1: 1kb DNA Plus marker 사용 2: DNA 50ng/ul  3: DNA 10ng/ul  4: DNA 5ng/ul 5: DNA 1ng/ul   DNA는 DH5a Genomic DNA 이고  186.3ng/ul > 260/280: 1.88                    260/230: 1.06 입니다. 그래서 각각 희석했을때 50ng/ul > DNA: 2.7ul, DW: 7.3ul 10ng/ul > DNA: 1.1ul, DW: 18.9ul 5ng/ul > DNA: 0.54ul, DW: 19.46ul 1ng/ul > DNA: 1ul. DW: 185.3ul 했습니다. primer의 경우에는 primer - F : 12.1nmol. primer - R: 12.9nmol로 Primer-F 1ul + DW 121ul , Primer-R 1ul + DW 129ul로 100pmol/ul로 stock을 만든다음 다시 Primer를 5pmol/ul로 working을 만들었습니다. buffer는 2X PCR master mix를 사용했고 구성은 DW 740ul + 10Xreaction buffer 200ul + 10mM dNTPs 40ul + Tag pol (5 units/ul) 20ul을 사용했고 vortex mix와 spleen down을 해주었습니다  혹시나 해서 primer를 다시 희석하기도 했고 2X PCR master를 다시 제조해봤지만 결과가 똑같이 나왔습니다. 무엇이 문제일까요? PCR 온도 조건은 95도 : 2분 (30 cycles - 95도: 20초, 62,1도: 40초, 72도: 1분 30초), 72도: 5분으로 설정했습니다. Primer - F Tm : 67.1도 , primer - R Tm: 61.3도 이기 때문에  Annealing을 62.1도로 설정했습니다.   전기영동을 했을때 Agar gel은 1.5% 농도로 사용했습니다. 6X loding dye를 사용해서 DNA 5ul + dye 1ul을 사용했습니다.  

갖고 있는 e.coli stock으로 midi prep을 하려고 하는데요, 얼어 있는 stock을 긁은 다음 액체 배지에 바로 접종하여 배양해도 되나요? 아니면 고체 배지 plate에 streaking 하여 single colony 획득 후 액체 배양으로 넘어가야 하는 건가요?!?

안녕하세요. 현재 실험실에서 실험 공부 하고 있는 대학생입니다. hot-fusion method 통해서 pGR-blue plasmid에 mutated primer pink랑 purple  express 시키는 실험을 하고 있는데, cloning efficiency 확인 중에 궁금한게 생겼습니다 primer sequence 가 혹시 cloning efficiency 에 영향을 미치나요?  해외 대학에서 공부 중인데 명확하게 설명 해주는 사람이 없어서 질문합니다. 

speed님 조언주신데로 Agillent 사 pfu로 조건 바꾸어서 muta 하여서 결과 나와서  이전 글 아래에 결과 올려놓았습니다.   저희가 Dnp1 처리후, Amp+ plate에 chloramphenicol 25mg/ml 20ul를 도포하여 쓰고 있는데, 혹시 양이 많을까요? Amp+를 한 20ml은 넣은 것 같아서요... (제가 만든 것이 아니라...) 확인을 부탁드립니다.   감사합니다.  

attR1 --> attR4로 바꾸는 mutagenesis를 진행중인데, PCR 후 Dpn1처리 하지 않고 chlo를 도포한 Amp+ plate에서  ON 키웠더니 colony가 많이 떳습니다. 그런데, colony 양상이 매우 clear하고 작습니다. 그래서 PCR product에 Dnp1을 처리하고 다시 chlo를 도포한 Amp+ plate에서 ON 키웠더니 colony 비슷한 아이가 한 10개 정도 떳습니다.  그래서 걔들 중 3개를 뽑아서 밤새 Amp+ LB에서 키웟는데 거의 맹물 수준입니다 (chlo없어서 Amp+에서만 키웠습니다.).  원인이 무엇일까요? ㅠㅠ   그리고 Dpn1 처리 하지 않은 것에서 colony 따서 키운 후 sanger에서 가려볼 필요가 잇을까요?

1번은 blank를 잡으려던 d.w라 무시하셔도 되고, 2번이 첫번째 dna sample, 3번과 4번이 두번째 dna sample입니다. 1. ng/ul의 값은 순도인가요? 2. 첫번째 샘플과 두번째 샘플중 어느게 값이 잘나온건가요? 해석이 잘 안돼서요ㅠㅠ 두번째는 전기영동 결과인데요, 마커를 제외한 다섯칸에 모두 sample을 넣었는데 그중 두개는 나오지 않았습니다. 3. 샘플 두개가 안나온 이유가 뭘까요? 4. ladder에 구멍이 뚫렸는데 이유가 뭘까요? 5. sample들은 500bp가 나온게 맞나요?   귀한 시간 내주셔서 감사합니다. 너무 실험 초보라 구글링해도 기계만 다르다 하면 값을 계산하기가 어렵네요... 수준 낮은 질문이라 보이실수도 있지만 알려주시면 정말 감사하겠습니다ㅠㅠ

green gate cloning 중인데 cloning이 처음입니다 mod c인 cds를 만들던 중 프라이머 Forward에 atg를 안붙이는 실수를 하여 처음부터 다시 프라이머를 짜서 처음부터 다시 짜서 pcr을 시행 하였습니다. 그런데 그전까지는 pcr이 잘 되었는데 atg를 붙이고 나서부터는 pcr이 되지 않습니다. template의 bp는 2370이고 cdna 사용 중입니다. 실수한 프라이머 forward는 AACA GGTCTC A GGCT GAGTCCTGCAATTGCATT  였고 tm은 60.2도 였고 새로 짠 primer forward는 AACA GGTCTC A GGCT ATGGAGTCCTGCAATTGC TM은 60.9도 입니다 리버스 프라이머는 AACA GGTCTC A CTGA CCCCCTCTTCTCTCTCC에  TM은 60.2도 입니다 pcr 조성 template    cdna          1μl primer(F+R 각 10pm)    1μl 5x HF Bfr                    2μl polymerase(phusion)     0.1μl dNTP                         1μl DW                           5μl 입니다 pcr condition은 98도씨    30s 98도씨     10s 60도씨     30s 72도씨     1m 15s cycle은 34번입니다. 실수한 프라이머에서는 PCR이 바로 나왔는데 ATG를 다니까 PCR을 계속 했는데 안나오고 T.M도 57~61도까지 0.5도씩 올려가며 다양하게 하였는데도 나오지 않았습니다. EXTENSION TIME을 1분 15초로 한 이유는 실수한 프라이머를 돌렸을 당시 저 시간대로 해서 나왔기 때문입니다. 그리고 밑에 사진에서 왼쪽에서 첫번째가 LADDER이고 두번째부터 5번째 까지가 59도씨에서 PCR6번째부터 마지막까지가 60도씨에서 PCR한 것 입니다. 같은 온도에서 왜 PCR를 여러개 한 이유는 저도 잘 모르겠습니다....... 계속 실수하다보니 멘탈이 터져서 그런거 같네요....

Taq DNA polymerase를 발현 및 정제하고 이를 이용하여 pcr과 전기영동을 진행하였습니다. 정제한 taq의 농도를 serial dilution하면서 총 5개의 샘플을 만들고 전기영동을 진행하였는데 가장 결과가 진하게 나와야할 1x에서는 아무런 결과가 나오지 않고 1/4x와 1/16x 샘플에서만 dna가 발현되었습니다. 아무리 오류의 원인을 생각해봐도 마땅한 이유를 찾지 못하여 질문을 올립니다. 혹시 원인이 무엇일까요? 사진 상에서 오른쪽 결과입니다. 참고로 왼쪽의 결과와는 taq polymerase를 제외한 나머지 화학품(primer, buffer 등)은 동일한 master mix를 사용하여 실험을 진행하였는데 왼쪽 결과는 제대로 나오고 오른쪽만 이상하게 나온 것이 의문입니다.

안녕하세요. A549 cell을 이용하여 EGFR-WT을 detect을 하고 싶은데,  NCBI에서 EGFR-WT PASTA 정보를 찾기 어렵네요,,,  A549 cell로 부터 DNA extraction을 진행 후 EGFR-WT primer를 디자인해 PCR을 진행할 예정입니다.   감사합니다.

안녕하세요! MALDI TOF를 이용해서 Mass 분석 실험을 진행하려고 합니다. DNA 시료를 농도별로 희석해서 MALDI에서 찍어볼려고하는데, 최종부피에 Matrix 부피까지 고려를 해서 희석해야하나요? 예를들어, 내가 0.8%의 DNA 수용액을 가지고 있고 이를 총 부피 100uL로 10배 묽히고자 할 때, DW(Diluited Water) 90 uL + DNA Sample 10 uL 를 혼합 해 최종 Sample 희석액을 만들잖아요?   근데 마지막에 Matrix와 Sample 희석액을 1:1 비율로 섞는다면, Sample 희석액의 전체 부피가 변하니까 농도도 하지 않나 하는 것이 저의 우려입니다.   MALDI 실험을 위해 전처리를 처음해보긴 하는데, 보통은 Matrix와 섞을 때의 부피는 고려를 안해주는게 맞나요, 해주는게 맞나요?

  Oligonucleotide의 MALDI TOF MS 분석과 관련하여 문헌조사를 하는 중입니다.Oligonucleotide 합성도 처음이고 MALDI도 처음이라 좀 시행착오중이긴한데 그 과정에서 궁금한게 생겨 질문 글 올려봅니다.   아래와같이 올리고의 합성에 따른 과정을 MALDI TOF로 찍어봤을 때 Detritylation에 따라 5'의 보호기인 DMT가 떨어지는건 알겠는데, 1. 그렇다면 Mass를 나타낸 우측 결과에서는 d1 부분에대해서만 -DMTr을 해주면 될텐데 왜 d2,d3도 모두 -DMTr을 해줘서 질량값을 나타내나요??? 2. Main Peak 외에 Small Peak의 질량에 대해서는 그냥 부산물이겠거니 하고 무시해도 되는 건가요? (예를들면, Coupling 하고 나서의 Mass Peak을 보면 1226.6 옆에 1242.4, 1264.8 등의 마이너한 Peak들)     답변부탁드립니다!!!! (참조 논문: NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES & NUCLEIC ACIDS, 20(4–7), 951–954 (2001))  

균주안에 plasmid가 들어갔는지 확인해 보기 위해 gDNA 를 뽑았는데요. pcr을 통해서 확인해 보고 싶은데 plasmid 의 원하는 유전자 부분을primer로 짜서 pcr을 통해 원하는 유전자 size가 나오는지를 확인하면 되는건가요???

안녕하십니까. 다름이 아니오라 현재 RAW.264.7 Cell에 LPS를 처리하고 샘플을 treat하여 tnf-a 발현정도를 확인하기위해 cDNA 전기영동 하였습니다. 사진에서 보시면 marker가 자꾸 덜내려가는 모습을 보여주어서 질문드립니다.. 전기영동은 약 25분 진행하였습니다.  마커는 100bp입니다

DNA 영동에 사용하는 TBE를 만드려하는데요,    Tris, boric acid, EDTA 가 들어간다고 하여서  TRIS 견적을 보냈는데 tris,   tris aminomethane 두 종류가 왔습니다.  tris,   tris aminomethane는 다른 건가요? 혼용 가능한지요?  

안녕하세요. A549 cell을 이용하여 EGFR-WT을 detect을 하고 싶은데,  NCBI에서 EGFR-WT PASTA 정보를 찾기 어렵네요,,,  A549 cell로 부터 DNA extraction을 진행 후 EGFR-WT primer를 디자인해 PCR을 진행할 예정입니다.   감사합니다.

혹시 pcDNA3.1-PCDH10을 가지고 계신 대학이나 개인 있으신가요? 이번에 pcDNA3.1-PCDH10을 이용하여 transfecton을 진행하려고 하는데, 국내에서 받고싶어.. 혹시 있으신분들 댓글 남겨주시면 감사드리겠습니다..

바이러스 strain 분류가 Wa-like, DS-1 like 로 나뉜다는데 Wa랑 DS-1의 의미가 뭘까요ㅠㅠㅠ

안녕하세요 저는 방사선을 세포에 조사해 immunofluorescence로 gamma H2AX를 관찰하는 실험을 하고 있습니다. 이번 실험에서 세포 주기를 특정 지점에 고정시켜서 세포주기에 대한 변수를 없애고 관찰하고 싶은데 혹시 세포 생장을 특정 주기에만 머물도록 하는 방법을 아시는 분이나 관련 논문을 아시는 분이 계실까요? 사용하는 세포들은 Rat diencephalon, Rat gliosarcoma 입니다. 감사합니다.    

안녕하세요, mouse genotyping을 하려는데 PCR condition에 문제가 있는것인지 band가 이상하게 떠서 여러번 시도끝에 도움을 구하고자 글을 씁니다 ... 증폭되어야 할 서열의 길이는 WT=500bp, MT=163bp 입니다. primer 길이는 20mer 이구요, PCR condition은 다음과 같습니다. (The Jackson laboratory protocol 24678 을 참고하였습니다) 94℃/3min→[ 94℃/15sec→ 65~60℃/15sec (touch down)→ 68 ℃/30sec] x10 cycles → [ 94℃/15sec→ 60℃/15sec→ 72 ℃/30sec] x28 cycles→ 72℃/10min

DNA cloning을 하기 위해서 enzyme cut이후 blunt end를 만들고 gel extraction kit의 filter tube에 넣고 washing 후 elution하였습니다. 그리고 nano-drop측정을 하였는데 loss가 너무 많이 일어나서 다시 진행하였습니다. -enzyme cut 이후에도 gel extraction kit로 DNA만 얻었습니다. -한 쪽만 blunt end를 만들기 위해 enzyme cut시 잘려나가는 부위는 없고 linear 형태가 됩니다. 이번에는 enzyme cut만 하고 이전과 같은 방법으로 DNA를 얻었는데 2ug을 사용했던 DNA의 양이 약500ng만 남게 되었습니다. 주변에 물어보니 이상이 없는 것 같은데 왜 그러냐는 소리를 듣다가 브릭에 올려봅니다. cloning에 대하여 아는 것도 많이 없고 머리 싸메다가 올립니다. 고수님들 도와주시면 감사하겠습니다.