DNA PCR을 통한 mutant를 얻는 실험을 얻고자 하는데PCR후 Dpn1 처리 전에 gel로 DNA band를 꼭 확인해봐야 하나요??사수는 Dpn1 처리 전에 gel로 DNA band확인 후 PCR purification을 하고 그 이후에 Dpn1처리를 하라고 알려줬는데 실험실 다른분들께 여쭤보면 바로 Dpn1 처리를 한다고 하더라구요.큰 차이가 있나요?

 dna integrity number에 대하여 아시는 분 계신가요.DIN에 대한 정확한 의미와 어느정도의 수치 이상이여야 검사가 가능한지 궁금합니다.업체로 FFPE 검체를 보냈을때 수치가 2~3 밖에 나오지 않아 검사가 진행되지 않았다고 연락이 왔습니다. 의미와 어느정도의 수치가 있어야 검사가 가능한가 궁금하여 여쭙니다.

 안녕하세요 고수님들께 조언을 얻고자 질문을 남깁니다.저는 지금 새로 박사과정을 시작하면서 로테이션 중인데, 새로 생긴 실험실에서 혼자 작은 실험들을 해내고 있습니다. 그 중 하는 것이 10kb 정도 되는 (pLV 혹은 pcDH) 템플릿에서 아미노산 하나만 바꾸는 SDM 을 하고 있습니다. quikchange ii XL 로 하나의 SDM 은 성공했는데, 그 후로는 quikchange ii 로 진행하고 있습니다. 모든 것을 스탠다드 프로토콜을 따라서 거의 변형 없이 진행을 하였습니다. template 50ng, primer 125ng, 온도 시간 그대로. extension 10min (1kb/min) , cycle 18, 등등.. 프라이머도 매뉴얼로 계산해서 더블체크 했기 때문에 괜찮은 것 같습니다.. 25~27mer 에 78 도 이상..다만 transformation 에서는 키트 제공 strain을 사용하지 않고 oneshot-stbl3 / top10 을 교대로 사용하여 transformation 하였습니다. 50ul reaction 중에서 5ul ~ 10ul dpnI 처리된 DNA을 50ul comp cell 에 transformation 하였고, 결과는.... 콜로니가 전혀 나타나지 않고 있습니다.아직 셋업이 아직 완료가 안되어서 gel 을 내려서 reaction 상태를 보고 싶은데,  교수님께서 물려받은 공간에 etbr gel 시스템 밖에 없어서 그냥 이 과정은 사이버세이프가 올 떄까지 넘어가자고 하셨습니다. 그래서 약간 주먹국구식으로 하고 있긴 한데, 사실 dpnI 처리 후 그냥 transform 하는 경우가 많아서 별로 중요하게 여기지 않았는데, 콜로니가 하나도 생기지 않으니 해야 한다고 생각이 드네요...말이 길었는데, 선배님들께 여쭤보고 싶은 질문은 다음과 같습니다.1. 10kb 정도의 SDM 에 quikchange ii 와 ii XL 의 효율 차이가 큰지, 지금이라도 빨리 새로 xl 을 주문하는게 나을지 .. (혹은 lightening 을 사버릴까..) 돈이 돈인지라, 로테이션 학생이 함부로 material 을 구매하는게 눈치가 보입니다. ㅜㅜ2. quikchange reagent 사용시, 보통 50ul reaction이 제시되어 있는데, 제가 중국인 포닥 분께 처음 sdm 을 배웠을 때는, 20ul reaction으로 scale down 해서 하더라구요. 저는 그 스케일로 겁이 나서 하지 않았지만, 혹시 reagent 아끼시려고, 그렇게들 많이 쓰시는지 궁금합니다. 조심히 실험하는 대신 아껴 쓸 수 있다면 하는게 좋을 것 같습니다. 3. transformation 하실 떄, comp cell volume 과 dna volume 을 10:1 ~ 20:1 정도로 하는걸로 알고 따르고 있는데 5:1 도 괜찮나요? 선배님들 경험상 이게 중요한 스텝인가요?4. 보통 comp cell 주문해서 쓰시나요 만들어서 쓰시나요. 실패를 많이 할 거 같은데 커머셜 comp cell 들을 뭉텅뭉텅 낭비하니깐 다른 방법이 있따면 찾아야 할 것 같아요.5, (논외) Stbl3 strain이 보통 lb 에서 잘 안자라는 것 같은데, low salt나 2x LB로 키우면 잘 자랄까요?5ml  miniprep 으로 16hr culture시 100ug/ul 나옵니다..(먼산..)아 정말 로테이션 들어가는 곳마다 dna work으로 스트레스 너무 많이 받네요ㅎㅎㅎ이런 시행착오는 평범한 거겠죠..? 아무튼 답변 해주시면 정말 감사드리겠습니다.좋은 하루 되세요

 제가 클로닝을 진행하고 있는데vector map에서 MCS(Multicloning site)와 CRE(derived from bacteriophage1)의 차이점에 대해 궁금합니다.MCS의 경우 처리할 수 있는 제한효소의 site가 연속적으로 존재하는 것을 알고 있지만 CRE의 경우 처리할 수 있는 제한효소의 site가 MCS에 비해 떨어져 있는것을 vector map으로 확인 할 수 있었습니다.CRE의 경우 Gene expression을 조절한다고 적혀있었는데 어떠한 방식으로 조절하는지 궁금하며MCS와 CRE를 이용하였을 때 각각에 대한 이점에 대해 궁금합니다.혹은 pTAT-cre vector를 통해 클로닝을 진행 하신분 있으시면 알려주세요.

QuickChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies; #200524)를 이용하여 point-mutation을 실험하고 있는 대학원 생입니다. Transformation 이후부터 진전이 없어 질문올립니다.Point-mutation을 줄 DNA size는 약 6.1kb입니다.point-mutation을 줄 site는5’-GGGAGGTCTATATAAGCAG'A'GCTCTCTGGCTAACTAGAG-3’빨간색으로 표시된 부분에서도 'A' → 'G'로 바꾸려 합니다.따라서 제가 제작한 primer는 sense와 antisense모두 mismatch primer로 제작하였고Sense primer: 5’- GGGAGGTCTATATAAGCAGGGCTCTCTGGCTAACTAGAG-3’Antisense primer: 5’-CTCTAGTTAGCCAGAGAGCCCTGCTTATATAGACCTCCC-3’Length: 39bp, % GC: 51.2%, T_m: 64.37℃위와 같이 제작하였습니다.위 Primer와 template(50ng)을 이용하여 PCR을 진행하였는데 PCR조건은denaturation: 95℃(30sec), annealing: 55℃(1min), extension: 68℃(7min) 으로 12cycle을 하였습니다.Datasheet에서는 필요하다면 PCR후 전기영동으로 밴드를 확인하라 하여 밴드를 보았더니 Control군(kit에 들어있는 제품)은 밴드가 잘 잡히는 반면 실험군에서는 밴드가 보이지 않습니다. 그러나 datasheet에서 밴드가 보일수도 안보일수도 있으니 다음과정으로 넘어가라 하여 DpnⅠ 처리후 XL-1 Blue Supercompetent cell에 4㎕를 Transformation 하였습니다.Transformation 과정은4㎕ 분주 후 Ice에서 30min incubation하였고 이후 42℃, 45sec heatshock을 주었습니다. 다음에 NYZ+ Broth 500㎕를 더 넣어주고 37℃, 225rpm, 1H Shaking incubation 하였습니다.shaking incubation 후 amp+ plate(100㎍/ml)에 250㎕씩 분주하여 spreading 하였습니다.spreading 후 37℃ incubator에서 16H간 incubation 하였는데 문제는 colony가 뜨지 않는다는 것입니다....1) PCR을 했는데 밴드가 안 보일 수 있나요...? Cycle수를 높여도 밴드는 보이지 않았습니다.2) control군에서는 colony가 뜨는데 실험군에서는 colony가 뜨지 않습니다.저는 datasheet에서 하라는대로 다 했는데 안뜨니 너무 고민입니다..아시는분은 도와주세요.

 DNA 에 oxidation이 생기면 질병이 생길수 있다는 사실에 기초하여 뉴클라아제로 그것을 디텍팅하여 자르고 자른 단편을 gel assay로 확인하려합니다.사실 oxidation을 먼저 타겟팅하고 다른 single base mutation도 타겟팅하려합니다. 근데 DNA에 oxidation이 생긴다는 사실은 나와있지만 그걸 타겟팅하는 enzyme에 대해서는 나와있는게 없는지 제가 못찾은건지 모르겠네요ㅠCEL1 nuclease가 mutation을 specific하게 타겟팅한다는 논문을 봤지만 찾는 사람이 없어 파는 회사가 많이 없네요ㅠ 구할수 있는 회사를 아시는분계시면 정보좀 주세요!또하나 CEL1이나 surveyor nuclease를 처리할 때 PCR을 왜하는지 설명좀 해주실수 있나요ㅠㅠ학부전공이 생물관련학과가 아닌상태에서 대학원을 생명과학으로 와서 너무 버겁네요ㅠ

Takara 진균용 DNA 추출 세균용 DNA 추출용 각 시약의 효과나 과정 설명 부탁드려요~

 안녕하세요!혹시 minicircle을 생산해 보신 분들 중에, gDNA와 PP 오염 없이 깔끔하게 minicircle만 만들어 보신분이 계신가요? 프로토콜상에 보면 gDNA와 PP의 오염은 흔히 발생할 수 있다고는 하는데,프로토콜 조건도 약간씩 바꿔가며 해봐도 오염이 없어지질 않아서요.보통 midiprep으로 정제하는데, miniprep할 때는 gDNA의 오염 없이 PP만 오염되어 있는 경우가대부분이고, midiprep할 때는 gDNA와 PP 둘 다 오염된 경우가 대부분입니다.midiprep 문제는 아닌게 다른 plasmid 뽑을 땐 gDNA 오염 없이 잘만 되구요.물론 키트에 PP, gDNA 제거 과정이 있긴 하지만 그 과정에 쓰이는 제품들이 꽤나 비싸서왠만하면 사용하고 싶지 않은데, 그걸 사용하는 수 밖에 없을까요?minicircle production 깔끔하게 성공해 보신 분 계시다면 답변 부탁드립니다!!

 안녕하세요. DNA mutation관련 질문드립니다.특정 enzyme에서 활성과 관련된 아미노산을 찾기위해 random mutagenesis를 하려고합니다.문제는 이 enzyme이 두개의 도매인 AB으로 이루어진 enzyme일때, A도메인에만 돌연변이를 일으키고 싶습니다. 일반적인 random mutagenesis를 진행하면 AB 또는 B영역에 돌연변이도 포함하기 때문에 이 경우 사용할 수 있는 방법이 있을까요? 그리고 컴퓨터프로그램이나 서버를 이용한 예측방법중 추천할만한 것이있다면 추천해주세요.

일단 NHS/EDC가 어떻게 돌아가는지 원리는 알 것 같습니다. 그런데 제가 실험하고자 하는 대상이 Amino-modified oligonucleotide(C6, 5')인데... 프로토콜은 죄다 단백질 관련이네요... (아직 어디다가 conjugation하는지 제대로 나오지는 않았는데, 단백질에 붙이는 건 아닙니다. 아마 polymer에 부착할 듯 합니다) 그래서 몇가지 여쭙고자 합니다. 1. amine기가 붙은 oligonucleotide를 conjugation할 때는 pH를 8.5~9.5 사이로 유지한다는데, NHS/EDC 반응을 진행할 때도 마찬가지인가요? pH를 이렇게 유지하는 이유가 free aliphatic amine이 pH 8이하가 되면 농다가 낮아지기 떄문이라고 합니다. 2. oligonucleotide의 backbone에 있는 phosphate가 반응에 영향을 주지는 않는지요? 3. activation은 EDC/NHS를 처리하기 전에 따로 진행해주는 건가요? 아니면 NHS/EDC를 넣으면서 activation이 되는 건가요? 4. pH를 8.5~9.5 사이로 유지한다는 것 외에 다른 주의사항이 있나요? (예 : 처리 후 시료는 반드시 냉장보관을 해야 한다)

 이제 막 DNA 연구를 진행중인 학생입니다.여러모로 모르는 부분이 많은데, 질문이 있습니다.약 30bp의 길이를 갖는DNA duplex가 single mismatch를 가질때 잘라내는 제한효소가 존재하나요?여러 제한효소를 찾아보아도 sequence에 따라 잘라내는 제한 효소는 존재하지만, DNA의 single mismatch를 찾아서 잘라내는 효소는 잘 나오지않더라구요혹시 그림에서와 같은 방식으로 잘라내는 효소가 존재한다면 그 명칭이 뭔지, 사용법이 어떻게 되는지 한가지라도 알려주시면 감사하겠습니다.

안녕하세요 제목내용처럼 bacteria의 특정 gene의 sequence에 mutation을 일으키는데에는 어떤 방법이 가장 많이 사용되고 있는지 알고 싶어서 질문드립니다.저는 현재 gene bridge라는 회사에서 나온 kit를 사용중인데 이 kit는 deletion만 될 뿐 아니라, mutation을 시키면 deletion하고 남은 자리에 kit 관련된 몇십개의 nucleotide가 잔류하게 됩니다.virus를 mutagenesis 하는 것 처럼 깔끔하게 point mutation을 일으킬 수 있는 방법은 어떤것이 있을까요?설명해주시기 귀찮으시면 검색할 수 있게 키워드라도 남겨주시면 정말 감사하겠습니다.

안녕하세요. mtDNA에 대해 여쭤보려고 합니다.두 근연종의 mtDNA를 비교해보려고 합니다.지놈 시퀀싱이나 CDS데이터베이스가 없어도 두 종의 mtDNA를 추출한 후 대조하는 것이 가능할까요?

안중근장군님의 사망년도가 107년째입니다현재 시신발굴진행 중이죠그런데 목관을 하여 오랜세월속에 풍화되어시각적 흙으로 변했으리라 짐작해 봅니다여기서 흙으로 변해 있다는 가정으로채취가 된다면 DNA분석이 가능한가요..?

안녕하세요 짐서방입니다.제가 100bp짜리 유전자를 가지고 있는데요5'말단에 10A (AAA AAA AAA A)를 더 추가 하고자 합니다총 110bp짜리 유전자가 되는것죠그래서 For. Primer (20mer)짜리에 10A를 5'쪽에 같이 합성해서30mer 짜리 10A primer와 20mer 짜리 Rev. primer를 사용해서 PCR을 해보니 결과가 나타나질 않습니다.합성을 하자니 너무 비싸서 PCR로 해결해 보고자 합니다.고수님들의 좋은 방법 있으시면,, 알려주십시요혹시 1차로 23mer 짜리 (3A) For. primer를 사용해서 PCR하고 정제한 후2차로 26mer 짜리 (6A) For. primer를 사용해서 PCR하고 정제한 후3차로 30mer 짜리 (10A) For. primer를 사용해서 PCR하면 가능 할까요?아님 A가 늘어나는 만큼 Tm값을 계산해서 3'쪽에서 삭제하면 primer를 디자인해야 할까요?아이디어 좀 주세요~~

PCR을 통한 point-mutation 진행하고 있습니다.대략 3kb 정도의 target 유전자의 2267에 위치한 DNA sequence 하나를 변경하고자 해서1차 PCR로 두 가지 template 확보하여 2차 PCR 진행하였습니다.2차 PCR은 두 template의 retio를 length에 따라 조절해서1번 template은 2.2 kb,  2번 template은 791 bp여서 대략 3:1 비율로 맞추어서1번 3ng/ul, 2번 1ng/ul로 dilution하여 1ul씩 PCR에 사용하였으며,PCR cycle은 25 cycle로 진행하였습니다.그런데, PCR product 농도가 너무 낮아서 gel extraction 후,DNA 확보하기가 너무 힘이 드네요.PCR에 사용한 polymerase는 pfu입니다. (PCR때, 3kb라서 6 min했습니다.)처음에 T vector cloning 진행하려고 1차 PCR은 pfu, 2차PCR은 taq으로 PCR 했을때,그나마 DNA 확보할 정도 나와서 t vector cloning해서 sequencing 해보니 target 유전자 일부만 일치하고, mutation 주고자한 sequence가 변경되지 않고 그대로여서taq에서 pfu로 바꿔서 진행하였더니,이번에는 mutated template을 확보하는데 PCR product 양이 너무 적네요.제가 PCR point mutation 실험을 잘못 진행하고 있는지, protocol 공유나 도움 부탁드립니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ혹은 point mutation kit 추천 부탁드립니다.