?   저기서 샘플 몇개에서만 curve의 위치가 다르다면 그 샘플이 이상하다고 생각하고 넘기는데, 그림처럼 여러개의 샘플들이 두 개의 curve로 나뉜다면 무엇이 문제일까요!?
회원작성글 서뚜니  |  2019.12.10
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