안녕하세요. 여러가지 peptidase를 이용해서 특정 peptide를 자른 뒤 TLC (Thin Layer Chromatography)를 수행한다면 어떻게 잘렸는지 확인이 가능할까요? 예를들어 Peptide는 LLVYGGLAAF라고 가정했을때, A peptidase cutting 시:  L/L/VYG/G/LAAF B peptidase cutting 시:  LLVYGGLA/A/F C peptidase cutting 시:  LLVY/GGLAAF 위처럼 잘린다면 TLC plate에 amino acid와 small peptide가 구분되어 나타나는지 궁금합니다. 미리 답변 감사드립니다.

지금 단백질관련 실험을 하고있습니다.  예전보다 발현량이랑 회수량이 적어서 어디가 문제인지 알고 싶어서 올립니다.    BL21(DE3)에 transformation해서 그걸 stock로 -80도에 보관한것으로  incubation 부터 진행하고 있는데...  buffer change도 잘안되고 회수량도 적더라구요...  다른분에게 여쭤보니 배지의 량을 늘려보라는 분도 있고 stock를 사용하지  말고 실험할때마다 transformation 해서 신선한 상태로 하라고 하시는데...   BL21(DE3)으로 stock를 한 2주전에 만들어서 -80도에 보관한것이 문제가 있을까요... BL21(DE3) 의 장단점도 알려주시면 감사합니다.  

안녕하세요 human gingival fibroblasts에서 MMP활성을 보려고 gelatin zymography를 진행중입니다. MMP를 보기 위해서 conditioned medium을 acetone precipitaion하여 샘플을 준비하고 있는데요. acetone precipitaion해서 모은 pellet이 D.W에는 잘 녹지 않더라구요.. 그래서 최대한 녹인 후 샘플 상등액만 loading 하고 있습니다. 문제는 이렇게 loading한 후 결과를 확인하면 MMP활성은 나타나는데 western blot처럼 b-actin이나 a-tubulin같이 같은 양의 단백질이 잘 loading 되었는지 확인할 방법이 없는 것입니다. (최대한 같은 양의 medium으로 sampling 했지만 pellet이 생기기 때문에 같은 양의 protein이 sampling 됐는지 확신할 수 없음..) gelatin zymography를 수행할 때 이를 확인할 수 있는 방법이 있을까요? 혹은 acetone precipitaion으로 모인 pellet을 완전히 녹일 수 있는 방법이 있을까요?

저희가 원하는 단백질을 얻기 위해서 세포를 터뜨려야 하는데, 큰비커에 물과 얼음, 시료가 든 conical tube를 같이 넣고 물에 sonicater의 초음파 나오는 부분을 박고 작동시키면 tube안까지 잘 전달이 되는건가요?

안녕하세요. lowry method를 통해 단백질 정량법을 배우고 있는 학생입니다. 다름이 아니라 실험 과정상 의문점이 생겨 질문드립니다. lowry method를 위한 시약을 제조하는 과정에서 NaOH에 녹인 Na2CO3와 (sol A) DW에 녹인 CuSO4 5H2O(sol B),  DW에 녹인 sodium 용액(sol C)을 변성의 가능성을 막기 위해 사용 직전에 조제하여 사용한다고 배웠습니다. 그런데 용액을 섞는 순서가 A - C - B  여야 한다고 하는데, 왜 반드시 이 순서대로 섞어야 하는 것인가요? 알카리성 용액을 기반으로 구리가 반응하기 때문인건지 다른 이유가 있는 것인지 궁금합니다. 

안녕하세요.  이번에 천연물에서 특정 단백질 제거에 대한 프로젝트를 진행 하고 있는데요 사이즈가 작은 특정 단백질(MW 111)의 제거를 목적으로 1kb daiysis membrane을 사용해서 제거 해보려고 하였습니다. buffer를 DW로 사용해서 실험 해봤는데 사이즈가 1kb 미만인 단백질이 제거 되는것 뿐만 아니라 사이즈가 2kb 이상 되는 단백질도 상당량 제거가 되어 버려서 다른 방법을 강구하고 있습니다. anti body beed 방법도 생각해봤는데 실험비가 고가로 될것으로 예상되어 보류 중입니다.  혹시 다른 방법이 있으면 조언 부탁드리겠습니다.  감사합니다.  

안녕하세요! 실험하다가 의문이 든점이 있어서요  현재 nad/nadh assay를 하기 위해 kit를 주문하고 protocol을 확인한 결과  tissue sample을 제작하는데 dounce homogenizer을 사용해서 하라고 나와서요 그런데 현재 랩실에 tissue lyser 밖에 없는데.... tissue lyser를 사용해서 sample을 제작하면 nad/nadh assay 하는데 영향을 많이 줄까요?

안녕하세요 혈액(전혈)에서 단백질 추출해서 western blot 해보려고 합니다. 조직이나 세포에서는 해봤는데 혈액에서 단백질 추출하는 방법은 찾아봐도 잘 안나오네요.. 혹시 해보신 분 있나요? 방법이 궁금합니다!

단백질 정제 프로토콜에서 Ni-NTA bead와 protein을 4도씨에서 rotator를 이용하여 binding한 후  column에 내리는 과정에서 rotator를 이용하기 전 단백질과 bead를 pipetting 하면 안되는 이유가 있을까요..?

안녕하세요.   protein purification을 하기 전, bacteria cell pellet 획득 후, cell pellet을 깨고 total protein에 대한 정량을 BCA assay를 통해 진행하고자 합니다.    그런데 기존에 쓰던 RIPA buffer (cat # R4100-010, genDEPOT)을 넣고, mamalian protein extraction을 하던 방식처럼 하더니 단백질이 분리되지 않고, pellet이 그대로 가라앉는 것을 확인하였습니다.   그래서 bacterial cell pellet lysis buffer로 검색되는 RIPA buffer (cat # WSE-7423, atto)를 발견했는데....RIPA buffer 자체는 큰 차이가 없다라고 알고 있던 저는 DNase I과 protease inhibitor 외에는 차이를 발견하지 못했습니다.    단백질의 발현 여부 확인을 위해 정량 후 양을 늘려가며, 목적 단백질 확인을 하는 것이 목표이기 때문에 저는 1) 제가 알고 있는 부분에 있어 틀린부분이 있는지 2) 없다면 저 2가지만 더 기존에 RIPA buffer에 추가 하면 되는 것인지 추가를 하게 되면, 권장 농도까지 알고 싶습니다.   조직 실험한 하다가 갑자기 박테리아 관련 실험을 하려니 모르는 것이 많습니다. 많은 선배님들의 이해와 따뜻한 답변 부탁드립니다.   읽어주셔서 감사합니다.

안녕하세요 muscle dissection 관련해서 여쭤보고자 합니다. 실험해보신 분들은 어떻게 하나 여쭤보고 싶습니다. 1. 조직을 western blot용, mRNA 용으로 나눌 예정인데 조직의 어느부위를 사용하는지에 따라 실험값이 다르게 나올거같아서 보통 어느부위를 사용하시는지 여쭤보고 싶습니다. 2. IHC, H&E, confocal 용으로 조직을 남겨두려고 하는데 perfusion 후 pfa에 고정시켜 두기만 해도 될까요?

실험을 계획하고 있는 과정 중에 있는 사람입니다.  Bradford 단백질 정량법을 처음 해보는데, 키위의 단백질 분해 효소 능력을 확인해보고 싶어서요. 돼지고기 후지 부위에 키위 용액을 처리한 것을 실험군으로 , 증류수를 처리한 것을 대조군으로 두려고 하는데요. Coomassie Brilliant Blue-250을 실험군, 대조군에 각각 넣고 시간이 변한 후 시약의 색이 변한 것에 대해 흡광도 측정을 하는 것이 본 실험의 최종 목적입니다. 그런데 키위를 처리할 경우에는 키위의 색깔이 흡광도에 영향을 끼치지 않을까요 ? 이것을 어떻게 보정할 수 있을까요 ,,,?

콩의 단백질 정량을 위해 lowry 단백질 정량법을 세팅하려고 하는데 시료 전처리를 어떻게 진행하여야 하는지 막막하여 이렇게 질문드립니다. 우선 식물체는 여타 phenolic compounds에 의해 lowry 정량 시 정확한 정량을 방해할 수 있다고 들었습니다. 때문에 TCA ppt하여 정량하는 것을 고려하고 있습니다. 하지만 시료 내 지질도 많아 이것도 변수가 될수가 있어 보이는데 이를 제거하기 위한 washing과정이 필요할까요? 아니면 ptt만 해도될까요? 전에 일하던 곳은 e.coli 단백질 찍을때 그냥 pbs에 깨고 supernant를 가지고 정량했었는데 막막하네요. 혹시 식물체 가지고 단백질 정량 실험했던 protocol 가지고 계신분 있다면 고견부탁드립니다.

안녕하세요, 요즘 ip실험을 하고 있는 석사생입니다. 저가 ip에 사용하는 비드가 Pierce Protein A/G Magnetic Beads  을 사용하고 있습니다. 이 비드를 사용하시는 분들 중 프로토콜 대로 pH을 이용하여 Elution하는것이 더 효율적인지 아님 2x sample buffer을 바로 넣고 70'c에 끓여서 하는것이 더 효율적인지 좋은 결과가 있는 경험이 있는 분들의 조언이 있으면 합니다.  

안녕하세요 현재 3학년 2학기째 재학중인 학부연구생입니다 현재 BL21(DE3)균주에 형광단백질 (mCherry와 다른걸 붙여 만든 단백질입니다 교수님께서 만드신거라 자세한 사항은 생략하겠습니다) 플라스미드를 넣은 후 키워 lysis 한 뒤 protein extraction을 하였습니다 Induction도 잘 되었고 protein 추출 후에 UV램프로 확인하였을 때도 잘 발현된 것을 확인 하였습니다 그 후 His-tag purfication을 통해 단백질 정제를 진행하였는데요 문제는 Binding buffer, wash buffer에 단백질이 거의 추출되고 Elution 후에 단백질에는 형광도 발현되지 않고 브래드포드를 통해 확인한 결과 농도 또한 낮았습니다 현재 레진은 thermoscience 제품을 사용하고 있습니다 카탈로그 넘버는 88221입니다 buffer의 조성의 경우는 제품의 프로토콜 그대로 진행하였으며 그전 LGG protein을 추출할 때도 프로토콜대로 진행하였을 때 잘 되었는데 이번에 LGG 또한 Elution이 되지 않았습니다 다른 선배들이 뽑으셨을 땐 프로토콜 그대로 했을 때 문제가 없으셨다고 해서.. 저의 손의 문제거나 버퍼를 잘 못 만든것으로 추측을 하고 있습니다 혹시 buffer의 이미다졸 양을 낮추면 제대로 Elution이 될까요? binding 버퍼는 10mM의 이미다졸, wash 버퍼는 25mM의 이미다졸, Elution 버퍼는 250mM의 이미다졸을 사용중입니다 빨리 정제를 해야 다음 스텝으로 넘어갈텐데 마음이 조급하네요ㅠ ㅠ ..

prep HPLC로 peak의 fraction을 받아와서 동결건조를 시켰는데, 이 단백질을 최대한 오래 보관하면서 처리 실험에 사용하려면 보통 어떤 식으로 보관하나요? prep HPLC를 했던 조건의 용매로 녹여도 괜찮은건가요 (비슷한 단백질을 정제한 논문의 HPLC 조건임) ? 아니면 추출시 사용한 유기용매에 녹여둬도 되나요..? 그 단백질이 안정한 버퍼 조건을 찾아봐야하나요? 단백질을 주로하는 랩이 아니라 조언이 필요합니다 ㅠㅠ

안녕하세요, 매번 검색만 하다가 처음 질문 남겨봅니다.  protein extraction을 하고 정량을 했는데 protein 농도가 터무니없이 적게, 거의 안 넣었다고 봐도 될 정도로 나왔습니다. 샘플마다 값도 너무 튀고요.. 동일한 조건으로 이전에 실험했을 땐 이정도로 적게 나오진 않았어서 매우 당황스럽습니다.. 제가 복기 해봤을 때 기존과 크게 다른 점이 없어서 너무 답답합니다. 앞으로 이 분야를 더 배우고 싶은데, 단백질 추출도 못하면 무슨 실험을 진행할 수 있겠나 싶어서 막막합니다. 제가 아직 학부생이라 부족한 점이 많습니다... 제가 한 실험 과정과 정량 후 결과값은 아래에 첨부해두었습니다. 잘 부탁드립니다. lung cancer cell 4*10^5으로 6well에 seeding >> 18h 후 80%정도 찬 것을 확인 후, 시료처리 >> 24h 후 protein extraction <extraction> 1. media suction 후 well당 cold DPBS 1mL로 washing >> suction후 cold DPBS를 well당 1mL씩 넣고 스크래퍼로 긁어준 뒤 따서 e-tube로. 3000rpm, 5min, 4℃ centrifuge ; 여기까지 진행했을 때 처리한 시료 농도가 높았던 샘플 하나(B3라고 하겠습니다)가 pellet이 안 보였습니다.   2. 상층액 suction 후 RIPA solution 넣고 강하게 피펫팅 >> 강하게 볼텍싱 >> ice에 꽂아놓고 20min incubating(5min 간격으로 강하게 볼텍싱 해줬습니다.) ; RIPA+P.I.+PMSF를 1:0.01:0.001로 섞어서 RIPA solution을 만들었고, 위에서 언급한 B3는 20uL로, B3를 제외한 나머지 샘플들은 80uL로 pellet을 풀어줬습니다.  피펫팅은 100uL짜리 피펫으로 거품이 날 정도로 세게 여러번(제 체감상으로는 한 40번정도 피펫팅한 것 같아요)했습니다.   3. 15000rpm, 20min, 4℃ centrifuge >> 상층액만 따서 새 e-tube에 넣기 ; centri 끝나고 나니까 첫 centrifuge 사용때보다는 줄었지만 pellet이 보였고, B3에서도 아주 조그만 pellet이 보였습니다.  상층액은 80uL로 푼 샘플들은 75uL, 20uL로 푼 샘플은 15uL정도 딸 수 있었습니다.   4. 정량 1, 2, 3, 4, 5는 standard A1~3, B1~3은 sample입니다.(A1, B1은 CTR)   1 2 3 4 5 A1 A2 A3 B1 B2 B3 DDW 18 14 10 6 2 18 18 18 18 18 18 RIPA 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0 sample 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 BSA 0 4 8 12 16 0 0 0 0 0 0 DC A 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 DC B 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800 단위 : uL 표와 같이 조합 후 볼텍싱해주고 상온에서 15min incubating >> 96well에 well당 200uL씩 넣고 750nm 흡광도 촬영   5. 계산 표 윗줄은 최근 실험 결과, 표 아랫줄은 이전 실험 결과입니다. R^2   A1(CTR) A2 A3 B1(CTR) B2 B3 0.9906 1uL당 농도 0.579531 0.265105 0.295931 1.424168 1.07275 0.172626 0.9902 1uL당 농도 1.005952 0.809524 0.815476 2.029762 1.863095 1.369048 현재 이런 상황입니다. 저희 랩실 사람들이 80uL로 풀었을 땐 대부분 람다당 농도가 1은 넘습니다. 저의 고민은 1. 왜 람다당 농도가 거의 0에 수렴하는가? 2. 왜 람다당 농도가 샘플마다 이렇게까지 차이가 나는가?(추출 전 육안으로 cell상태 확인했을 때 confluency랑 비례하지도 않음..) 이렇게 두 가지 입니다. 제발 문제점을 파악해서 잘 해결될 수 있으면 좋겠습니다..

4.8. Preparation of Cytosolic and Nuclear Extracts  Cells were treated and harvested as described above, lysed with hypotonic lysis buffer [25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulphonic acid (HEPES; pH 7.5), 5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, and 5 mM dithiothreitol (DTT)], and incubated for 15 min on ice. NP-40 (2.5%) was added and the cells were lysed for an additional 10 min. Nuclei were collected by centrifugation at 7500× g for 15 min at 4 ◦C. The supernatant was collected as the cytosolic fraction. Nuclear proteins were resuspended extraction buffer (10 mM HEPES, pH 7.9, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, and 0.2 mM DTT) and incubated for 20 min at 4 ◦C. Extracts were centrifuged at 16,000× g for 10 min, and protein levels were determined using a BCA protein assay kit (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) according to the manufacturer’s instructions. Both fractions were then used for Western blot analysis.   라고 나와있는데, 이처럼 세포질 내의 단백질을 추출하고, 핵 내의 단백질을 따로 따로 추출할 때, 이 때 사용되는 lysis buffer에 의해 핵막은 붕괴가 안 되는걸까요? 어떻게 선택적으로 같은 '인지질'에 영향을 주는 buffer 임에도 불구하고 핵막에 손상을 주지 않고 핵 내의 단백질을 얻을 수 있는지 원리가 궁금합니다!   좀 쉽게 상세히 설명해주시면 감사하겠습니다! 부탁드립니다!!

200-300ulm사이즈의 polyethylene의 표면에 biotin을 코팅하고 싶습니다. 정확한 protocol을 알려주세요. 또한 biotin을 일부 면에만 특이적으로 코팅할 수 있는 방법도 있다면 알려주세요.

고2구요 실험 하고 레포트를 써야해요 ㅜ 추상적이라 구체적으로 계획해야 하는데 주제는 가장 늦게 부폐되는 마스크는 무엇인가에요. 마스크 4개 정도 준비하고 각 마스크에 사과를 넣습니다 . 사과는 알콜을 묻힌 사과 , 비누를 묻힌 사과, 식초 , 가글? 총 4개 생각중이에요. 이 중에서 소독기능이 나은 것을 찾는게 ? 목적이긴 한데 실험 방향성과 실험 목적 절차를 어떻게 잡아야할지 너무 막막해서요 ㅜㅜ 생물 과학 잘 하시는분들 좀 도와주세요 ㅜ급한거랍니더...