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Q. protein purification 중 binding 문제
안녕하세요, protein purification 실험 진행하는데 막히는 부분이 있어 여기에 여쭤봅니다.  단백질 실험은 처음 해보는지라 모르는 점이 많음을 양해 부탁드립니다.    target 하는 단백질 size 는 대략적으로 28kDa(his tag size 포함) 이고, Ni-NTA resin 을 이용하는 Affinity chromatography 를 통해 정제하려고 하였습니다. 사용한 Tag은 His-tag이며, N-term과 C-term 양쪽에 모두 6x His를 가지고 있습니다 (N-term이 stable 하다는 얘기를 듣긴 했지만, 양쪽에 his tag를 가지고 있으면 binding 이 더 잘될 것이라는 생각이 들어 N/C -term 모두에 his-tag를 달았습니다.) 실험 방법은 다음과 같습니다.  1. 25ml 의 cell culture를 centrifuge하여 pellet 을 수득한 후, lysis buffer 5ml 로 resuspension 한 다음 세포파쇄 (via sonicator: 50%, 5'' on/ 5'' off)하였습니다. sonication 이후 centrifuge 하여 supernatant를 lysate로 사용하였습니다. (soluble fraction)  2. 사용할 column (10ml의 컬럼)을 1CV 만큼 equilibration 해주었습니다.  3. Ni-NTA agarose resin 을 column에 1ml 충진 후, binding buffer 3CV flow through.  4. Sample 을 column에 load 한 후, 4℃ 에서 rotation 준 상태로 O/N 5. 이후, Sample을 flow through 하였습니다. (이 때 binding 을 좀더 시키기 위하여 flow through한 sample을 약 3회 정도 re-load하여 최종 Sample flow through 를 확보하였습니다.  6. (+10mM imH)로 3CV 만큼 washing  7. 1CV의 50mM~500mM imH로 각각 elution  8. SDS-PAGE 로 gel 확인 (Gel 사진은 하기 그림과 같습니다/ 하기 문제점에 기재하였듯, Elution 된 양이 적어 50mM 이상 elution 하였던 lane은 그림에서 뺐습니다.)  문제점과 질문사항은 다음과 같습니다.  Issue 1. Sonication 시, 많은 양의 cell 이 깨지지 않음이 확인됩니다. 우선적으로 사용한 sonication의 조건은 general 하게 사용하는 condition 으로 수행하였습니다. 질문) sonication 시 cell 이 잘 안깨지는 이유가 무엇인지 여쭤보고자 합니다. (많은 양의 cell 이 깨지지 않았더라도, 현재 gel 상 Soluble faction 에서는 충분한 target protein이 확보되었기 때문에, 큰 문제는 되지 않겠지만.. 그래도 일반적인 lysate와는 turbidity 가 많이 차이나서 여쭤봅니다.) Issue 2. Soluble fraction 과 Sample flow through 에서 target 단백질의 size 가 거의 비슷합니다. -> Ni-NTA Binding의 문제라고 생각됩니다. binding 효율을 늘리고자 4도에서 rotation 주며 o/n 하였으나 실질적으로 target 단백질이 이 과정에서 많이 손실되는 것으로 보입니다. 따라서, elution 시에도 당연히 target 단백질이 적게 수득됩니다. (  질문) binding 이 잘안되는 경우, binding 효율을 늘리기 위하여 어떤 방법들을 사용하시는지 여쭤보고 싶습니다. 또한, gel 사진을 해석하기에 또 다른 문제점들이 있는지를 알고 싶습니다.  ** binding이 안되는 경우, 보통 3차 구조로 his tag이 숨어버리는 경우를 의심하는 것으로 알고 있습니다. 이런 숨는 케이스를 확인하고자 하면, 어떤 방식으로 확인해야 하는지도 여쭙고 싶습니다.   감사합니다. 
회원작성글 ATTENSION  |  02.04
Q. 관리된 소 조직 구할 수 있는 방법이 있을까요?
소(bovine) 조직 내 물질을 분석하는데 검량선 그릴때 blank조직이 필요해서요.. 열심히 찾아보는데 서칭능력이 부족한지 안나오네요.ㅠ 진짜 어디 도축장 발품을 팔아야하는지..
회원작성글 fbtpa4  |  02.04
Q. Immunoprecipitation 후 immunoblot 결과 해석
논문을 보던 중 Western blot 결과 해석이 어려워서 질문드립니다ㅠㅠ... 질문은 크게 두가지입니다.   예를 들어, A단백질은 B, C, D와 complex를 형성한다고 했을 때, [질문1] Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 A 단백질을 Immunoprecipitation 후, B,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 컨드롤(scrambled control)에 비해 B의 증가량이 C, D의 증가량에 비해 매우 크다는 것은 무엇을 의미하나요? [질문2] 위 질문의 연장선으로,, Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 B 단백질을 Immunoprecipitation 후, A,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 위의 질문결과와 다르게, A,C,D의 증가량이 유사했다는 것은 무엇을 의미하나요?
회원작성글 옹듸  |  02.04
Q. western blot band 개선 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ
western blot을 진행하고 있는데 아래사진처럼 dot 처럼 나오는 문제의 원인을 파악하지 못해서 이렇게 질문드립니다.... 단백질 사이즈 ; 14,16kDa 15% SDS-PAGE, Bio-rad 사용 Running ; 100volt, 2h 30min   Transfer ; 100volt, 1h 일단 이런식으로 dot으로 나오는 게 아래의 작은 size 단백질만 그렇고 GAPDH나 다른 사이즈 단백질은 크게 문제 없이 나옵니다.... 작은 사이즈의 단백질에 대해서 해당문제를 해결하려면 어떻게 해야하는지 도움부탁드립니다..
회원작성글 뚜둥  |  02.04
Q. qPCT Tm값
안녕하세요. qPCR을 처음 해본 학부생입니다. qPCR 진행 후 Tm값 결과를 얻었는데, PCR mixture가 약간 부족했던 튜브만 Tm값이 살짝 다른 위치에 나왔는데 Tm값과 PCR mixture volume이 어떤 관계가 있는건지 궁금합니다!! PCR mixture 양이 아주 달랐던건 아닌데 이거 말고는 원인이 없는거 같습니다… 너무 궁금해서 계속 찾아봤는데, 구글링해봐도 잘 모르겠습니다ㅠㅜ 아직 부족한 부분이 너무 많습니다. 너그럽게 이해해주시고, 알려주시면 정말 감사하겠습니다 !!
회원작성글 영혼가출중  |  02.04
Q. Fixed 조직 갈아서 FACS 해보신 분 계신가요?
Brain을 FACS를 돌릴 수 있을까 생각하고있는데 문제는 살아있는 애를 금방 꺼내서 하려는게 아니고 Fixed brain을 갈아버린 후에 항체 붙여서 할 수 있나 여쭤봅니다. Single cell RNA-seq은 해보진 않았는데 찾아보니까 할려면 살아있는 애를 잡아서 장기 꺼내서 갈아버린 다음에 특정 Cell만 잡도록 CD4, CD8에 형광단백질 같은거 붙여서 FACS로 sorting해서 RNA뽑아서 맡기는 것 같던데 그럼 같은 원리로 그냥 Fixed brain 싹 갈아버린 다음에 조직염색 시키고 나서 FACS로도 볼 수 있는지 여쭤봅니다. 논문 찾아보면...잘 없는 듯 한데..해보신분이 계신가 궁금하네요. 교수님께서는 살아있는 세포를 갖고해야한다. 하시는데 이게 FACS를 한번도 안해봐서 프로토콜 찾아보면 결국 fixation하고 항체붙이는거 봐선...그 세포는 FACS돌리면 죽을텐데 그냥 Population만 보는 정도면 죽든 살든 상관없지않나요...?
회원작성글 토라  |  02.04
Q. 실험하다답이안나와요
1번 100pmol primer를 10pmol 로 희석을하고 10pmol에서 3.2pmol을 만들려면? 2번 PCR밴드가 끌리면? 어떻게 해야하죠?
회원작성글 콩콩콩콩  |  02.03
Q. 푸른곰팡이 배양 및 streaking 질문입니다
제가 푸른곰팡이를 배양하려 하는데 귤껍질이나 상한 음식에서 푸른곰팡이가 자라나면 포자를 루프로 때어내서 바로 배지에다가 접종시기면 될까요..?
회원작성글 란울  |  02.03
Q. 전체(항생제 미사용을 말하는 겁니다) 미생물상 배양법?
안녕하세요. 개미 표면에 상주하는 박테리아 종류가 뭐가 있는지 알아볼려고 하는데요. 당면한 문제가 2가지 있습니다. metagenomics는 비용 문제로 쓰지 못하므로 관련 내용 언급은 삼가주세요.   1. 개미 표면에서 어떻게 혼합균주를 떼어낼 수 있을까요? 개미를 핀셋으로 잡아가지고 그대로 배지에 문지를 수도 없고 말입니다. 2. 1.을 해결하기 위해 한 가지 방법을 생각해 봤는데요, 다음과 같습니다. 희석한 생리식염수나 3차 증류수를 살짝 묻힌 멸균 면봉으로 개미 표면을 닦아낸 후, 그 면봉 끝을 액체배지에 담갔다가, 그 액체배지를 3일 후 다시 고체배지 위에 도말한다   인데... 뭔가 이래도 되나 싶기도 한 방법이라.... 이렇게 해도 될까요?  그리고 1. 질문도 답변 부탁드립니다.
회원작성글 jaehunjeon..  |  02.03
Q. cell doubling time 질문
안녕하세요. 세포 증식 실험을 하던 중 의문점이 생겨 질문 남깁니다. cell counting을 이용해서 cell doubling time을 구하려고 하는데  5000(0h) 4500(24h) 6800(48h) 22500(72h) 44300(96h) 24시간 주기로 세포 수를 counting 했을 때 이렇게 나왔습니다.  1. 0h-> 24h 에서 5000개를 seeding했는데 부착이 되지 않은 세포가 있는지 4500개로 세포 수가 줄었습니다. 이 때, doubling time이 -가 나오는데 이런 경우에는 어떻게 해야되는 지 궁금합니다. 2. cell doubling time을 구할 때, 0->24h, 24h-> 48h, 48h-> 72h, 72h-> 96h 각각의 doubling time을 구해서 평균을 내는 것인지 궁금합니다. 너무 기본적인 내용이지만 답변해주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 미생이  |  02.03
Q. TOC 분석 시험 의뢰 기관 문의
안녕하세요 : )  TOC 분석 관련하여 정보가 필요해서 문의글 남깁니다.   1 ppb까지 시험이 가능한 기기로 5ppb 이하의 시험성적서를 발행할 수 있는 KORAS 분석시험기관을 서치 중입니다.    혹시 알고계시는 분 있으시면 답변 부탁드립니다.  감사합니다 : ) 
회원작성글 됴엥  |  02.03
Q. Western blot 발현량 측정 방법 질문드립니다.
안녕하세요. 공부 중에 궁금하여 질문드립니다.. 웨스턴 블롯이 타겟 단백질이 있는지 없는지 유무를 확인하는 방법이라고 이해를 하였는데요   혹시 RNA 발현량 알아보는 qPCR 실험 같이 타겟단백질의 발현량(?)을 확인하는 정량 실험은 어떤 방법이 사용되나요? 어떤 실험법으로 찾아야 공부할 수 있는지 몰라서 질문드립니다 ㅠㅠ  
회원작성글 흰털누누  |  02.03
Q. plasmid DNA transfection model, miRNA 실험 질문
reference를 찾으며 실험 모델을 찾아보다가 궁금한 점이 생겨서 질문드립니다. miRNA가 target gene의 3'UTR에 binding해서 gene expression을 조절하는 것으로 알고 있는데요. 어떤 A라는 gene이 많이 올라가 있는 상태에서 A gene억제조절하는 것을 보고싶은데 A plasmid DNA를 직접 transfection 시켜서 overexpression을 시키면 DNA에는 3'UTR이 없기 때문에 모델로서 적합하지 않은걸까요? overexpression model을 잘 안쓰고 다른 toxin으로 해당 gene을 올리는 방법으로만 쓰길래 질문드립니다. 감사합니다!
회원작성글 2밍  |  02.03
Q. western blot 시 중단할 수 있는 단계는??
안녕하세요. 저희 랩이 조마간 이사를 가게되면서 실험 장비들을 새로 셋팅을 하게 됐는데요. chemi doc이 너무 고가라 여건이 안되서 이사 전 입주해있던 곳의 장비를 사용해야 될 것 같습니다. 그런데 거리가 1시간 거리이기도 하고 거기에 연구공간도 없고 보관 장소도 없으니 필요한 물품은 직접 들고가서 장비만 후딱 쓰고 다시 복귀해야될 것 같은데,    1. blocking 단계에서 shaking 후 blocking buffer에 담가놓고 1차 항체 들고 1시간 이동. 냉장 창고에서 o/n 진행시키고 다음 날 2차 항체 들고 다시 현장으로 이동. 2차 반응/세척 후 ECL 반응시켜 chemi doc 과정 진행. (이동 중 항체에 문제가 생기지 않을지 걱정...) 2. 2차 항체 붙이고 반응 완료후 TBST에 담가놓고 이동. 현장에서 washing 마무리 하고 ECL 처리해서 chemi doc 진행 (1시간 이동하는 과정 중에 2차 항체가 씻겨나진 않을까 걱정...)    중에 어떤 방법이 더 좋을 지 알 수가 없어서 물어봅니다. 이 외에 더 좋은 방법이 있을까요??
회원작성글 민드  |  02.03
Q. cloning 과정 질문드립니다.
vector 와 insert에 enzyme cut 진행 후 ligation을 진행할려고 하는데요 2개의 enzyme를 사용하다 보니 gel 상에서 band가 2개가 나오긴 하는데 이걸 제가 원하는 size부분을 gel extraction으로 자르고 ligation을 진행하는 걸까요? 아님 그냥 진행하는 걸까요?
회원작성글 분자생물학도  |  02.03
Q. Conventional mouse에게 물리면 어떻게 될까요?
안녕하세요 Nc/Nga mouse였고 아토피 유도된 쥐였는데 꽤 깊게 물려서 피가 철철 났습니다..ㅜㅜ 걱정되어서 찾아보니 대부분은 괜찮지만 conventional mouse에게 물리면 좋지 않다고 하는데 그 이유는 무엇일까요? 그렇다면 저는 어쩌면 좋을까요? 너무 걱정됩니다... 조언 좀 부탁드립니다 선생님들..ㅜㅜ 감사합니다
회원작성글 쥐돌이귀여워  |  02.03
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세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
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전체(항생제 미사용을 말하는 겁니다) 미생물상 배양법? [3]
세포주 가능한 계대배양 횟수 확인방법 [1]
초음파분쇄기 없으면 다른수단 있을까요 [7]
HPLC peak 재현성(나오다 안나오다 함) [3]
동물세포 관찰이나 사진촬영을 위한 염색 방법 [1]
SDS 전기 영동 시 기계의 문제로 밴드가 흐리게 나올 수도 있나요? [1]
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면역염색이나 wb 실험시 2차 antibody관련 질문 [5]
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