안녕하세요! 지금 조직 염색 하려고 하고 있는데   슬라이드에 조직 붙인 다음에 Antigen retrieval 어떻게 진행하시나요?   큰 비커에 슬라이드를 다 넣고 전자레인지에 돌리라고 많이 말씀하시는데 ㅠㅠ 혹시 슬라이드가 겹쳐도 되는 건지.... 걱정 되어서요.. 그리고 전자레인지로 antigen retrieval 할 때 저는 해동 5분씩 4-5번 (총 20-25 분)하는데 끓진 않고 뜨거운 정도인데 괜찮나요? Abcam protocol 보면 boiling하라고 되어있는데 슬라이드 랙(carrier)에 꽂아서 돌리다 보니 버퍼는 아낄 수 있지만 끓으면서 2-3분만 되도 다 증발되어서 ㅠㅠㅠ    의견 부탁드립니다 ㅎ

안녕하세요!   현재 mouse brain에서 IF staining을 시도하고 있는데요..   먼저 brain은 PFA 고정 후 Parrafin으로 embedding 하였습니다. 선배랑 제가 따로 section을 진행하였고, sample 모두 받아서 제가 IF staining을 하였습니다. 선배는 5 um으로 section을 하였고 저는 8-10 um으로 section을 진행하였는데요. 일반적으로 parrafin section의 경우에는 5-8 um로 많이 한다고 하더라구요. IF staining 결과 (IF staining 모두 한번에 진행) 선배 slide에서는 signal 이 굉장히 약하고 specific 하게 staining이 되지 않았습니다(거의 staining이 안 되었다고 봐도 무방). 조직 염색의 경우 section이 얇으면 얇을 수록 resolution이 좋고 깔끔하게 data가 나온다고 생각했는데 조직에 따라서는 두꺼울 수록 결과가 잘 나오는 경우도 있나요?  제가 8-10 um로 section을 다시 해서 IF staining하는 게 trouble shooting 이 될지 궁금합니다. 모든 step은 똑같은데, section한 사람만 다르니 ㅠㅠ..   그리고 paraffin section의 경우 8-10 um가 mouse brain 혹은 lung 보기 너무 두꺼운지도 의견 부탁드립니다 ㅎㅎ

안녕하세요  mast cell 관찰을 위해 toluidine blue 염색을 했는데 mast cell 관찰은 처음이라 여러논문 참고해보니까 진피층의 짙은 푸른빛~보라빛을 띄는 점같은 것을 counting 하더라구요  그래서 저두 그렇게 진행을 하려고 하는데 이 방법이 맞는 방법인지, 사진 속 빨간 동그라미 속 점들이 mast cell이 염색된 것이 맞는지 확인부탁드립니다..!!    

안녕하세요, 현재 재료공학부에서 유기전자물질을 개발중인 대학원생입니다. 소리마당에도 질문글을 올렸으나 나중에 보니 실험 QA 항목이 따로 있어서 한번더 올리겠습니다. 조금 급해서요. 최근 새롭게 합성한 물질을 implantable device용으로 사용하기 위해 생분해성을 측정하려고 합니다. 허나 제 주변 대부분의 연구자들이 재료공학만을 하시던 분들이라, 해당 방법에 대해서 굉장히 막막한 생각이 듭니다. 개인적으로 생각하였을때는 쥐에 먹이거나 피부 밑 층에 주입하여, 일정기간 이후 소변을 받아 정말로 해당 물질이 잘 나오는지 검사를 하는게 맞는 것 같은데, 말을 쉽지만 정확한 프로세스나 방식을 전혀 몰라서 답답합니다. 게다가 저희는 공과대학측이라, 생명공학 혹은 의과대학과 co-op을 통해 데이터를 받아야 할 것 같은데 이 부분도 국내 어떤분이 이런 연구를 하시는지 생각보다 찾기가 굉장히 어렵네요   혹시 해당 연구를 하시거나 아시는분들께 짧은 답변이라도 부탁드려도 괜찮을까요?   감사합니다

안녕하세요. 누드 마우스 피부 조직을 적출해 lysate하는데 고수님들께 여쭤보고 싶은게 있어서 글을 올립니다. 피부 조직 무게 : RIPA buffer(protease, phosphatase inhibitor) = 1:10 으로 10%(w/v) 만들고 homogenizer로 균질화하고 원심분리 (14000 rpm, 4도, 20분)을 했는데 상등액 부분에 지방들이 떠 있는 것 같더라고요... 이 지방들을 어떻게 제거를 하면 좋을지.. 지방들을 피해서 상등액을 취하려고 해도 같이 따라와서 이를 PVDF filter membrane을 하고 해도 되는지 궁금합니다.

안녕하세요. intensity 정량을 위해 image j 프로그램을 사용하고 있습니다. 제가 얻은 데이터 에서는 가장 진한 색이 세기가 높은것인데, image j 프로그램에서는 하얀 색이 가장 세기가 높은것으로 자동으로 설정되는것같습니다.  둘을 변환하는 방법을 아시는분이 있다면, 알려주시면 감사하겠습니다. 감사합니다.  

안녕하세요. 학위 연구로 세포 조직 관련 실험을 시작한 초보연구자 입니다.  Nude mouse의 전경골근(ant. tibialis m.)을 손상 모델을 이용해 근육세포 재생에 관한 연구를 진행중입니다. 손상된 근육 조직을 추출한 뒤 면역형광(IF)염색법을 이용하지 않고, 근육세포의 (myofiber) 재생 능력을 평가할 수 있는 방법이 있을 지 궁금합니다. 주된 평가 항목은 새롭게 재생된 근육세포 수 계측 및 재생면적(Cross-sectional area) 측정입니다. 현재 선행 연구에서 면역형광 (IF) 염색을 시행하지 않은 상태로 조직 절편을 확보해 표본 slide를 제작해 놓은상태입니다. 면역형광(IF)염색법을 이용하지 않고, 기존에 만들어 놓은 H&E stain slide를 이용해 위 결과를 수동적 혹은 자동 측정할 수 있는 방법에 대해 문의드려 봅니다. ImageJ라는 open acess tool을 이용하는 논문도 보긴 했는데, 대부분 면역형광염색을 시행한 절편을 대상으로 하는 것 같고,,,,혹시나 가능하시다면 무료/유료 프로그램이나 방법에 대해 알고 계시면 꼭 부탁드립니다ㅠㅠ 감사합니다.

안녕하세요, 서울대학교병원에서 전임의로 근무중입니다.  IVIS 를 이용한 Bioluminescence imaging 의 정량 값 측정을 어떻게 할 수 있을지 문의드립니다.  IVIS 를 이용하여 첨부그림과 같이 imaging 만 하였는데, 논문으로 작성을 하려면 아무래도 정량 값 측정이 필요하여서요.. 그런데 처음 imaging 할 때에 정량화를 시켜놓지 않은 상태입니다. 해당 software 를 받았으나 잘 실행이 되지 않습니다.  image 도 있고, 실험 담당자가 raw data 라고 준 것도 있는데.. 현재 저희 병원에 있는 기기로는 호환이 안되는 것 같습니다.  region of interest 혹은 전체 tumor burden 에 대해 평가를 하고 싶습니다. 방법을 아시는 분, 혹은 정량화에 도움을 주실 수있으신지요? 가능하면 후하게 사례를 하고자 합니다. 감사합니다.     

질문을 말씀드리자면 저희 실험실은 35um 두께로 Whole brain coronal section을 합니다. 대부분의 조직을 염색해서 다 관찰해야해서 다 잘라서 씁니다. 근데 간혹 Midbrain에서 Substantia Nigra있는 부분, Hippocampus가 아래쪽까지 커져가면서 Cortex가 다시 좌우반구 쪼개지는 부위부터는 OCT compound를 Brain 전체를 덮다시피 듬뿍발라도 Cortex와 Hippocampus가 달려있는 부위가자르다보면 흔들흔들거리다가 어느순간 통째로 떨어질때가 많습니다.  왜이럴까요...?    프로토콜은 심장에 주삿바늘 꽂은 후 우심방을 잘라서 PBS로 perfusion하고, 4% Paraformaldehyde로 3분간 흘려서 Fixation 한 후에, Brain을 꺼내서 하루정도 더 4% Para에 담가놓고 30% Sucrose에 옮기면 완전히 가라앉을때까지 3~4일 걸립니다. Cerebellum쪽은 잘 안써서 끝부분을 평평하게 자른 후 이를 OCT compound로 Jar에 올려서 -24도에서 얼린 후, -70도에서 꽁꽁 30분~1시간 정도 얼린 후에 꺼내서 자르는 식으로 사용합니다.   비슷한 현상을 겪는 분들 중 해결하신분이 계시면 답변주시면 감사하겠습니다 ㅠ.ㅠ

mouse brain에 cancer cell line을  orthotopic (수술) inoculation 하여 imaging 중입니다. 이 과정에서 궁금한것이 많은데, 아시는게 있으면 한가지라도 조언 부탁드립니다ㅜㅡㅠ   1. IVIS imaging하여 brain region만 ROI quanti시에 total flux값이 x10^9 대 값일 때, 그냥 image raw data는 brain에서만 signal 이 잡혔는데, 다른 그룹들, 다른날짜와의 변화 비교를 위해 전체 이미지 보정시에 척추부분에서도 signal이 나타난 것도 전이로 봐야하나요? 실제로 전이가 진짜 되었다면 보정없이 바로 raw image에서도 척추쪽에서 떠야하는거 아닌가요?  (수술 직후에 수술이 잘 되었는지 여부를 보기 위해, IVIS imaging을 하는데, 촬영시에 바로 brain 외에 척추나, 엉덩이 등 다른 곳에서 signal이 나타났을때 수술 잘못으로 그 개체는 탈락시켜버리는데.... 그 이론으로보면 앞뒤가 맞지 않는것 같아서요)      2. 겉으로 signal이 전혀 안떠서, 안뜬 마리만 따로 재촬영하였더니 signal이 떴는데요, 이 두가지 image 모두를 ROI로 지정하여 total flux 값을 봤더니, 이상한게 image상 signal이 나타나지 않은 것이 10^6 단위로 꽤 높게 떴어요 ;;; 그런데 더 이상한건 다시 촬영하여 signal이 나타난것을 측정했더니 오히려 값이 확 떨어졌어요.... 시그널이 안보이는 개체가 day에 따라서 계속 시그널은 증가하는건 왜그런건가요?? 시그널이 보일때까지 찍으면 (단독촬영) 오히려 flux값은 낮고... 3. 3마리 동시에 촬영을 할때, sinal이 너무 쎄게 나오는 경우 간섭때문에 낮게 나온 것 같아서 따로 떨어뜨리거나, 한마리만 단독 촬영했을 때 image상 signal이 높게 나왔는데 또 값을 내봤더니 결과가 반대였습니다.  4. day가 지남에 따라 signal이 계속 증가하다가, 갑자기 감소하는 경우는 왜그런거죠??    IVIS imaging 고수님들의 조언, 팁있으면 꼭 좀 부탁드립니다.

현재 In vivo tracking에 쓸 Luciferase를 선정하려고 합니다. FLuc, RLuc, GLuc이 있던데, RLuc아니면 GLuc을 쓰려고 합니다. GLuc이 좋다고는 하는데, RLuc과는 Wave가 미묘하게 다르네요. 480nm쯤에서 읽으면 둘 다 가능할것 같긴한데... 굳이 peak가 아닌 곳을 고르기도 그렇고...   제가 In vivo luc image장비를 쓴 경험이 없어서 그런데, 이것도 다른 Imaging 장비처럼 따로 특정 wave만 걸러서 detection하도록 detector가 따로 있나요? 아니면 그런거 상관없이 특정 range를 지정해서 detection할 수  있나요? 대부분 RLuc을 쓰실 것 같은데, 만일 그렇다면 범용성이 떨어지는 GLuc보다는 RLuc을 선택하는게 맞을 것 같아서요.   경험이 있으신 분의 답변을 기다립니다.  

mouse brain에 cancer cell line을  orthotopic (수술) inoculation 하여 imaging 중입니다. 이 과정에서 궁금한것이 많은데, 아시는게 있으면 한가지라도 조언 부탁드립니다ㅜㅡㅠ 1. 겉으로 signal이 전혀 안떠서, 안뜬 마리만 따로 재촬영하였더니 signal이 떴는데요, 이 두가지 image 모두를 ROI로 지정하여 total flux 값을 봤더니, 이상한게 image상 signal이 나타나지 않은 것이 10^6 단위로 꽤 높게 떴어요 ;;; 그런데 더 이상한건 다시 촬영하여 signal이 나타난것을 측정했더니 오히려 값이 확 떨어졌어요.... 시그널이 안보이는 개체가 day에 따라서 계속 시그널은 증가하는건 왜그런건가요?? 시그널이 보일때까지 찍으면 (단독촬영) 오히려 flux값은 낮고... 2. 3마리 동시에 촬영을 할때, sinal이 너무 쎄게 나오는 경우 간섭때문에 낮게 나온 것 같아서 따로 떨어뜨리거나, 한마리만 단독 촬영했을 때 image상 signal이 높게 나왔는데 또 값을 내봤더니 결과가 반대였습니다.  3. day가 지남에 따라 signal이 계속 증가하다가, 갑자기 감소하는 경우는 왜그런거죠??    IVIS imaging 고수님들의 조언, 팁있으면 꼭 좀 부탁드립니다. 

안녕하세요. 항염증 Material을 연구하는 대학원생입니다.   C57/BL6(8주령, 암컷)의 염증을 이미징하고자 마우스를 Isoflurane 마취한 다음 Prosense 750 FAST를 Tail vein injection하였는데요. 정량투여했음에도 약물을 주입한 개체들의 마취 풀리는 속도가 더딜 뿐더러, 일부 개체는 안구돌출 증상을 보이더니 죽는 경우가 있었습니다.   Prosense 750 FAST의 원리가 체내 Cathepsin에 의해 Degradation-Activation되어 NIR을 방출하는 것인데, 약물의 Half-life가 30분 남짓으로 짧습니다.  이로 미루어보아 주입한 약물이 체내에서 빠르게 분해되면서 혈압을 상승시키지 않았을까 하는 생각은 드는데...   염증 이미징으로 꽤나 쓰이는 약물인 만큼, 이런 부작용이 일반적인 상황은 아닌 것 같아서 질문 남겨봅니다. 1) Protease 분해 기반 Dye가 혈압을 상승시킨 다른 사례가 있는지 2) 마취에 의한 호흡능력 약화가 그러한 상황을 더욱 악화시킬 수 있는지 3) 따라서 Tail vein injection 시 마취없이 보정틀로 수행하는 것이 더 나을지 4) 약물에 대한 단순 알러지일 가능이 있는지   알려주시면 감사드리겠습니다...

제가 동물실험은 처음이라 고수님들의 의견을 듣고 싶습니다. 세 가지(a,b,c)의 약물을 200ul에 녹여 마우스에 경구투여 하려고 합니다. 넉넉히 5ml을 만드려 합니다. 세가지 약물을 섞을 것 인데요, a (500mg/ml) -> 40mg/kg(농도) b (2000mg/ml) -> 100mg/kg(농도) c (2000mg/ml) -> 100mg/kg(농도) 만드려고 합니다. 그렇다면 5ml을 만든다고 하면, a = 120ul b = 45ul c = 45ul 유기용매 (5%) = 250ul PBS = 4540ul 이렇게 만드는 것이 맞는지 궁금합니다! ㅠㅠ 하나당 66.7ul씩 있어야 200ul로 분주되니까,,, 이렇게 계산이 맞나요....???

50, 100, 200 mg/kg 으로 마우스에 경구투여시 50,100mg/kg에서는 용량의존적으로 농도가 50에 비해 100에서 약2배가량 늘었는데,  200mg/kg에서는 50과 100mg/kg 중간정도의 농도로 줄어듦을 확인하였습니다. 이럴경우에는 용량 비의존적이라고 볼수있을까요?

control군으로 mouse에 생리식염수 주입후 형광을 관찰하였는데 아래 사진처럼 붉은색으로 관찰된후 3일 뒤 다시 관찰하였더니 푸른색으로 변해있었습니다.  생리식염수를 주입하였는데 형광이 왜 나타난건지 혹시 알 수 있을까요?