안녕하세요 DNCB로 BALB/c 아토피를 만들어서 spleen에서 Th1/2 확인하려 합니다. 완전 처음이고 랩에 세팅하는거라 도움이 절실합니다   1. 제가 구입하려는 antibody가 아래 4가지입니다. 다 mouse detection antibody예요     CD3-FITC (Rat, IgG2bk), CD4-APC-eFluor780 (Rat, IgG2bk)     IL-4-PE (Rat, IgG1k), IFN-r-APC (Rat, IgG1k)     4분면(?) 나눌때 control isotype이 필요하다고 하는데 그럼 저는 IgG2bk-FITC, IgG2bk-APC-eFluor780, IgG1k-PE, IgG1k-APC 이렇게 4가지를 다 Rat으로 구입해야 하는건가요??   2. spleen에서 세포를 꺼내서 10% FBS/RPMI1640에서 PMA, Ionomycin으로 자극할건데 옆방 박사님이 10%면 너무 높다고 사이토카인이랑 이것저것 많아서 FBS를 줄이라고 하시는데 이해가 잘 안 갑니다,,, 그리고 DNase를 넣으면 좋을 것 같다고 하시는데 왜 넣어주는 걸까요,,??   3. FACS buffer는 FBS 2%, NaN3 0.1% in DPBS 사용하려고 하는데 사용해도 되는 농도인가여??

안녕하세요, 과기인 여러분들께 도움을 받고자 질문을 등록합니다.   단백질 최종 DP를 동결건조 혹은 감압건조를 통해 분말형태로 만들어 보관합니다.   이 때, 분말 형태의 단백질을 다시 버퍼에 재구성하여 활성도를 살펴보면 일부 감소하는 경향을 나타납니다.   감소하는 경향을 왠지 2가지 부류로 유추되는데,   1. 동결 또는 감압 건조 시의 단백질 손실   2. 동결 또는 감압 건조에 의한 단백질 활성 부위 변화로 유추 됩니다.   혹시 이에 따라 경험적인 방향에서의 이유나 혹은 추천해주실만한 논문이 있으시면 감사하겠습니다.   즐거운 하루 되십시오.

저는 덱스트란(출처: S.mutans)에 대한 HPSEC-RI-MALLs 분석을 해보았지만, 분석 결과 분자량이 매우 낮은 왜곡된 피크(거의 10^3, 문헌에 따르면 10^6 정도여야 함)를 보여줍니다. 아직 이 문제의 정확한 원인을 파악할 수 없었습니다. 조건: 샘플 희석: x2입니다 유량: 0.6 mL/min입니다 사용된 열: 806-804입니다 시간: 60분입니다 온도: 55도입니다 ASTRA 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석했습니다 사용된 샘플은 가용성 및 불용성 분획을 분리한 후 얻은 상등액(글루칸 및 기타 가용성 성분 포함)이었습니다 I have been doing HPSEC-RI-MALLS analysis for dextran (source: S.mutans) but the resultant analysis shows a distorted peak with very low molecular weight (almost 10^3, whereas according to literature it should be around 10^6). I could not figure out the exact cause of this problem yet. Conditions: sample dilution: x2 Flow rate: 0.6mL/min Column used: 806-804 Time: 60 min Temperature: 55 degree celcius ASTRA software was used to analyze the results The sample used was supernatant (soluble part including glucan and other soluble components) obtained after separation of soluble and insoluble fractions

Peprotech #100-21C 제품, Recombinant Human TGF-beta protein를 사용하여 HCS-T6(Rat cell)에사용 예정입니다. Recombinant protein이 CHO cell에 transfection하여서 생산된다고 알고 있는데요, 여기서 Human이 무슨 의미인가요? Datasheet에서  Cross reactivity에 Human, Rat etc 가 포함되어있긴 한데 Rat cell line에 사용하여도 효과가 있을까요?

안녕하세요. 실험실에서 혼자 단백질 실험을 하고 있어 이론적인 부분을 독학하고 있는 학생입니다. 다름이 아니라 단백질 구조에 대한 논문을 보면 (b/a)8 barrel, beta sandwich 구조 등등을 설명하고 있는데 이런 구조로 존재하고 있는건 그냥 전체적인 구조를 보고 아는걸까요? 파일을 켜면 복잡하게 엉켜있는데 체인별로 찢어서 확인하는 걸까요..? 혼자서 공부하니 저런게 존재하는구나는 알겠는데 실제로 구조를 보고 어떻게, 어떤 정보를 얻어야 하는지를 잘 모르겠습니다 ㅠㅠ.. 찾아본다고 열심히 찾아보는데 진도는 안 나가서 답답해서 쉬운 질문이지만 고수님들께 여쭤봅니다.. 감사합니다.

안녕하세요, CFPS system (혹은 in vitro protein synthesis)를 이용하여 sfGFP를 생산하여 시그널을 확인하는 실험을 진행하고 있습니다. 처음 접해보는 분야라 부족해서 질문 드리게 됐습니다. sfGFP-pBAD라는 plasmid 에서 sfGFP gene 영역을 따서 T7promoter, RBS 등 포함하는 synthetic linear dna template을 만들어 CFPS의 template으로 사용하고 있습니다.  아래 서열 중 초록색으로 표현된 720mer 부분만(stop codon 포함) pcr로 따서 사용하는데, 초록색 gene 앞에 노란색 표시된 부분이 포함되지 않을때는 chromophore가 mature 되지 않나요?? gene은 717mer 라고 표기되어 있는데, gene 앞쪽과 중간, 그리고 끝쪽에 노란색 형광표시된 부분이 있어서 이 부분이 모두 있어야 mature되어 형광을 띄는건지 궁금해서 질문 드립니다. 아니면 gfp 서열 중간의 노란형광 부위만 있어도 형광을 띄나요??  모두 있어야 한다면 지금 cloning 하여 만들어내는 template로는 형광이 나오지 않을것 같아서요.. 잘아시는 분 있으시다면 의견 부탁드립니다. 감사합니다.   psfGFP-pBAD    (SuperFolder Green Fluorescent Protein)     Sequence Number:  PBAD-1xx   ATGGTGAGC - sfGFP Sequence (717 Nucleotides - 239 Amino Acids) ACCTACGGC - sfGFP Chromophore (TYG) CATCATCAT - 6X Histidine Sequence TCCGGACTC - Multiple Cloning and pBAD Components ATG - Methionine Start Codon TAA - Stop Codon                                                                                              Antibiotic = Amp   ACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTATCCATAAGATTAGCGATACTACTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGAGAACCTGTACTTCCAGGGCTCGAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCGCCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCAGCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACGTGGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGTGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGAATTCGAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTATAAACA

질문에 앞서 실험보다 문헌에 관련된 내용인 점 사과드립니다. translated RNA가 아미노산을 구성하기때문에 코돈표를 보면 일부를 제외하고 RNA 기준 (T->U)으로 3 letter를 표기하는 것을 일반적으로 봐왔는데요 첨부된 표는 제2의문자 중 G에 해당하는 열만 U로 표기하지 않고 T로 표기한 것을 볼 수 있었습니다. (ex. 시스테인, UGU -> TGT) 또한 제 3의문자 행도 U가 아닌 T로 적혀있었는데요 검색하였을때도 이런 표는 찾지 못하였습니다. 단순 실수일수도 있지만 제가 모르는 이유가 있어서 이렇게 표기했을 수도 있다는 생각이 들기도 합니다 (식물육종관련서적). 이학관련 질의 커뮤니티 아는곳이 없어 bric에 질의 올립니다...

안녕하세요 여러 연구원분 열심히 연구를 배우고 있는 대학원생입니다. 다름이 아니라 요즘 SDS-PAGE 실험을 하고있는데 staining 이후 destaining시 아래쪽은 색이 다 빠지는데 위쪽은 아무리 오래 빼줘도 안빠지더라구요 ㅠㅠ 무엇이 문제이고 해결방법이 있을지 조언 부탁드립니다~!!!~!~

protein folding에서 dilution refolding 방법을 사용하려고 하는데요. 그 중에서도 pulsed dilution으로 20-fold refolding buffer에 denatured protein sample을 일정량 피펫으로 넣고, stirring 하면서 일정시간후에 다시 넣는 방법을 채택하고 있습니다. 그런데 protocol을 검색해 봐도 예시로 100ul 넣고 1min 기다리는 식으로 넣는다, 이런 식으로는 나와있지 않더라고요. 이미 졸업한 선배가 진행한 실험을 재진행하는 중이라 조언을 구할 선배가 없습니다ㅠ 1) denature protein sample을 refolding buffer에 넣는 양과 기다리는 시간은 어떻게 정하나요? 2) 피펫으로 protein sample을 넣을 때 팁을 refolding buffer 안에 넣은 후 조금씩 돌리면서 분사한다거나, 아니면 그냥 한번에 분사하거나, 위에서 방울방울 떨어뜨리거나 방법의 차이에 따라 유의미한 차이가 있을까요?

안녕하세요, 저는 ELISA kit로 ELISA를 준비 중 입니다. Mouse plasma로 ELISA를 진행할 것인데, Blood로 ELISA외에 해야 할 것이 많아서 ELISA에 필요한 plasma 양 만큼을 미리 소분해놓으려고 합니다.   ELISA를 하기 위해서는, sample의 농도에 따라 적정 수준까지 희석해야 하는 것으로 알고 있습니다.   그런데.. ELSIA가 처음이고 같은 연구실에 알려줄 선생님도 없다보니, 얼마만큼을 dilution해야 되는건지.. 얼마만큼을 미리 소분해놓아야 되는 건지 감이 아예 잡히지 않아서요 ㅠㅠ   1)ELISA Kit에서 나오는 dilution 메뉴얼에 보면, 샘플의 농도를 파악하고 예측하여 Dilution을 해라 라고 나오던데.. 혹시 적절한 농도를 파악하는 팁이 있을까요..? 메뉴얼에 나오는 diltion에서 제일 적은 비율을 먼저 해보는게 좋을까요? 2)GFAP, S100B, pro-BNP, ES(Endostatin) 이렇게 4개를 보려고 하는데, 혹시 해당 Ab들은 잘 검출되는 Ab일까요? 검출이 잘 될수록 dilution 비율을 크게 잡아도 된다고 해서요...   꼭 좀 도와주세요 ㅠㅠㅠ

안녕하세요,  brain IHC-IF을 준비 중인 석사생입니다. 제 질문은 다음과 같습니다.   1)blocking buffer 5% animal serum + PBS-T (0.4% Triton X-100 in PBS) 대신 5% BSA + PBS-T (0.4% Triton X-100 in PBS)로 실험을 하여도 괜찮을까요?   2)제가 작성한 IHC-IF protocol 입니다.  틀린 곳은 없는지, 고칠 곳은 없는지.. 알려주시면 너무 감사할 것 같습니다. 1. Frozen cryo tissue section à air dry, briefly (30min, R.T) // Dry section(60min baking) 2. PBS wash (5 min, R.T) X 2번 3. Draw a circle with a hydrophobic barrier pen 4. Permeabilization buffer (10 min, R.T) X 2번 (1% animal serum +0.4% Triton X-100 in PBS) 5. Blocking Buffer: Add blocking buffer (30min-60min, R.T / Using wet chamber) #Blocking buffer : 5% animal serum + PBS-T (0.4% Triton X-100 in PBS) *While blocking, prepare the primary antibody in Antibody Dilution Buffer (see product website for recommended dilution range). 6. Remove the blocking buffer. PBS wash (5 min, R.T) X 2번 7. Primary antibody: Incubate the slide with the primary antibody. (1-2h, R.T è O/N, 4°C / Using wet chamber) #Dilution of the antibody with ‘Animal free block dilution’. àParafilm 붙이기(solution이 날아가지 않게) 8. 1% animal serum + PBS-T wash (5 min, R.T) X 2번 (Parafilm 조심스럽게 떼기) 9. Secondary antibody: Incubate the slide with the secondary antibody. (1-2h, R.T / Using wet chamber) #Dilution of the antibody with ‘Animal free block dilution’ 10. 1% animal serum + PBS-T wash (5 min, R.T) X 2번 (Parafilm 조심스럽게 떼기) 11. DAPI staining: Add DAPI solution in PBS(10min, R.T) 12. PBS wash (5 min, R.T) X 2번 13. Mount slides and microscope. #For long-term storage, store samples at -20°C or 4°C protected from light.   3)IHC-IF staining시에 DAPI staining을 반드시 진행하여야 하나요? 아니면 counterstaining인 만큼, 선택 사항 일까요?     많은 가르침과 조언 부탁드립니다. 미리 감사합니다 : )

   27c incubator 에서 media에 키우고 있는 SF9 Cell을 팔콘에 넣고 30분간 차량 이동해도 문제가 없는지요? 얼린 stock 은 액체질소에 넣고 운반해봤는데 media에서 자라고 있는 sf9 cell을 일부 팔콘튜브에 담고 차량이동 20~30여분 이동해서  가지고 와서 counting해서 미디어 넣고 계대배양 하는게 괜찮은지 궁금합니다. 감사합니다.

안녕하세요. 제품개발에 필요한 표준물질을(균주 아님)구입해야 하는데요. ATCC에서 Cat.no 확인해서 유통?업체같은 곳에 번호를 알려주면 되는걸까요ㅠㅠ 표준물질 구입은 처음인데 물어볼 곳은 브릭뿐이라.. 고수님들 도움이 필요합니다ㅠㅠ

안녕하세요 새내기 대학원생입니다.. 다름이 아니라 최근 buffer change 와 단백질 농축목적으로 acetone ppt 을 실시하게 되었는데 acetone ppt 하고 침전된 단백질들이 다시 잘 풀어지지가 않습니다. 계속 가루처럼 남아있다고 해야할까요 상층액을 모두 딴 다음 8M Urea containing buffer 넣고 digestion 하는데 트립신까지 다 쳐도 가루는 계속 남아있네요.. 유기용매로 침전된 단백질은 다시 잘 안풀어진다는 글을 본적이 있는데 그렇다면 loss가 너무 많은거아닙니까? ㅠㅠ    잘 풀어지는 방법 뭐 그런거 있을까요? 감사합니다..

안녕하세요. 현재 연구실에서 이때까지 배웠던 방법과 다른 방식으로 검량선 fitting하여 미지의 물질의 농도를 계산하여 그렇게 하는 경우도 있는지, 해당 방식이 이해가 되지 않아 문의 차 글을 올립니다. 제가 해왔던 방식은 검량선을 linear regression fitting하여 미지의 물질의 농도를 계산해왔었는데, 현재 연구실에서는 검량선을 saturation 되는 농도 범위까지 포함하여 nonlinear regression fitting으로 미지의 물질의 농도를 계산하더라구요. 미지의 물질은 linear range에 들어오는 것도 있고 saturation 지점에 들어오는 물질도 있었습니다. 해당 물질들을 모두 nonlinear regression fitting 후 계산하시더라구요. 위 방식이 정확하지 않은 것 같은데.. 윗분께서 해당 방식으로 가르쳐주셔서 그 방식으로 해야할 것 같은데... 너무 마음에 걸려 문의드립니다. 이 방법으로 농도 정량을 해도 정확할까요?

안녕하세요 농화학과에서 공부중인 학부연구생입니다. comparison은 2개 genotype, 2개 stress level, inoculation 유무로 2*2*2해서 총 8개 treatment로 벼작물로 protemics 공부하는중입니다 mascot에서 나온 empai로 엑셀에서 두개 트리트먼트씩 해서 fold change를 구하고 각 comparison끼리 비교를 해서 모든경우의 수를 공부해봤는데 같은 처리구로 mRNA seq를 공부하다보니  CLC work bench에서는 동시에 모든 treatment를 GUI에 넣고 control로 inoculation group, stress level을 따로 설정해서 돌릴 수 있더군요..  clc에서 한거처럼 proteomics에서도 모든 treatment를 동시에 넣어서 분석해보고싶은데 mascot이나 maxquant나 preseus같은 프로그램에서 이 같은 분석이 가능할까요?? 아시는분 있으면 부탁드리겠습니다ㅜㅜ 감사합니다! qwerty7710@naver.com

 Sandwich ELISA 를 진행 하고 있습니다.  코팅은 rt 90min 그외 blocking, sample, 2nd antibody 반응은   rt에서 60min 으로 진행 하고 있습니다.    그런데 2nd antibody 반응시간을 2시간 정도 반응 했을때 실험결과에 영향을 미치나요?  

안녕하세요   HCP ELISA 할 때 희석 버퍼로 PBS 사용해도 문제 없을까요? BSA가 안들어 있어도 항원-항체 결합이니까 문제 없지 않을까 싶은데 혹시 HCP ELISA나 일반 ELISA 해보신 분 댓글 달아주실 수 있을까요?   BSA 포함된 buffer 쓰는게 non-specific binding 줄이려고 사용한다고 알고 있는데 PBS 쓰면 결과가 너무 상이하게 나올까 해서요ㅠ

자이모그래피 밴드가 반대로 나오는 경우는 무엇이 문제일까요? 48시간 반응해서 밴드가 안나와서 5일 동안 인큐베이션했구요 gel 농도와 buffer 농도는 이렇게 제조했고 런닝은 120v로 2시간 내렸어요  어쩔땐 잘 나오고 어쩔떈 안나오고 그러네요.. 10% SDS-PAGE gel 0.1% (1mg/ml) gelatin Stacking gel D,W 3 mL D,W 3.08 mL 1.5M Tris-HCl pH8.8 2.5 mL 0.5M Tris-HCl pH6.8 1.25 mL 30% POLYACRYAMIDE 3.3 mL 30% POLYACRYAMIDE 0.67 mL 10%SDS 100 μL 10%SDS 50 μL 10% APS 100 μL 10% APS 50 μL TEMED 10 μL TEMED 5 μL Gelatin(10mg/ml) 1 mL   10X Developing buffer 37℃ 4-16시간 incubator 500mM Tris(121.14) (pH7.5) 30.285g 2M NaCl(58.44) 43.8g 50mM CaCl(110.98) 2.7745g D.W up to D.W 500ml  

  제가 보는 target 단백질이 핵안에서 확인이 돼요  immunostaining 을 해도 그렇고, cytosol/nuclear fraction에서도 그렇고  다 확인이 되는데요 (아직 알려지지는 않은것 같아요)   그런데 사이즈가 한 10-20 kDa 정도 작게 나와요..  이게 가능할까요? 이론적으로;;;;;;;;;;;  작게 나오면 왜 작게 나오는 걸까요?????