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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA
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Q. fragment ligation후 vector에 cloning
선배가 준 vector가 있는데 vector MCS 어느 위치에 넣었는지 모르겠습니다. insert는 fragment 두개라서 gene 합성을해서 각각 만든 뒤 ligation하였다고 들었습니다. 그런데 insert sequence를 보면 양쪽 말단에 enzyme site가 없습니다. 이런 경우 어떤 방법으로 cloning을 한 것일까요? 업체에 의뢰하여 진행한 것일까요?
회원작성글 새로운  |  07.21
Q. 같은 조건에서 realtime pcr 증폭 결과가 계속 바뀌어요
같은 mixture 조건으로 벌크를 만들어서 25ul씩 넣어서 증폭을 하는데 4반복하면 2개는 증폭이 되고 1개는 10~20분 지연되어서 증폭되고 1개는 증폭이 안돼요 다시 해봐도 몇개는 증폭이 되고 몇개는 안되는게 자꾸 반복돼요. 따로 만든것도 아니고 한번에 만든 mixture에서 이럴수가 있나요? 차라리 증폭이 전부 안되면 mixture를 잘못 만들었구나생각할텐데 결과가 자꾸 흔들리니 의문이네요
회원작성글 레뚜로  |  07.20
Q. 아미노산의 polarity를 볼 수 있는 프로그램이나 사이트 알고계신분 있으실까요??
Cloning한 insert 중 염기 하나가 mutation일어나서 아미노산이 바꼈습니다.(Glutamic acid -> Glycine) 아미노산의 polarity를 볼 수 있는 프로그램이나 사이트 알고계신분 있으실까요??
회원작성글 앨  |  07.20
Q. cDNA RT-PCR 시 희석하면 안되나요?
(나와야하는데) 아무리 해도 안나오는 밴드가 있어서 다른 선생님께 조언을 구했더니 희석하지말고 써보라고 하셔서 그때부터 항상 그렇게 쓰고 있는데 (물론 안나왔습니다.. 프라이머 문제) 그렇게 쓰자고하니 매번 볼륨이 너무 많이 들어가서요.. 25ul cDNA 합성하면 1,000 ng 내외로 나오는데, 여기서 1ul 따서 넣는 것도 말하자면 전체 rx. 볼륨으로 봐선 희석돼서 들어가는 건데.. 어떤 차이인지 궁금하네요..
회원작성글 Crufus  |  07.20
Q. Real-time qPCR 분석 문의 (FAM, TAMRA...)
안녕하세요, Real-time qPCR 기기를 구매하려고 이리저리 살펴보다 잘 모르는 부분이 있어 고수님들의 고견을 구하고자 글 남깁니다. 제가 주로 활용하려는 방법은 Taqman probe assay로 real-time qPCR 분석을 수행하고자 하며, 사용하는 probe는 FAM(Reporter dye)/TAMRA(Quencher)입니다. 이에 맞는 qPCR 기기들을 살펴보다 보니 FAM 까지만 detect되고, TAMRA는 detect 안되는, 하지만 가격이 상대적으로 착한 보급형 기기들도 있더라구요!  Reporter dye로 FAM을 사용하고 Quencher로 TAMRA로 사용하는 probe의 경우, FAM과 TAMRA 모두 detect가 가능한 qPCR 기기를 사용해야 하는지, 아니면 FAM만 detect되는 qPCR 기기를 사용해도 무방할지 애매하여 문의드립니다. 혹시 아시는 분 있으시면 가르침을 구합니다. 감사합니다~
회원작성글 EBEL  |  07.19
Q. plasmid prep 후 농도와 plasmid band 패턴이 관련이 있을까요?
안녕하세요! 이상한 plasmid로 인해 실험에 차질이 생겨 조언을 얻고자 질문 올립니다.  plasmid prep 후에 nano drop으로 측정한 농도가 일반적인 sample의 1/10 이상 낮게 나왔습니다. (일반적으로 적어도 100ng/ul 이상은 나오는데 10ng/ul대입니다) 그래서 1% agarose gel에 plasmid를 걸어보니 supercoil form과 linear form으로 추측되는 band, 이 2개 band가 거의 비슷한 진하기로 나오더라구요. 제한효소 처리하였을 때는 깔끔하게 잘 잘리구요! 제한효소 처리해서 괜찮으면 어떤 form이든 plasmid를 사용하는 데 있어서 문제가 되진 않는다는 의견을 봤는데요, 제 경우에는 plasmid 농도가 너무 낮게 나와서 실험에 이용하기가 힘듭니다ㅠㅠ  다른 sample과 함께 prep을 진행하였는데 항상 이 sample 하나만 이러한 결과가 나오는 걸로 봐서는 prep 과정의 문제는 아닌 것 같습니다. 그리고 이 sample도 수율이 높았던 적이 있었는데 그 때의 plasmid를 gel에 걸어보니 지금 수율이 낮게 나오는 것과 전혀 band 패턴이 다르더라구요. supercoil form이 가장 많은 일반적인 plasmid band 패턴이었습니다! 수율이 낮은 것과 plasmid band 패턴이 이상한 것이 관련이 있을까요? 아무리 서치해봐도 속시원한 답이 나오지 않네요,, 혹시 이런 경우가 있었던 분이 계시다면 조언 부탁드립니다..!
회원작성글 소람  |  07.19
Q. single fly pcr할 때 gDNA 농도가 낮아요
안녕하세요 저는 초파리를 모델동물로 연구하고 있는 대학원생입니다. single fly pcr을 하려고 하는데, OR로 gDNA를 뽑으면 농도가 대략 1000ng/ul 정도 나오는데요, 실제로 실험에 사용할 233 {nos-cas9-mSA, Pax-GFP} attp40 초파리 라인을 한마리씩 뽑으면 농도가 200ng으로 나와요.  인젝션 보내고 제가 찾는 라인 screening 할때 한 마리씩 single fly pcr하려고 하는데, 농도가 낮으니까 pcr도 잘 밴드가 안 뜹니다. 원래 single fly pcr방법으로 gDNA 뽑을 때 초파리 라인 마다 농도가 다른가요?? 제가 사용하는 방법은 1X SB buffer를 30ul넣고 호모게나이저로 약 2분간 갈고 37도에서 30분간 incubation 시키고 95도에서 5분간 둔 후에 최고 스피드로 원심분리하고 바로 얼음에 꽂아서 농도 측정 후 pcr하는 것으로 하고 있습니다.   혹시 single fly pcr할 때 gDNA 뽑는 다른 방법이나 제 방법에서 고칠 점이 있을까요?
회원작성글 bioer  |  07.18
Q. Fluidigm 실험에서 STA primer, LSP primer 이 뭔지, 어떻게 만드는지 등이 궁금합니다.
Fluidigm 실험을 하려는 대학원생입니다.  플루다임에 대해 공부를 하고 있습니다.  Fluidigm 실험에서 STA primer, LSP primer 이 뭔지, 어떻게 만드는지 등이 궁금합니다.
회원작성글 원작생실이  |  07.15
Q. DNA추출방법
DNA 추출방법 중에 헷갈리는 부분이 있어 문의 드립니다. Lysis buffer (5mM EDTA, 200mM NaCl , 100mM tris-cl, 0.4% SDS) 1. Lysisbuffer 400ul protinase k 10ul 60도시 O/N 2. 3M potassium acetate 40ul 추가 3. Penol/chloroform/iso-amy alcohol 400ul 넣음 4. Centrifuge 13000RPM 15분 후 상층액 200ul 추출 5. 100% EtOH 500ul 넣음 6. Centrifuge 13000rpm 15분 상층액 버린고 pellet만 남김 7. 70%EtOH 800ul 넣고 centrifuge 13000rpm 15분 상층액 버리고 pellet만 남김 8. Air dye 10분 9. ddH2O , TEbuffer 20-50ul 넣고 4도시에 녹인다. 이방법으로 사용하고 싶은데요 질문은 1. 3M photassium acetate 만들때 ( MW 98.14)100ml 만들때 29.442g 넣으면 되는게 맞는지 2. Penol/chloroform/iso-amy alcohol 이 없을때 그냥 chloroform 이용해도 가능한지 궁금합니다. 아직 많이 부족하여 여쭈어 봅니다.
회원작성글 초코파티  |  07.15
Q. dna extraction이후, 농도 맞추기
안녕하세요 dna extraction이후 농도가 84.4ng / ul이 나왔는데 이것을 100ng / ul로 맞춰야 합니다( 원하는 총 volume은 100ul라고 할 때에) 이럴 경우 100/84.4를 하면 1.2가 나오니까 1.2ul 를 따고, 100-1.2한 98.2를 buffer로 채워주면 되는걸까요 ? 제가 전공자가 아니라 잘 몰라서요.. 이게 맞는지, 그리고 다른 방법이 있다면 말씀해주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 루알  |  07.14
Q. qPCR진행시 PRIMER타려하는데 계산 확인좀요!
qPCR에 사용하는 PRIMER타려고 하는데 100pmol짜리를 5pmol로 타려면 1/20로 타면 돼요? 100pmol시약이랑 M.D.W랑 섞으면 되나요?
회원작성글 iceage  |  07.14
Q. 절대정량 qPCR standard curve의 acceptable한 기준은 어떻게 되나요 ??
 더운 날씨에 다들 고생많으십니다.   항상 실험실 선배님들이 만들어 놓은 primer에 대한 qPCR 절대정량 standard curve를 사용하다가 이번에 새롭게 primer를 짜서 SYBR green을 사용해서 standard curve를 만드는 중에 있습니다.   여러가지 조건을 변경해보아도 새로운 프라이머를 짜보아도, qPCR 효율이 80% 정도에서 크게 변동되질 않더라구요.. error 값도 0.025정도 나오구요..대신 melting peak는 이쁘게 잘 잡힙니다. (Roche LC480장비 사용중입니다.)  qPCR 조건잡기가 생각보다 힘든 것을 몸소 느끼는 중입니다... 그러다보니 그냥 이 결과 값으로 실험을 진행하면 안될까..? 하는 생각이 들어서요...  검색해보면 acceptable한 qPCR 효율은 90~110%정도 되고 R2값은 0.98보다는 높은게 좋다고는 하더라고요..     80% ~ 100% 정도 되는 효율의 qPCR 결과와 0.97~0.99사이의 R2 값을 가진 standard curve로는 데이터 제시에 무리가 있을까요??   추가적으로 물론 3반복이면 좋겠지만... 2반복으로 그려진 standard curve도 acceptable 할까요...?   애써서 분석 다 해놨는데 이런 부분 때문에 나중에 논문 쓸때 문제되진 않을까 싶어서 질문드립니다...   긴 글 읽어주셔서 감사합니다. 답변 가능하시면 답변 해주시면 감사하겠습니다 ㅠ_ㅠ 
회원작성글 Anchovy  |  07.14
Q. 오래된 mgcl2 수분 흡수
랩실에 conical tube에 담겨진 mgcl2가 가루가 있는데, 물을 많이 흡수한것처럼 끈적거립니다. 그리고 무게를 측정할때도 힘듭니다. 원래 mgcl2가 쉽게 물을 흡수해서 끈적거리나요? 이런 상태면 사용하지 말아야 할까요 아니면 괜찮을까요
회원작성글 오르골  |  07.13
Q. pvp와 pvp40 농도 변환
초보 대학원생입니다   dna 추출 버퍼를 만들고 있습니다. 참고하는 논문에서 100ml 버퍼를 만들때 PVP-40 1%를 만들기 위해서 pvp-40 1g을 넣었습니다. 랩실에서 가지고 있는건 PVP와 PVP-10입니다,   분자량이 PVP=360,000 PVP10=10,000 PVP40=40,000인걸 알고 있습니다.   PVP40 1g을 대체해서 PVP를 0.11g을 넣으면 될까요? (분자량 360,000*0.11=약 40,000)   아니면 몰농도를 생각해서 PVP 9g을 넣으면 될까요? (1/40,000=A/360,000   -> A=9)
회원작성글 오르골  |  07.13
Q. 제한효소 인서트 분실
안녕하세요. gene cloning을 위해 실험을 하고 있는 학생입니다. 현재 vector, insert 1은 준비가 되었는데, insert 2가 제한효소 처리만 하면 사라져서 여쭤보고 싶습니다. insert 2는 플라스미드를 pcr 한 dna로 insert 1과 size도 비슷합니다. 또한 pcr 프로덕트를 gel elution한 후 nano drop하면 분명히 존재하고, 순도 또한 insert 1과 크게 차이나지 않는데 제한효소 처리만 하면 smear조차 나타나지 않고 아예 검은 구멍으로 나타납니다... 사용한 dna 분량은 1ug으로, 일단 내일은 2ug으로 늘려 사용해보려고 합니다. 혹시 추가적으로 조작해보면 좋을 조건이 있을까요?
회원작성글 qkqh1  |  07.13
Q. Human genome sequencing 관련 질문합니다.
시퀀싱에 대해 관심을 가지고 공부를 해보던 중 궁금한 점이 있어 질문을 드립니다. Whole Genome Sequencing으로 약 3 Gb에 달하는 인간의 유전자도 분석해주고 있다고 알고 있습니다. 이 때 생식세포가 아닌 체세포에서는 염색체가 diploid로 존재하며 총 6 Gb의 genome이 있고, 한 유전자에 대해 쌍으로 대립유전자가 존재할텐데, sequencing 결과는 어떻게 3 Gb의 haploid 형태(?)로 나오는 것일까요? 지식이 부족하여 검색해도 잘 찾지 못하겠습니다. 고견 부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 deepce  |  07.13
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