imageJ로 세포 형광 정량하려고 하는데, 저같은 경우는 colocalization을 한거라, 같은 위치에서의 두 형광 시그널을 받아 비율을 보려고 하는데, (red대비 blue의 형광을 보려고합니다) Split channels->Threshold 설정-> Analyze particles를 사용하면 red와 blue의 point가 다릅니다.  저 위의 사진은 20x에서 찍은 셀을 제가 직접 누끼(?)딴건데 교수님께서는 정량하려면 최소 150 cell 직접 따거나 10x 5장으로 정량하라고 하십니다.   혹시 같은 위치에서 2가지 채널의 시그널을 정량할 수 있는 방법이 있을까요? 제가 일일히 따야하는걸까요? 도와주세요..

이번에 ROS 측정을 하려고 protocol을 확인중에 black plate clear bottom을 쓰라고 되어있더라구요   근데 랩실에서는 막힌거만 있고, 현재까지 FL 측정시에 문제 없었거든요 suspension cell 가지고 실험할거라서 clear bottom으로만 측정해야하나요?   다른랩에서 하는 걸 보니, clear bottom을 막아서 측정하시는 분도 계시던데.. bottom reading 하는게 아니면 clear를 안써도 되는 건가요? plate의 종류 때매 너무 헷갈리네요

    transfer 후 폰슈해봤는데 사진처럼 가운데에 큰 구멍이 있어 밴드가 안보입니다. pvdf membrane을 사용하고 메탄올에 담근 후 dw, trans buffer에 적셔 gel에 올리고 기포를 완벽하게 제거해주었습니다.. running까지 잘 진행된것을 확인했고, transfer는 90v에 120분간 진행했습니다. 총 3개의 gel을 transfer 했고, tank 두개를 사용하여 tank1에서 진행한것은 오른쪽 사진결과, tank2는 왼쪽사진과 사진은 없지만 transfer가 잘된것 하나 이렇게 진행했습니다. 기포라고 하기에 너무 큰 구멍인거 같은데 왜그럴까요??ㅠㅠ 고수님들 답변 부탁드립니다...!!

안녕하세요 RT-PCR 하려고 cell키워 seeding 하고 sample처리를 했는데 알티할때는 FBS없는 배지로 sample처리를 해야한다고 알고있는데 제가 fbs있는 배지로 샘플처리하고 24시간 뒤에 trizol처리했는데....fbs 유무에 따라 실험결과 차이가 많이나나요?  

신경세포, 특히 축삭부분에서 '근위'라 함은 어디인가요? 신경 재생관련 글을 읽다 보니 신경절단되었을 때 축삭의 '근위' 쪽에서 신경다발이 형성된다고 나와있는데 축삭의 근위라 함은 절단된 부위에서 신경세포체 부분의 절단면을 말하는 걸까요, 아니면 축삭말단쪽 절단면을 말하는 걸까요..?

안녕하세요 세포를 이번에 받게되서 운반을 해야되는데....사정상 이동시간이 12시간 정도 될거 같아서 고민입니다. 단거리로는 저도 보내거나 받아봤는데 이렇게 시간을 오래 끌면서 받아보긴 처음이라서 어떻게 받아야할지 고민이네요. 시간이 시간이다보니 액체질소는 무리일거 같고 드라이아이스나 그냥 배지 꽉채워서 받는 방법중 하나가 좋을거 같은데 어떤게 좋을까요...? 많은 답변 부탁드립니다. 세포는 하나는 일반 세포, 하나는 암세포이며 둘다 adhrent cell입니다.

Caspase-1의 활성을 보기 위해 Promega에서 glo kit를 구입하여 조건 set up중에 있습니다.   사용하는 cell은 Human lung epithelial cell인 H292입니다. white 96-well plate에 5*10^4으로 cell을 100 ul씩 seeding을 하고 caspase-1 활성을 위해 P.aeruginosa (MOI 100)를 이용하여 infection시켰습니다.   이후 Luminometer로 detection하면 +/-의 수준이 크게 차이가 나지 않아 원인을 생각해보고 있는데 기본적인 basal level이 높아 inducing이 되어도 차이가 나지 않는 것인가 생각이 됩니다. ( + : 140,000,  - : 120,000 ) 다른 paper들을 참고했을 때 caspase3/7를 측정할 때 seeding 농도를 낮게 깔아 그것대로 cell seeding 농도를 낮추고자 하는데 혹시 제가 생각해볼만한 부분이 있는지 여쭤보고 싶습니다.

안녕하세요.   논문 요청드리고자 합니다. 기술 이전을 위한 Method Validation에 대해서 공부중입니다. Flow Cytometry Method Validation Protocols - PubMed (nih.gov) Flow Cytometry Method Validation Protocols - Selliah - 2019 - Current Protocols in Cytometry - Wiley Online Library   감사합니다.

안녕하세요 C2C12 세포를 이용해서 muscle atrophy 관련 실험을 하고있는 실험 초보 석사입니다. C2C12 세포에 LPS를 처리하여 cytokine (TNF-α, IL-1β) 발현양을 ELISA로 확인하는 것과 근위축과 관련된 바이오마커들 (Foxo3a, AKT, mTOR, myogenin)을 western blot을 이용해 확인하는 실험을 진행 중인데요.. 두 실험 모두 도움이 필요합니다ㅠㅠ 우선 cytokine은 LPS 농도와 처리 시간을 다양하게 설정하여 예비실험을 진행했습니다. 지금까지 100ng/mL, 1ug/mL, 10ug/mL로 2, 4, 6, 12, 24, 48시간 처리해보았는데 전부 흡광도를 측정했을 때 standard 범위 내에 들어오지 않습니다. 눈으로 봐도 정말 색이 하나도 변하지 않아요..ㅠㅠㅠ 세포 수도 다양하게 설정해봤습니다. 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 3x106cell/mL로 seeding해서 실험을 진행해보았고 결과는 마찬가지였습니다..ㅠㅠ 이제 어떻게 실험을 진행해야할지 막막합니다.. 두번째는 western blot입니다. dexamethasone을 처리해서 Foxo3a, p-Foxo3a, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR, myogenin을 확인하고있습니다. 농도는 10uM, 100uM로 24시간씩 처리해서 예비실험을 진행하고 있었구요 문제는 control과 샘플을 처리하지 않은 그러니까 dexamethasone만 처리한 처리구를 비교할 때 경향이 자꾸 반대로 나옵니다. 예를 들자면 foxo3a는 핵 내로 들어가서 근위축과 관련된 유전자를 발현시키는 단백질이고 인산화된다면 이런 역할이 저지되는 것으로 알고있는데 dexamethasone 처리구에서 control 보다 p-foxo3a가 많이 나타납니다.. western blot도 세포 농도를 위 실험처럼 다양하게 진행해보았습니다..ㅠㅠ  요약하자면 1. TNF-α, IL-1β를 ELISA로 측정하는데 세포농도(1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 3x106cell/mL), LPS 농도(100ng/mL, 1ug/mL, 10ug/mL), 처리시간(2, 4, 6, 12, 24, 48h)을 다양하게 해도 반응이 나타나지 않습니다. 2. western blot을 진행하는데 dexamethasone으로 자극을 준 처리구에서 근위축과 관련된 단백질이 control보다 더 적게 나타납니다. 혹시 실험 과정 중에서 짐작이 가시는 잘못된 부분이 있을까요? 세포는 passage 6~9사이의 것들로만 사용했습니다. 어디서 잘못된건지 너무 답답해요ㅠㅠ

2well / 8 insert 로 migration/ invasion assay 실험을 하는 데요. 유튜브 프로토콜이나 제가 받은 프로토콜 종이를 보면  제일 마지막은 현미경으로 보고 셀카운팅을 하라 써있더라구요  그런데 현미경으로 보고 어느 거를 셀카운팅을 해야 하는 건가요 ? 다들 어떤식으로 셀카운팅 및 사진을 촬영하세요?   1) 현미경도 4x 10x 20x 40x가 있잖아요, 여기서 어느 배율로 보고 사진 촬영 하시나요 ?   2) 그리고 셀카운팅을 할때 그 찍은 사진을 토대로 이미지j 프로그램을 사용하면 되는건가요 ?   도와주실 분이 없어서 비루한 프로토콜보고 하는데 정말 제일 마지막 단계에서 어찌야해할지 막막해서요. 답변 미리 감사합니다.             

현재 시험실에서 SDS-PAGE 시험을 진행하고있는데, 샘플 전처리시 LDS sample buffer와 reducing agent를 넣고 실험하고있습니다. LDS samplebuffer에는 mercapto ethanol이 들어가있어 di sulfide bond 끊는걸로 알고있고, reducing agent에는 DTT가 들어가있어 di-sulfide bond 끊는걸로 알고있습니다.   LDS 샘플버퍼가 s-s 본드 끊어주는 역할을 하는데, 굳이 동일한 역할을 하는 reducing agent까지 넣는 이유를 찾질 못하겠네요..

cell migration 실험을 하려고 합니다. 실험실에 protocol이 없어서 열심히 찾아보고 주변에 물어보고 해서 여러번에 실패 끝에 성공을 했는데요. 실패원인이 제가 FBS를 첨가하지 않아서 cell이 migration하지 않았더라구요. 그래서 지인이 10%FBS를 넣으라고 해서 24시간 starvation하고 treatment를 첨가한 media를 넣고 30분 뒤에 총 volume의 10%FBS을 첨가해서 0h으로 하고 이후 2시간마다 확인하고 있습니다. 저희가 실험하는 cell이 migration이 금방되서 IGF을 처리하면 3~5시간이면 완전 migration이 됩니다. 근데 다른 지인이 10%FBS를 넣으면 증식이 되는거 아니냐며 3%가 적당하다고 합니다. 여러분들은 FBS 얼마나 넣으시나요?

지속가능한 발전을 큰 주제로 하고 환경오염을 소주제로 하여 팀을 구성하였는데 고등학생 수준에서 할 수 있는 환경오염관련 실험 추천해주세요

항암효과를 측정하는 방법 알려주세요. 쉽고 자세하게 부탁드립니다.

안녕하세요. Cell stock 보관에 대해 여쭤보려고 합니다. 저희 랩실은 질소 탱크 대신 deep freezer에 stock을 보관하고 있습니다. 본래 원칙은 isopropanol box에 넣어 overnight 후 다음 날 deep freezer로 옮기는 건데, 제가 부득이하게 다음 날에 출근을 못할 것 같아 혹시 overnight하지 않고 5-6시간 정도 지난 뒤 deep freezer로 옮겨도 되는지 여쭤보고자 합니다. 감사합니다.

p-p38항체를 보고있는데 항체 비율을 계속 변경해봐도 안뜨네요... 같은 샘플에서 다른 항체는 잘 보이는데 p-p38만 안보여요...   혹시 p-p38을 보셨던 분들 중 잘 나온 protocol이 있으면 공유 부탁드려요ㅠㅠ   안나오는 이유도 알려주시면 감사하겠습니당..

cell lysates에서 타겟단백질에 저분자를 공유결합으로 연결해서 형광물질이랑 클릭리액션한 뒤에 전기영동 하고 형광스캐너 사파이어로 스캐닝했는데  깔끔하게 나올  때도 있지만 사진처럼 지저분하게 뭔가 묻어있는 것처럼 보이는 경우가 있어요  gel을 물로 씻어서 찍어봐도 똑같고 원인도 모르고 계속 다시해보고 있습니다. 혹시 아시는 분 있으시면 답변 부탁드릴게용~! 답변주시면 복 받으실 거예요 ㅎㅎㅎ

PC9에 LC3를 염색해서 ICC를 하는 실험을 하는데 LC3가 dot으로 보이지도 않고 핵내에도 염색이 되네요 왜그런걸까요? A549에선 이쁘게 잘만 보이던데.. 

안녕하세요.    melanin 생성 저해 실험 계획 세우고 있는 대학원생입니다.    다른 논문에서 샘플처리 1시간 후에 a-MSH처리를 하는데 왜 따로 하는지 궁급합니다.

안녕하세요. Doxorubicin으로 DNA damage를 줘서 senescence 유도를 하려고 하는데 적절한 농도를 찾기 위해 screening을 하려고 합니다. 논문에서 보니까 250nM 정도가 적당하다 나와있지만 해당 cell line이 종류가 달라 일단 0, 100, 200, 300, 400, 500nM로 처리하고 marker 확인한 후에 적당한 농도에서 다시 범위를 줄여 screening을 하려고 합니다. 예를 들어 첫 스크리닝에서 100이 적당한 농도라고 나오면 0 (control), 50, 75, 100, 125, 150 nM로 2차 스크리닝을 해서 가장 잘 나오는 농도를 opitmal concentration이라고 둘 예정인데 이렇게 진행해도 될까요?