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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA
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Q. ampicillin배지에 transformation cell을 키웠는데 satelite가 많이 나와요...
전기천공법으로  plasmid를 transformation하고 다음 날 확인했는데, 크고 하얀 콜로니 주변으로 자잘한 콜로니들이 에워싸듯이 몰려있거나 아예 하얀 콜로니들을 뒤덮고 있었습니다. 지금 저 이상한(?) 콜로니들을 새로 만든 amp 배지에 streaking 하면 순수한 transformant만 얻을 수 있을까요? 아니면 다시 transformation부터 다시 진행해야 할까요? *배지는 알아보니 만든지 좀 되었더군요... 일단 저도 앞으로 쓸 일이 있을거 같긴 해서 새로 만들었습니다.    
회원작성글 란란루  |  2022.11.24
Q. Transformation bead
Transformation 할 때 bead로 굴려서 spreading 하는데 이때 노하우가 있을까요? colony가 자꾸 잘 안떠서... shaking하다가 cell들이 많이 죽을 수 있는지, 어느정도 해야될지 감이 잘 안잡혀서 도움 요청합니다..
회원작성글 쪼꼬만먼지  |  2022.11.24
Q. Site-directed mutagenesis 안되는 이유..
  안녕하세요.. 현재 Site-directed mutagenesis를 하고있는데 colony가 안떠서 난항을 겪고 있습니다..   vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고, primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.   snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것입니다.    Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 한다는데.. 무튼 protocol은 다음과 같이 하였습니다..   PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 200ng PCR cycle :    95°C 30s 95°C 30s 55°C 60s 68°C 2:30s (1kb/30s로 조금 넉넉하게 줬습니다.) step 2부터 X 18  68°C 13:00   PCR이 완료되면, 바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation    그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 40min 돟안 shaking incubation   마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading       제가 예~전에 해당 protocol로 했을 때는 잘 했었던것 같은데, 그때랑 달라진건 polymerase 종류 (회사) 정도? 그래서 사실 high fidelity Pfu 다른 회사 2종류로 test 해봤는데도 역시 안뜨더군요..   무엇이 문제일까요...   선생님들의 지식을 조금만 나누어주시면 감사드리겠습니다.. ㅠㅠ
회원작성글 neuronal p..  |  2022.11.24
Q. assembly PCR
안녕하세요 assembly PCR이 너무 안되어 질문 올려봅니다... 두 gene을 10cycles을 돌려 assembled fragment를 확보하고(gel extration도 이용해봄) 다시 primer를 넣어 amplify를 시도하는데 계속해서 원래 두 개의 gene이 분리되어 나옵니다.. method의 문제로 일어나는 일 일까요?  첫번째 사진이 10cycles 후 사진이고, 두번째는 첫번째의 네모박스 사이즈의 dna를 gel extraction으로 분리 후 primer와 함께 amplify 한 사진입니다      
회원작성글 CYS  |  2022.11.24
Q. cDNA 합성에서 헷갈리는 부분이 있습니다.
RNA template에서 oligo dT나 random hexamer와 Reverse transcriptase를 사용해서 RNA-DNA helix를 생성하고 RNase H를 사용해서 RNA만을 분해한 다음(ssDNA만 남고), DNA polymerase로 dsDNA로 합성해준다고 알고 있습니다. 그런데 여러 회사에서 파는 cDNA 합성 kit에는 왜 DNA polymerase가 없는 건가요? 그냥 RNA-DNA helix를 PCR에 사용하는 건가요?   그리고 저희 실험실에서는 Bio-RAD의 iScript cDNA synthesis kit를 사용하는데, 여기서 제공되는 RT는 RNase H+라고 하더군요 근데 RNase H는 RNA를 분해한다고 하는데, 그럼 최종 합성 prouct가 sscDNA로 남는걸까요?  
회원작성글 ziiion  |  2022.11.23
Q. 전기연동 결과 한번 봐주세요 첨부파일
전기연동 실험을 진행했는데 결과해석부탁드립니다 ㅠ 혹시 실패한것이라면 요인은 무엇이 있을까요?
회원작성글 삐입삐  |  2022.11.23
Q. Adeno associated virus의 episome 형성
Adeno associated virus에 대해 공부하고 있습니다. 해당 Adeno associated virus plasmid의 transgene이 숙주 세포의 염색체에 통합되지 않고 episome을 형성 하는건 이해가 가는데 세포가 분열하면서 transgene의 발현이 줄어들고 발현이 감소되는데 이게 왜 유전자 치료 분야에 이상적인지 이해가 잘 가지 않습니다.   어쨌든 외부에서 들어온 transgene이 계속 발현되서 mutation이 일어날 수도 있기 때문에 발현이 점점 줄어 드는게 좋은건가 싶다가도 transgene이 계속 발현 되야 유전자 치료제로서 제대로 효과를 낼 수 있지 않나 싶습니다.   
회원작성글 ziiion  |  2022.11.22
Q. pfu polymerase로만 뜨면 안떠집니다
안녕하세요 현재 cloning을 하기 위해 PCR을 진행하고 있습니다. 3,600bp 정도 되는 insert를 PCR 뜨고 있는데 문제는 pfu pol이 아닌 그냥 taq pol을 써서 뜨면 잘 떠지는데 pfu pol로 뜨는 순간 바로 밴드가 안뜨더라구요.. 아무래도 3.6kb 정도 되는 insert를 따다 보니 막택으로 뜨면 잘 떠지더라도 sequencing을 해보면 point mutation이나 deletion이 되어 있더라구요.. 그래서 pfu pol로 뜨고 싶은데 같은 회사 polymerase라도 pfu냐 taq이냐 에 따라 안떠지는데 이럴 땐 어떻게 해야하나요ㅠㅠ
회원작성글 파채부락리  |  2022.11.22
Q. HXT5에 대한 real time PCR을 진행할 경우,,? 궁금한거 있습니다ㅠㅠ
SCR1, TKL2, REI1에 대한 cDNA를 합성하였다고 가정하였을때 만약 전혀 다른 유전자인 ‘HXT5’에 대한 real time PCR을 진행할 경우에는 어떤 실험결과가 나올지 분석하려고 하는데,,, 여기서 궁금한게 앞서 합성한 SCR1, TKL2, REI1유전자는 HXT5 유전자의 RT PCR 결과와는 완전 무관한거 아닌가요??ㅠㅠ 그냥 독립적으로 HXT5 유전자에 RTPCR결과만 놓고 보면 되는거죠??   
회원작성글 갈색솜뭉치  |  2022.11.21
Q. gene expression (KO/OE) 를 확인할때 CRISPR 로 해도 괜찮나요? cDNA sequence insertion 으로만해야 하나요?
gene level에서 특정 유전자의 overexpression 과 knock-out 된 세포주의 effect 를 비교 분석하고자 합니다. gene level에서 특이 유전자를 overexpression 또는 knock-out을 시키켜 효과를 비교하려면, CRISPR/Cas9 system 으로 해도 문제 없을까요? 염두해야할 주의사항 이나 limitation은 어떤게 있을까요? 아니면 기존의 cDNA sequence insertion (vector) 으로만 하는게 좋을까요? 도움을 주시면 너무 감사하겠습니다 ㅠㅠ
회원작성글 alucion  |  2022.11.21
Q. 전기영동 gDNA
구강상피세포를 kit로 추출해 1.2% agarose gel에 135v 20분 Dna농도를 뒤로 갈수록 많아지도록 내렸습니다. 로딩샘플을 만들면서도 확인하고 겔에 넣기 전에도 다시 확인하면서 로딩했는데 3번이나 결과가 이상합니다. Ratio 값이 1.9인 것과 1.8인 차이에 의해서 일어날 수 있는 일인가요? 5번째보다 6번째 well에 더 많은 양의 gDNA를 넣었는데 왜 5번째가 더 밝게 보일까요…
회원작성글 631  |  2022.11.21
Q. Pcr 안될때 workflow
대부분 rt pcr 이나 pcr을 할때 사실 저는 primer tm값이나 cycle 조건을 따지지 않고 annealing 58도 30초 72도 30초 이렇게 35cycle 로 돌려버리는 편이고 Bioneer accupower premix 로 우선 돌려봤다가 안나오면 phusion plus 로 해보면 왠만하면 나오더군요 근데 문제는 저렇게 해서 안나오는거는 뭐부터 바꿔야되는지 앞이 안보이더군요 그래서 혹시 pcr 이 안될때 어떤 workflow 를 가지고 실험을 하시는지 궁금하고 또한, 자주쓰는 polymer 나 회사 같은거 추천해주시면 고맙겠습니다
회원작성글 오미자랩  |  2022.11.21
Q. fusion protein 질문
fusion protein 이 어떤 원리로 어떤 작용을 하는지 쉽게 알수있을까요?
회원작성글 얼마안남았다  |  2022.11.20
Q. 동물세포DNA를 e.coli로 cloning하기
말그대로 동물세포의 DNA를 E.coli로 transformation? transcription? 싶은데 intron을 어떻게 제거해야하나요?   RNA 중합효소와 역전사 효소를 동시에 넣고 반응시킨 후 gel puri하면 exon만 있는 DNA를 얻을 수 있을까요?
회원작성글 SHY  |  2022.11.18
Q. Theta replication 원리
Theta replication에 대한 기본적인 개념 혹시 설명해주실 수 있을까요? 논문을 찾아봐도 정확하게 나오지않는데.. rolling circle mechanism보다 좀더 stable하다 정도...
회원작성글 오월준  |  2022.11.18
Q. Transformation 계산 방법이 잘 이해가 안됩니다.
안녕하세요. Bacterial transformation 실험에 주력하고 있는 학부생연구원입니다. Transformation efficiency를 다른 논문에서 참고해서 계산을 하려고 하다보니, 대부분의 논문이 CFU/ug를 단위로 쓰더라고요. 이 단위의 뜻이 주어진 양의 competent cell에 DNA 1ug을 transformation 했을 때 생성되는 colony의 수라고 하는데, 다른 분의 의견으로는 Transformation efficiency면 사용된 competent cell의 전체 수에서 transformation된 세포의 수를 말하는 것이니까 transformation 후 spreading할 때 한 샘플을 selective plate와 항생제 없는 배지에 따로 키워서 항생제가 있는 배지에서 자란 콜로니 수를 항생제 없는 배지에서 자란 콜로니 수로 나눠야하는 것 아니냐는데, 그 말도 맞는 것 같아서요. 사실 transformatinon efficiency 정의를 봤을 때 잘 이해가 안되기도 하고요. 혹시 이것과 관련해서 이 공식이 어떻게 transformation efficiency를 설명하는 것인지.. 왜 CFU/ug을 unit으로 쓰는지 알려주실 분 계실까요?ㅜㅜ
회원작성글 dndb1303  |  2022.11.18
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