저희 연구실에서 no assay 실험을 할때 con,lps,dexamethasone,l-name 으로 하는 이유가 무엇인가요? macrophage의 활성도를 확인할 때 no가 분출되어 no의 양을 확인하는 것과 관련이 있는지 궁금합니다.

  20kDa 12% gel로 detection한 membrane 인데요,, 이게 옆으로 쭉 끌려서 디텍션이 되었습니다 ㅜㅜ 2번 했는데도 2번 다 똑같이 나왔어요 ,, 이 부분 어떻게 해결하면 좋을까요 ,,? SDS 내릴 때, 바닥까지 끌지 말고 20kDa marker가 2/3쯤 내려왔을 때 스탑하고 다음단계 이어가면 되나요..? 답답해서 미치겠습니다 ㅜㅜ 저와 같은 경험 있으신 분 조언 주시면 감사하겠습니다!!   아 그리고 beta actin 같은 control이 일정하지가 않은데, sampling 후 voltex하고 spin down 후 heat 하고 식힌 다음 로딩을 하는데, 이 부분이 해당 결과에 많은 원인이 될 수 있을까요? (원랜 heat->볼텍싱->스핀다운->로딩 순으로 알고 있어서요!, 순서 약간의 차이가 원인이 될 수 있는지 궁금합니다!)

1: 1kb DNA Plus marker 사용 2: DNA 50ng/ul  3: DNA 10ng/ul  4: DNA 5ng/ul 5: DNA 1ng/ul   DNA는 DH5a Genomic DNA 이고  186.3ng/ul > 260/280: 1.88                    260/230: 1.06 입니다. 그래서 각각 희석했을때 50ng/ul > DNA: 2.7ul, DW: 7.3ul 10ng/ul > DNA: 1.1ul, DW: 18.9ul 5ng/ul > DNA: 0.54ul, DW: 19.46ul 1ng/ul > DNA: 1ul. DW: 185.3ul 했습니다. primer의 경우에는 primer - F : 12.1nmol. primer - R: 12.9nmol로 Primer-F 1ul + DW 121ul , Primer-R 1ul + DW 129ul로 100pmol/ul로 stock을 만든다음 다시 Primer를 5pmol/ul로 working을 만들었습니다. buffer는 2X PCR master mix를 사용했고 구성은 DW 740ul + 10Xreaction buffer 200ul + 10mM dNTPs 40ul + Tag pol (5 units/ul) 20ul을 사용했고 vortex mix와 spleen down을 해주었습니다  혹시나 해서 primer를 다시 희석하기도 했고 2X PCR master를 다시 제조해봤지만 결과가 똑같이 나왔습니다. 무엇이 문제일까요? PCR 온도 조건은 95도 : 2분 (30 cycles - 95도: 20초, 62,1도: 40초, 72도: 1분 30초), 72도: 5분으로 설정했습니다. Primer - F Tm : 67.1도 , primer - R Tm: 61.3도 이기 때문에  Annealing을 62.1도로 설정했습니다.   전기영동을 했을때 Agar gel은 1.5% 농도로 사용했습니다. 6X loding dye를 사용해서 DNA 5ul + dye 1ul을 사용했습니다.  

0.1M Na-Pi 완충 용액(pH 5.8) 50㎖, 10mM 구아이아콜, 과산화수소, 콩나물 콩에서 원심분리한 효소를 넣으면 반응이 있는건가요? 구아이아콜과 과산화수소 및 과산화효소와의 관계가 잘 정리가 안되어서 도움요청합니다.   이걸로 미카엘리스-멘텐식을 검증하고자 합니다.    

안녕하세요.  4,6-alpha-gluconotransferase라는 효소 역가 측정 중에 있는 석사생입니다. 항상 지식을 나눠주시는 모든 분들께 감사하며 오늘도 도움을 구하고자 염치 불구하고 질문을 올리게 되었습니다.   1. MC1061 competent cell에 재조합 단백질을 발현시켜서 2. sonication으로 cell lysis진행한 후 3. centri를 돌려서 상등액 부분만(제 target 단백질이 soluble합니다!)     Ni-NTA column으로 정제 및 투석 진행한 후 4. amylose resin으로 정제 후 농축, 투석을 진행하는 과정을 거쳐서 sample을 얻어냈습니다.   최종적으로 효소 역가와 단백질 양을 측정하기 위해 GOPOD assay와 bradford를 진행하는 중에 문제가 발생하여 원인을 찾고 있는 중입니다. 일단 SDS-PAGE를 통해 단백질 발현이 제대로 이루어진 것은 확인한 상태입니다. band를 보면 2번째, 5번째 lane에서 많은 양의 target 단백질이 나온 것을 확인할 수 있었습니다.   하지만 막상 효소 역가를 측정해보니 굉장히 형편없는 결과가 나왔습니다. 이전에 측정한 specific activity는 0.8~0.9U/mg이 나왔는데 이번에는 0.008로 거의 1/100로 매우 낮게 나왔습니다. SDS를 보면 발현은 잘 된 것 같고 이전이랑 실험도 동일하게 진행하였는데 역가가 낮게 나온 이유를 도무지 알기가 어려워 도움을 얻고자 질문을 하게 되었습니다.    일단 제가 생각하는 원인들을 나열해보겠습니다. 1. 단백질 발현 진행 과정에서 cell의 최적온도에서 overnight으로 cell을 키운 후에 OD값이 1.5에 도달하면 이후 단백질 발현 양으로 높이기 위해 18도에서 overnight을 진행합니다. 이때 다음날 확인해보니 OD값이 3.5 정도가 나왔습니다. 이전에는 동일 조건에서 OD값이 2.0에 가까운 초반대였던 걸 생각하면 cell 상태가 좋아서 단백질이 단순히 많이 생산되었다고 생각할 수도 있겠지만 다른 문제가 있었던 것이 아닌가 생각하게 됩니다. 2. 단백질 folding 과정에서 문제가 생겼다는 생각도 듭니다. sds-page로는 단백질을 변성시켜서 folding 여부에 상관없이 분자량으로 target 단백질이 있는지 정도만 파악하는 것으로 알고 있어서 단백질 folding이 제대로 이루어지지 않아 제대로 된 활성을 띄지 못하는 것이 아닌가 추측하고 있습니다..  3. 발현도 folding도 잘 되었는데 gopod 측정 과정에서 각 sample을 사용하기 전에 항상 강한 vortexing으로 sample 농도를 일정하게 맞춰주곤 했는데 그때마다 이제 거품이 많이 일어나는 편이었습니다. 이때 발생한 bubble들로 인해 단백질이 변성될 수도 있다고 하는데 저는 현재로써는 이것을 가장 유력하게 보고 있습니다. 실제로 같은 sample로 gopod를 여러번 진행해본 결과 할 때마다 역가가 저하되는 것을 확인할 수 있었습니다.  그런데 또 의문인 것은 물론 volume 차이가 있지만 sonciator로 cell lysis 를 진행할 때에도 거품이 적지 않게 일어났었는데 이전에는 문제가 없었다는 점입니다.   resin 상태, buffer pH, gopod 용액 상태 모두 확인해보았지만 별다른 문제를 발견하지 못했습니다.  조언 부탁드립니다. 감사합니다!

학부생인턴 진행 중인 학생입니다. 동일 조건에서 두 장을 같이 SDS-PAGE부터 transfer를 진행하였는데 이 membrane에서만 끌리는 것처럼 보이는 현상이 관찰됩니다. (사진상 우측) Membrane을 긁거나 육안상 gel의 특별한 이상은 없었는데 ponceau 염색 후 확인하니 이렇게 보여서요... 찾아봤을때 비슷한 trouble shooting도 없고, 실험실에서도 처음보는 결과라서 혹시 어떤 것이 문제일지 궁금해서 올려봅니다. 같이 진행한 다른 membrane은 Western blot 결과까지 잘 확인했습니다.

WB를 하려는데, 1차 antibody를 여러 사이트서 아무리 찾아도 해당되는게 안나와요. symbol도 이것저것 검색해도 안나오고, 다른 종에서 detection하는 ab는 찾았는데, 구조랑 사이즈 자체가 달라서 쓸수가 없고... 이럴땐 어떻게 해야 할까요? 도와주세요ㅜ

갖고 있는 e.coli stock으로 midi prep을 하려고 하는데요, 얼어 있는 stock을 긁은 다음 액체 배지에 바로 접종하여 배양해도 되나요? 아니면 고체 배지 plate에 streaking 하여 single colony 획득 후 액체 배양으로 넘어가야 하는 건가요?!?

어제 cell thawing 하라해서 학부생들 앞에서 시연했는데 cell line 정보랑 특징을 몰라서 subculture 하게될 때 걱정 되네요;; 듣긴 했었는데 3뭐시기 하셨던거 같은데 기억이 안나네요 ㅠㅠㅠ 펜도 두꺼운거 사용하셔서 잘 모르겠어요..

위 사진은 단일 물질(아세트아미노펜)을 MeOH에 녹이고, ACN:H2O=40:60으로 분석을 진행한 peak입니다. 단일 물질에서 2개의 피크가 나오는 경우를 구글링 해봤는데, peak splitting 말고는 다른 경우가 없는 거 같더군요. 구글링 결과 peak splitting의 사진과는 유사한 부분이 없어서 peak splitting은 아닌 거 같습니다.  제 생각엔 단일 물질이 오염이 되서 2개의 피크가 발생했다기엔 2번째 피크의 Intensity가 너무 크게 나와서 단일 물질이 오염되기 보다는 다른 이유가 있다고 생각하는데, 이에 대해 답변주시면 감사합니다. 참고로 컬럼은 교체한지 2주일 정도가 지났으며, 컬럼 세척 조건은 ACN:H2O=75:25로 1시간 정도 진행합니다.  다른 정보 필요하시면 답글 확인하여 필요한 정보 드리겠습니다.

석사1학기차 초보입니다. 다양한 M.O.I(0.01, 0.1, 1, 10)으로 세균에 파지를 감염시키는 실험을 해야하는데, 공책에 끄적인 절차가 맞는지, 다들 이렇게 하는지 확인을 받아보고 싶습니다... 주위에 조언을 해줄 사람도 없어서...ㅠ       특정 상황을 가정하여 적어보겠습니다. 이렇게 행동을 하는 것이 맞는지... 조언부탁드립니다     1) M. O. I 란, 간단히 말해서 '바이러스 수 ÷ 세포수' 이므로 분자에 바이러스 수(PFU/ml), 분모에 세균 수(CFU/ml)를 구해야 한다.   이를 위해,   이중층 한천법으로는 PFU를 구하고, 또다른 plate의 TSA에는 위에 세균을 뿌리고 CFU를 구한다.   2) 1)의 결과,  10^5로 약분하였더니   분자는 75, 분모는 83이 나와서,   M.O.I가 약 0.903이 나왔다.   0.9라 치고, 이것을 보기 좋게 1로 보정하기 위해서는   1ml에 들어있는 바이러스의 숫자(분자)가 1.11배 더 많아져야 한다.   따라서 1ml 내 바이러스 농도를 1.11배 더 짙게하여 바이러스 용액을 만든다.   M.O.I가 이제 1이 되었으므로,     3) 위에서 1.11배를 더 짙게 만든 바이러스 용액을 기준으로 삼아서   바이러스의 용액을 x10 해주면 M.O.I가 10이 되는거고, 반대로 x 1/10 해주면 0.1이 된다     맞나요?   그니까, PFU와 CFU 값이 최대한 서로 같은 값이 되도록 분자나 분모 둘 중 하나를 건드려서(농도를 증가시키던가, 농도를 희석시키던가) 최대한 M.O.I를 1과 가깝게 만든 뒤, 이걸 기준으로 다시 0.1이든 0.01이든 10이든 100이든 만드는건가요?   ㅠㅠ

image j 사용 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 1. 각 엽의 면적  사실 면적까지는 구했는데 픽셀단위라서 어떻게 제곱마이크로미터 단위의 면적으로 해야하는 지 모르겠습니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 2. 각 엽의 혈관의 면적과 그 면적에 대한 퍼센트  도와주시면 사례하겠습니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

안녕하세요. 현재 실험실에서 실험 공부 하고 있는 대학생입니다. hot-fusion method 통해서 pGR-blue plasmid에 mutated primer pink랑 purple  express 시키는 실험을 하고 있는데, cloning efficiency 확인 중에 궁금한게 생겼습니다 primer sequence 가 혹시 cloning efficiency 에 영향을 미치나요?  해외 대학에서 공부 중인데 명확하게 설명 해주는 사람이 없어서 질문합니다. 

간단하게 단백질 함량을 측정하려고 하여 bradford assay로 진행하려고 합니다. bradford assay를 이론적으로만 배워보고 실험은 처음인데, 고체 시료(단백질 강화 머핀)를 샘플로 사용하여 단백질 정량을 진행하려면 고체시료 전처리를 어떻게 진행하여야 하나요? 

단백질 정량실험을 진행하는데 준비한 bsa standard solution에서의 흡광도 값보다 구하고자 하는 미지 시료의 농도가 더 크게 나옵니다. 준비한 미지 시료를 희석해서 standard curve에 넣어 농도를 다시 배수하라고 대충은 알고 있는데 구체적인 방법을 잘 모르겠어서 질문 드립니다.   서치 실력이 부족해서 그런가 어떻게 검색해야 할 지도 잘 모르겠습니다. ㅠ 도와주세요  

고체시료 전처리 방법으로 무엇이 있는지 알 수 있을까요..??

DEX 25mM 짜리를 1mM로 희석을 했는데 25mM 짜리 40ul 100% ETOH 960ul를 넣어서 1ml로 맞춘 뒤 100ul씩 엘리컷을 했는데 이튜브 9개가 나왔는데 10개 나와야 하는거 아닌가요 ??.. ㅠㅠ

amplification plot이 자꾸 이렇게 뜨네요 ㅠ 무슨 문제가 있을까요 ?   cDNA합성도 제대로 된거 같고 문제가 없어보이는데 자꾸 plot이 안잡혀요 ㅠ 

holc,tlc에 용매를 극성 과 비극성을 섞어서 쓰는걸로 알고있는데 왜 섞어서 쓰는건지 이유를 알수있을까요?

speed님 조언주신데로 Agillent 사 pfu로 조건 바꾸어서 muta 하여서 결과 나와서  이전 글 아래에 결과 올려놓았습니다.   저희가 Dnp1 처리후, Amp+ plate에 chloramphenicol 25mg/ml 20ul를 도포하여 쓰고 있는데, 혹시 양이 많을까요? Amp+를 한 20ml은 넣은 것 같아서요... (제가 만든 것이 아니라...) 확인을 부탁드립니다.   감사합니다.