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투표완료 western blot 실험 단계 중에서 blocking 전 후로 washing 하시나요, 안 하시나요?
진행 2022.06.18~06.22  |  참여자 107명  |  댓글 3
Q. PIP3 antibody는 어디서 살 수 있나요?
PI3K의 downstream에 있는 PIP2, PIP3를 western blot으로 검출하고 싶습니다. lipid 계열이라 항체가 있을지 모르겠는데.. 검색해보면 나오긴 하는데.. 온통 human 용으로만 나오고, mouse는 없네요ㅜㅜ 혹시 마우스 샘플에서 PIP3를 웨스턴 블랏으로 검출으로 검출할 수 있는 항체를 아시는 분 계신다면, 알려주시면 감사드리겠습니다.
회원작성글 대학원생인가노예인가  |  06.25
Q. 시약 석출문제
안녕하세요.    시약을 에탄올에 50mg/ml로 녹일수 있다고 해서 43mg/ml로 에탄올에 녹여서 -20도에 보관을 했습니다.   세포에 처리를 할려고 냉동고를 봤더니 하얀색 덩어리로 석출이 된것을 확인할수가 있었습니다.   이러한 경우 상온에서 완전히 녹인후, 사용하여도 문제가 되지 않나요?
회원작성글 하하호호후후히히  |  06.24
Q. pcr 관련 질문드립니다
4.5kb band pcr을 진행중인데 band가 전혀 뜨지 않습니다. pcr 조건은 pre-denaturation 95도 2분 denaturation 95도 30초 annealing 은 primer tm 보다 10도정도 낮게 30초  retention time 5분 총 30cycle진행했습니다. pcr을 총 8번 정도 진행하면서, annealing tm, taq pol, dNTP, buffer도 바꿔가면서 진행했고, genomic DNA도 새로 뽑아서 진행해봤습니다. 어디서 가장 큰 문제가 있었을까요? 그리고 추가적으로 primer 농도가 높게 들어가면 결과가 잘 안나올 수 있나요? 
회원작성글 ssonsson  |  06.24
Q. Media 만들 때의 Contamination 관련하여 질문드립니다.
최근 처음으로 Media 만드는 실험을 진행했습니다. 장갑까지 소독을 잘 하면서 진행하였는데 마지막에 media 필터한 후 잠깐 손을 후드 밖으로 꺼냈다가(뭔가를 만지지는 x) 뚜껑 닫을 때 에탄올로 장갑을 한 번 소독하지 않고 그냥 닫아버렸는데 contamination이 생길까요? 이 정도로는 오염이 안 생기는지도 궁금하고, 만약 세균이 들어갔다 해도 p/s가 잡아줄 수 있는지 궁금합니다. 또한 p/s가 fungi나 yeast까지는 못 잡아주는 것인지도..
회원작성글 초보실험학생_  |  06.24
Q. 농도계산 잘하시는 선배님들 답변 부탁드립니다.
안녕하세요 사고치는 뚝딱이 입니다.  실험실 선배가 없어서 찾고 찾다가 부득이하게 여기다가 질문을 올리게 되었습니다.    분말상태의 9.46kDa IGF 로 Stock을 만들려고 하는데요  최대 농도를 40nM로 잡아서 실험을 할 계획인데,  9.46kDa로 농도계산을 어떻게 해야하는지 모르겠어서 여쭤보게되었습니다.    아직 구매하지 않았는데 25ug, 100ug, 500ug 이렇게 있어서  40nM를 처리 한다 했을 때 ug을 선택했을 때 몇번 제가 사용할 수 있는지, 얼마나 처리할 수 있는지 궁금합니다.  6-well에 처리 예정이고 total volume은 2ml입니다.    실험실에 저 혼자 뿐이라  일단 몰농도로 계산했을 때 0.000384mg/ml이 나오는 것까지는 브릭을 통해 계산을 해보았는데요 여기서 어떻게 계산을 해야하는건가요? 
회원작성글 사고치는뚝딱이  |  06.24
Q. tagging protein 추천 받고 싶습니다
안녕하세요 선배님들   석박 3년차 중인 애기 석박입니다.   CRISPR-Cas9을 이용해서 특정 protein 서열에 tagging한 ESC를 제작하고자 하고 있습니다. 주로 HA나 FLAG을 사용하겠지만 두 tag 모두 organoid나 mouse에서 non-specific binding이 나타났다는 말이 있어서 더 좋은 tag을 구하고 있습니다.   목표로 하는 protein은 ICC, IP, WB 용도로 사용할 예정이라 적절한 Tag을 추천 받고 싶습니다. V5, MBP, GST, HALO 등 다양한 내용들이 있었지만 어느게 제가 사용하고자 하는 application에 적절할지와 우수할지 궁금합니다. 되도록이면 CRISPR-Cas9 HDR로 넣을 예정이라 짧은 seq이면 좋을 거 같습니다.   감사합니다
회원작성글 도비가공짜  |  06.24
Q. LB agar plate 제조중 굳었을경우 가열해서 재사용이 가능한가요?
이번에 새롭게 실험을 진행하기 위해 LB agar plate를 오토클레이브로 제조했는데 다 끝나고 현재 소분 할 페트리디시가 없어서 그 사이에 굳을거같습니다   혹시 굳은 agar plate를 다시 가열해서 소분해도 괜찮은가요?   그리고 클린벤치에 UV를 켜두고 보관하는게 좋은지 아니면 끄는게 좋은지 궁금합니다
회원작성글 ddaaeeww  |  06.24
Q. vector transforamtion
안녕하세요. vector transformation 중에 문제 있어서 이렇게 질문을 남깁니다....   addgene에서 pMo130 vector를 주문해서 E.coli XL1-BLUE에 tansformation을 시도했는데....colony가 하나도 안 나왔습니다....... 그 이후에 vector의 양을 늘려서 한 번더 시도해봤는데...안 되네요.... 이 vector는 XL1-BLUE에 transformation하면 안 되는 vector인가요?? transformation할 때는 항생제로 kanamycine LB plate를 사용했습니다. 이게 잘못된 것은 아니죠??....... 사이트에 들어가면 JM109에 하라고 적혀있기는 한데....저희가 지금 그 균주를 구매할 수 있는 상황이 아니라서요.... E.coli XL1-BLUE 말고는 E.coli DH5a 만 있는 상태입니다... E.coli DH5a에 시도해보면 나올까요??.... cloning 고수님들 답변 부탁드려요....  
회원작성글 Worker  |  06.24
Q. wet cell, dry cell 추출시 폴리머 성상 차이 질문이요
PHB를 추출하는 실험을 진행중입니다.  wet cell로 추출시 PHB는 휴지와 같이 침전이 잡히면서 수득이 되는데  dry cell (온도 120도에서 3시간 건조)는 추출시 non-solvent에서    분산상처럼 (에멀전이나 또는 fine particle) 처럼 생성이 됩니다. dry cell로 가면 열로인해 고분자가 결정화되고 이런것이 용제에 잘 녹지 않아 수율이 떨어진다는것은 알겠는데 수득시 폴리머 형태가 너무 다르게 나오는 이뉴는 무엇을 일까요?
회원작성글 할아버지만세  |  06.24
Q. Biological Indicator 균주 규명 관련하여 질문드립니다.
안녕하세요, 멸균 의료기기 제조업체 종사자입니다. 매번 멸균기를 가동할 때마다 B.I를 배양하고 있는데, 최근 B.I에서 양성반응이 도출되는 횟수가 드물게 발견되어 고민이 많습니다. 현재 Steam 멸균을 위한 3M 1292-S Geobacillus stearothermophilus를 사용하고 있습니다. 해당 B.I가 양성이 뜬 이유가 실제로 G.stearothermophilus가 사멸되지 않아 그런 것인지, 혹은 기타 다른 균주로 인해 양성 반응이 도출된 것인지를 확인하기 위해서는 어떤 시험법을 이용하면 좋을지 문의드립니다.
회원작성글 두부구름  |  06.24
Q. transformation관련 질문 드립니다.
  transformation 관련 질문드립니다.   몇일전에 plasmid prep 한 걸로 transformation 을 진행하엿는데..   plasmid prep한 Sample 이  상태가 않조은지   colony수가 너무 적어서 재transformation 진행하려고 합니다.   혹시 전에 transformation후  incubate  후 60% glycerol+stock    -80 도씨 deep freezer 에 보관해둔 걸로 재transformation 진행해도 될까요??  
회원작성글 mito59  |  06.24
Q. InDel marker를 이용한 PCR product인데 밴드가 안나와요... 첨부파일
안녕하세요 많은 분들의 의견을 듣고 싶어 이렇게 글을 남깁니다..  제가 이번에 한 식물의 indel marker의 염기서열을 보고 oligo primer를 주문하였으며,  pcr 조건으로는  아래와 같이 진행하였습니다. 95℃- 5min  1cycle -------------- 94℃-30sec 55.2, 49.3, 44.8, 41.8, 40.0 ℃-30sec 72℃-40sec  32cycle -------------------------- 72 ℃-10min  1cycle  ----------------------- 4℃-∞  1cycle 100V, 55min 전기영동, gel 농도 1.5% 처음  45℃ 동일 조건으로 진행하였을 때는 밴드가 희미하게 여러개 보였으나. 이번에 gradient로 진행하니 저번에 나왔었던 45℃대의 여러 밴드들도 안보이고 단일밴드로 나왔습니다.. ladder의 경우 잘 나왔으며, loading dye도 찍혀 있어 겔 밖으로 pcr product가 빠져나가진 않은거 같은데  왜 band가 안나왔을까요,, 이럴 때 해결은 어떻게 하시는지 많은 조언 감사드립니다. 부디 많은 의견 남겨 주시면 감사드리겠습니다.. 추가로 band가 많이 구불 거리는데 이부분,,어찌 해결하는게 좋을까요?  전기영동 v를 낮추고, 시간을 늘리면 될까요?    
회원작성글 해조칼슘풍덩  |  06.24
Q. PAGE 에서 두 ladder가 너무 다른 위치에 나옵니다.
안녕하세요, 바이오 전공자는 아니지만 요즘 DNA 를 이용한 여러 실험을 진행하고 있는 유기합성 전공자입니다. 최근에 PAGE 로 oligonucleotide 의 ligation 진행정도를 monitoring 하다가 이상한 현상을 발견했습니다.  사진에 보이는 첫번째 lane 2와 lane 7은 서로 다른 ladder 입니다. lane 2 는 bioneer 의 10 bp ladder이고 lane 7 은 Thermo 의 ultra low range ladder입니다. 근데 얘네들의 basepair 위치 차이가 상당합니다.  저는 기존에 Bioneer 제품을 쓰고 있었는데 보시는 것 처럼 윗 부분에  smearing 하는 현상이 있어서 이를 개선해보고자 thermo 제품을 구매하였습니다. 근데 bp 위치가 기존과 크게 차이가 나며 이를 바탕으로 해석했을 때 제 샘플들이 이론적인 길이보다 훨씬 길어보인다는 문제가 있습니다.  ladder에서 왜 이런 차이가 나는 걸까요?  홈페이지에는 둘다 Agarose gel 용이라고 되어 있는데 제가 page 에서 사용해서 그럴까요?  그렇다면 둘 중에 더 정확한 ladder는 무엇일까요? 이럴경우 standard oligo  샘플 (이미 길이를 정확히 알고 있는) 을 같이 run 해봐야 될까요? 잘 아시는 선생님들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.  
회원작성글 서박  |  06.24
Q. 중금속 흡착 실험 관련 pH 관련
안녕하세요.   저는 현재 바이오매스의 중금속 흡착 실험을 준비중에 있습니다. 바이오매스 0.1 g/ 중금속 수용액9 mL으로 등온흡착실험을 시도하려는데, 문제는 초기 pH 대비 나중 pH가 크게 변하였습니다(최대 pH 4 -> 7).   제가 알기로는 중금속 용액의 자유이온이 적얻 pH 6 미만이어야 되는데 pH가 증가하면 흡착만으로 제거되는 것이 아니라 OH이온에 의한 공침도 발생하기 때문에 등온흡착식이 잘 나오지 않는 것으로 예상됩니다. 실제로 등온흡착식을 도출해보니 포화곡선이 나와야 하는데, J자 곡선 또는 더 심하게 뒤집어진 C자 형태로 꺾여진 것으로 나왔습니다.   아마도 바이오매스가 OH이온을 계속 방출하기 때문으로 예상되는데요, 이를 방지하기 위해서 pH 버퍼를 사용한 중금속 수용액을 사용하면 바이오매스 투입 후에 반응기간 동안 과도한 pH 증가를 억제할 수 있지 않나 싶습니다.   만약 그렇다면 적당한 pH버퍼와 제조법이 있다면 정보를 제공해주시면 감사하겠습니다. 제 생각엔 중금속 수용액 초기농도를 pH 5 수준으로 하기 위해서 Phosphate buffer (pH 5-6)이나 Acetate Buffer (pH 5)가 어떨까 하는데요, 중금속 흡착실험에서 방해되는 요소는 있는지, 구체적인 제조법인 어떻게 되는지가 궁금합니다.   감사합니다.   
회원작성글 레미어  |  06.24
Q. Cytokine 구매처
안녕하세요. 이번에 새로 디자인 하는 실험에서 세포에 특정 사이토카인 및 해당 사이토카인의 mutation type (single nucleotide polymorphisms 또는 다른 polymorphism)을 처리해서 해당 세포에서 여러가지 CYP450 또는 gene들을 확인하고자 합니다. 일반적인 사이토카인을 취급하는 회사는 여럿 있는데 mutation type을 취급하는 회사는 아직 찾지못해서요. site directed mutagenesis를 일으킬 또 다른 테크닉이 어쩔수 없이 요구될까요 ㅠㅠ?  취급하는 벤더에 대해 질문드립니다...
회원작성글 내가조수로보여  |  06.24
Q. FPKM으로 DEG를 하려고 하는데 질문이 있습니다.
안녕하세요, 이번에 RNA-seq를 처음 시작한 대학원생입니다.   일단 이 실험에 관해서는 BIoinfomatics를 전문적으로 하는 실험실과 콜라보를 하고있어서 사실 분석에는 크게 문제되진않는데.. 지도교수님께서 제가 이에 대해서 좀 배워서 직접 하시길 원합니다... 그래서 작년 연말즘에 이 실험실에서 타 대학 교수님들을 모셔서 3개월정도 진행한 수업을 들었는데 거의 이론설명없이 바로 실전으로 넘어가다시피해서.. 중간과정을 다 뛰어넘고 진행하다시피해서 모르는게 많아서 찾아서 공부하기가 어렵네요. 일단 FastQC-Trim-galore를 돌리는 것 까지는  실험실 컴터가 그렇게 사양이 좋지가않아도 문제없지만 STAR는 램을 많이 잡아먹다보니 자꾸만 뻑가서 STAR를 쓰지않는 tuxedo pipeline으로 셋업해서 연습삼아 해보려고 시도는 하고있는데, 이 부분은 거의 정형화된 명령어들만 기입해주면 되다보니 크게 어렵지않은것 같습니다. 에러가 떠도 거의 왠만하면 대처가 가능할만큼 솔루션이 있는 거 같습니다. 근데 cufflinks 후에 이 결과물을 바탕으로 DEG를 할 때가 문제입니다. 기본적으로 수업에서 배운데로 FPKM 값을 Log2 값으로 변환해서, A샘플과 B샘플간의 발현량의 차이를 보려고하고있습니다. 수업에서 배운데로 median centering을 해서 1차적으로 normalization을 해주고 있습니다. A샘플은 2마리, B샘플이 1마리밖에 없어서 일단 p-value는 계산 할 수 없고 그냥 단순히 나오는것만 가지고 보려고합니다.  근데 막상 찾아보니 대부분의 DEG는 read count로 하느라, DEseq2, EdgeR등은 사용이 불가능한 것 같더라구요....? ㅠ.ㅠ 그래서 일단 두 프로그램은 사용이 불가능할 것 같고 limma-trend? limma-voom?은 아무튼 Limma는 가능한 것 같은데 이거를 막상 쓸라니까 뭐 마땅한 example이나 샘플이 없어서 어떻게 진행을 해야할지 모르겠습니다. 일단 그 실험실분들은 여쭤보니 저런 프로그램없이 자기 서버내에 별도로 normalization tool을 구축해놔서 그걸 쓴다고하고, 저 median centering 외에도 QAC? QAD?인가 하는거랑 aggregator?인가 하는걸로 세차례 normalization 한다는데 두 방식을 제가 만들어보긴 힘들거같고 인터넷을 찾아서 직접해보라...하셔서 찾은게 limma네요.. 근데 이것도 막상 직접해볼라니까 감이 안잡힙니다...limma-voom은 또 뭐 FPKM,RPKM으로 쓰시면 안된다 하고 limma-trend를 하면 된다는 것 같은데 여기저기 찾아보니까 다들 read count 값을하지만 이거는 micro array 때부터 쓰던 기능이라 log2 CPM 값을 log2 FPKM 을 바꿔서 하면 된다...라는것 까진 알겠는데 정작 뭐 아무 예시가 없으니 어떻게 해야하나싶습니다..   아무래도 그 실험실 선생님께서 하신 세차례 normalization한 DEG와  제가 한차례 normalization한 DEG의 fold change값이 좀 다릅니다. 예를 들면 저는 DEG에서 UP-regulation된 gene이 1254, down이 387개면 그 선생님은 UP이 773개, down이 659개네요...ㅋㅋ;; 제가 더 많이 발현한다고 보이는것도 있고 저한테는 안 뜬 gene이 감소한다고 뜨는 것도 있습니다..   혹시나 예시를 참조할만한 사이트가 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.ㅠ.ㅠ...        
회원작성글 토라  |  06.24
Q. kda에서 nmol/L로 계산
시약을 구매하려는데 실험에 사용되는 용량을 알아보다가 계산이 안되서 질문합니다. ㅜㅜ도와주세요ㅜㅜ 시약 데이터 시트에는 9.6kDa이라고 써있고 그 시약을 사용한 논문들은 보니 사용한 양은 40nM이 더라구요. 그렇다면  9.6kda -> 9.6*10^12 nM으로  9.6*10^12 nM /40nM 하여서 몇번 사용가능한지 구하는 건가요? 도대체 어떻게 실험 한번에 사용하는 용량이 얼마인지 모르겠습니다. ㅜㅜ  
회원작성글 oneday  |  06.24
Q. KO 마우스 판별을 위한 PCR primer 관련하여 질문 드립니다.
안녕하세요,  브릭에 계신 연구자님들께 조언을 듣고 싶어서 질문을 올립니다.    다름이 아니고 저희가 헤테로 마우스끼리 교배해서 낙아웃 마우스 제작 중에 있는데, 확률 상 1/4인데도 낙아웃 마우스가 너무 나오지 않아서 문의 드립니다.  현재 저희 연구실에서는 헤테로 마우스끼리 교배한 새끼들을 toe cutting 하여 genomic PCR로 유전자형을 분석하고 있습니다.  저희가 쓰는 primer가 WT reverse, WT forward, KO reverse, KO forward 총 4개이고, 이 4개의 primer를 사용하여 PCR을 하면 KO band만 관찰 되는데, 더블 체크를 위해서 동일한 샘플에 WT primer만 사용하여 PCR을 다시 하면 예상대로는 아무 band도 관찰이 안 되어야 하는데 (된다고 해도 100 kda 이하의 nonspecific band) WT band가 선명하게 관찰 되어서 이러한 현상을 문의 드리고자 합니다.    교배 상에서 헤테로만 나오는 것인지, 아니면 PCR 시 어떠한 문제가 있어서 KO 마우스 판독이 불가능한 것인지 문제점을 모르겠어서 혹시 이런 부분에 조언 주실 것 있으면 마음껏 해주시면 감사드리겠습니다.... ㅠㅠ   
회원작성글 dingdongda..  |  06.24
Q. Dot blot 실험 과정 중 사용하는 binding buffer ? (논문 내용 캡쳐하여 올립니다)
  위 논문에서 사용한 binding buffer의 조성은 methods에 나와있지 않아서 여쭤 봅니다   비슷한 실험을 진행하실 때  어떤 binding buffer를 사용 하시나요?
회원작성글 leanonhelp  |  06.24
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