안녕하세요. 물질에 대한 항암효능평가 실험을 하고있는 대학원생입니다. 일단 물질을 가지고 웨스턴으로 MAPK경로를 보았을 때 농도의존적으로 ERK의 확실한 감소를 보았습니다 (apop도 증가하였습니다). 따라서 ERK를 확실히 매개하는지 또 한번 확인하기위해 ERK inhibitor를 사용하여 실험을 진행해 그냥 물질만 처치할때보다 물질+erk inhibitor 처치군에서 더 많이 생존율감소 및 apop이 일어난걸 확인했습니다. 암것두 처치안한것,erk inhibitor만처치한것 비교는 차이없었습니다 이런식으로 논문을 작성해서 리뷰를 받았는데 한 리뷰어 분께서 물질만 처치했을때 erk가 감소하는경향이면 inhibitor 가 아니라 activator로 확인해야하는것 아니냐는 질문을 받았습니다. 해당 설명도 맞다고는 생각합니다. 하지만 inhibitor로 더 큰 감소를 확인했으면 이것도 erk경로를 거친다고 볼수는 없는건가요? 저는 충분히 연관있다고 생각되는데 다른분 의견도 궁금합니다 ㅜ 다른 논문을 찾아봤을떄도 pi3k경로 같은경우 apop이 일어나면 감소하는 경향이고 이걸 확인하려고 pi3k inhibitor사용하는걸 많이봐서 설정한건데 당황스러웠습니다.

  안녕하세요, 저는 현재 석사 반년차 대학원생입니다.   약물 처리한 Cell을 이용해 Annexin5로 staining 진행하고 Cell Apoptosis를 관찰하는 실험을 계획하고 있습니다.   Apoptosis가 진행되는 과정을 보는 것이라 되도록 빠른 시간 안에 측정하는 것이 좋다는 것은 알고 있지만,   해당 실험 계획한 시간에 다른 일정이 생겨, Annexin5 staining까지만 진행하고 실험을 잠시 멈춘 뒤(우선 테스트 겸 진행해보는 실험이라서요), 2시간 정도 뒤에야 재개할 수 있을 것 같습니다. 이때 Staining한 Cell을 Tube에 두고 4'C 냉장고에서 보관해두어도 될까요?   아니면 staining전 Cell pellet만 얻어서 냉장고에 넣어두고(약 두시간) 일정 마친뒤에 staining을 진행하는 편이 나을까요?   2시간 사이 Cell이 다 죽어버릴 확률이 커서 측정할 가치가 없다고 판단되면 그냥 실험 스케줄을 다시 잡아볼 생각입니다..Cell 상태가 어느정도 유지될 가능성이 있다고 하면 진행해볼 계획이구요.   관련된 실험 경험이 있으시거나 해답을 아시는 선배님들이 계시다면, 답변 주시면 감사드리겠습니다..!ㅜㅜ          

첨부한 사진 속 화살표가 가리키는 덩어리가 왜 생긴 것인지 궁금합니다. 교수님께서 아마도 염색 시약이 제대로 녹지 않아 덩어리진 것이라고 하셨습니다. 정확하게 레포트에 작성해야 되는데 덩어리가 왜 생긴 것인지, 해결방안은 무엇인지 알려주시면 감사하겠습니다. 실험은 DAPI대신 hoechst를 사용했고 PI는 그대로 사용했습니다.

세포 독성 실험을 하려고 하는데요,, 논문마다 방법이 다 달라서요 혹시 셀 씨딩 후 바로 약물 투여해서 시간 관찰하시나요 아님 세포가 붙을 수 있게 하루 정도 뒤에 약믈 투여하나요...?   

western blot 샘플로 cell pellet을 얼렸는데 얼릴 때 pbs washing을 안해서요.. 다시 녹여서 pbs wash해도 괜찮을까요?

안녕하세요. 현재 facs를 이용해 지방세포에서 Annexin V-FITC/PI staining 으로 apoptosis 실험을 진행중인 대학원생입니다. 이전에 facs를 사용할 때는 형광 하나만 보는 실험이여서 compensation이 필요하지 않아 무난하게 진행하였는데 annexin v/pi staining을 하니 compensation이 잡히지 않아 제대로 분석을 못하고 있습니다...ㅠ 두 형광 모두 staining 한 contorl 샘플을 찍게 되면 업로드 사진과 같이 annexin v 쪽이 칼같이 잘려서 45도 정도 기울어진 상태로 찍히게 됩니다.. 찾아본 compensation 방법이나 팁에서는 compensation %를 조정하면 간섭되어 찍히던 시그널이 수직이나 수평으로 옮겨지게 되던데 저렇게 대각선으로 축이 비틀어져 버리는 케이스는 찾기가 힘들더군요.. FL2-FL1을 건드려도 올라가버린 대각선 축이 움직이지가 않습니다.. 혹시 저런 케이스의 경우 compensation을 어떻게 해야할까요? 아니면 샘플 염색의 문제일까요?..ㅠㅜ

안녕하세요, 현재 석사과정 중인 대학원생입니다.   cell cytotoxicity를 실시하기 위해 96well flat bottom에서 effector cell과 target cell을 co-culture한 뒤 cell pellet을 이용하여 luminescence를 측정하고자 하는데요. 이때 down하여 sup을 버릴때 그냥 털어서 버려도 문제가 없을까요? 아니면 multi pipette으로 sup을 따줘야 할까요??

EDTA가 세균 세포벽의 금속 양이온과 결합해서 세포벽을 파괴한다고 하는데, 식물 세포벽도 파괴가 될까요?  아무리 찾아도 세균 혹은 식물의 세포벽에 마그네슘이나 칼슘과 같은 양이온 있다는 말은 못 찾았는데 어디에 존재하는건가요

안녕하세요, 현재 석사과정 중인 대학원생 입니다. cell lysis 실험을 여러가지로 진행 중에 있는데 그 중 LDH assay를 여러번 진행하였습니다. 이때 항상 effector cell의 흡광도가 effector + target의 흡광도와 거의 유사한 값으로 높게(?)나오고 있습니다. 예를 들어 co culture = 0.35, effector control = 0.34 target control = 0.25 정도 입니다. 원인으로 생각해본 것은 애초에 cell lysis가 거의 생기지 않는 다는 것과 effector cell자체가 많이 죽는 다는 것 입니다. 참고로 effector cell은 CAR T cell인데 16h co-culture후 흡광도를 측정하고 있습니다. LDH kit는 dogen것을 사용 중이구요. reference들을 봤을때 기본적으로 target cell media에서 co-culture하고 IL-2는 대부분 들어가지 않아서 전날 T cell activator를 16시간 정도 처리하고 target cell media(without IL-2)에서 co-culture를 진행하고 있습니다. 몇 번째 실험을 진행해보았는데 잘 나오지 않네요ㅠㅠ

안녕하세요오,, annexin v/pi staining에 대해 질문이 있습니다..ㅠㅠ   제가 사용할 kit는 BD bio의 cat. 556547 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I 인데요   protocol에    Staining 1. Wash cells twice with cold PBS and then resuspend cells in 1X Binding Buffer at a concentration of 1 x 10^6 cells/ml. 2. Transfer 100 µl of the solution (1 x 10^5 cells) to a 5 ml culture tube. 3. Add 5 µl of FITC Annexin V and 5 µl PI. 4. Gently vortex the cells and incubate for 15 min at RT (25°C) in the dark. 5. Add 400 µl of 1X Binding Buffer to each tube. Analyze by flow cytometry within 1 hr.   이렇게 써져 있는데, Annexin V와 PI를 넣은 후 원심분리로 상층액을 제거하지 않는걸까요?? 마지막에 400 ul의 binding buffer를 추가해주는데 그게 원심분리를 하지 않아도 되는 이유인가요??   답변 부탁드립니다 고수님드을 ㅠㅠㅠ...

안녕하세요 고등학교 과학과제 연구 시간에 대장균을 배양하는데 실험하다 막히는 부분이 있어 질문드립니다! 대장균을 액체배지에 배양하고 대장균에게 먹이를 주는방법과 또다른 액체배지로 옮기는 방법이 궁금합니다 또한 만약 항생제를 대장균에 주입 할 경우 액체배지에서의 항생제 주입방법에 대해서도 궁금합니다!

안녕하세요, apoptosis cell 을 관찰하기 위해, TUNEL 염색을 의뢰했는데요... 원하는 결과대로 brown cell들을 확인할 수 있었지만, blue stain 또한 관찰되었는데, 이게 결합조직에 염색이 된건지... 샘플마다 blue stain된 정도가 달라 실험조건에 의한 영향이 생긴 건가 싶은데요.. 이렇게 해석해도 되는건지 몰라 문의드립니다. 왜 blue stain이 발견된 걸까요? TUNEL assay만 진행했습니다. control 사진과, treatment 사진을 비교해보면... brown stain된 apoptosis cell 주위에 blue stain area가 존재하는 정도가 treatment 사진이 더 큽니다. treatment 실험군에는 생물체에 스트레스를 주는 요인을 처리한 것이구요. 생물은 복족류 (무척추동물)이며, 간췌장 (hepatopancreas) 조직입니다. DAB는 반응 시 갈색으로 된다고 알고 있는데, 파란색으로 염색되는 경우를 찾아봐도 영 시원찮은 정보밖에 나오지 않네요...ㅜㅜ necrosis가 발생했다고 하는 논문들도 일부 찾아봤지만... 제 결과에 완전히 적용된다고는 하지 못할 정도의 정보들이라서요,ㅜㅜ 해석에 애먹고 있습니다.. *** 찾아본 논문들 1. Identifying and Quantifying Apoptosis: Navigating Technical Pitfalls 2. In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death: a cautionary note. (그나마 제 결과와 비슷하게, apoptosis signal cell 근처에 necrosis 또한 관찰된 case같습니다. FIGURE 사진이 흑백이지만요..) 3. Impaired high-density lipoprotein anti-oxidant capacity in human abdominal aortic aneurysm (DAB staning시 발견된 blue stain area를 necrotic area로 서술한 부분이 있습니다.) 4. Cd-Induced Apoptosis through the Mitochondrial Pathway in the Hepatopancreas of the Freshwater Crab Sinopotamon henanense 5. Vital staining for cell death identifies Atg9a-dependent necrosis in developmental bone formation in mouse 급한 마음에 글을 잘 못 적은 것 같아 알고 싶은 것을 정리해서 말하자면.. 1. 위 논문들 제외하고, 제가 결과 해석에 참고할만한 문헌이 더 있을까요?? 2. DAB TUNEL assay (staining) 수행 시 blue stain area가 나타난 이유가 뭘까요..? 3. blue stain area를 apoptosis가 아닌, necrosis의 증거(necrosis가 발생함)로 서술해도 괜찮을까요? - 이 경우, necrosis를 확인하기 위한 별도의 assay를 추가적으로 수행할 생각입니다.

Kit를 사용하여 fluorescence 측정을 하였습니다. 씨딩->dcfda 처리 45min->제거후 샘플처리-> 바로 측정 (시간간격) Ros는 빨리 생성되었다 사라지는걸로 알고 있는데, 물질 처리 후 5분 내외의 측정값을 ros 양이라고 믿어도 될까요? 즉 물질처리 직후가 아니면 ros가 sample군에서도 전부 증가하였다가, 일정시간이 지나면 처음 수준으로 회복하는 것 같습니다 Protocol은 물질을 1-6시간 처리하라는데, 그럼 제 샘플은 detection 효과가 없다고 봐야하는건가요? 제 샘플을 24h 처리했을때 viability를 높이는 결과를 바탕으로 ros scavenging을 확인하고자 합니다 1. 기존 조건인 24h에서는 mtt상 죽는 셀이 많은데 실험이 의미가 있을지? (게다가 dcfda가 긴시간에서는 불안정하여 프로토콜이 다릅니다) 2. 만약 24h에서 봐야한다면, 셀수를 보정해주어야 하는건지 3. 10분만 지나도 값이 크게 다른데, 위처럼 처리 5분 후의 값을 유의미하게 볼수 있는지 도움 부탁드립니다 ㅠㅠ

사멸후 세포벽이 남아 있을수 있나요?

안녕하세요 논문을 공부하는 학부생입니다  이 논문에서는 어떤성분이(rg-2)의 항암효과를 나타내는 논문인데  이 혈청검사를 통해 무엇을 나타내는지 모르겠어요 논문 번역을 봐서는 이 성분이 독성이 없다는 것을 나타내는 것 같은데  그거뿐인지 궁금하기도 하고요  첨부그림은 유방암세포를 누드마우스에 이식시켜서 종양으로 키운다음  그 쥐의 혈청을 조사해서 나타낸 그래프입니다   

안녕하세요 너무 기초적인 질문일수도 있기는 한데 실험을 하다가 헷갈려서 질문드립니다 ㅠ 저는 어떤 toxic한 물질을 처리하고 치료제를 주었을 때 autophagy가 증가함으로써 toxic 물질이 감소하고 치료효과를 보인다 라는 가설을 가지고 실험을 하고 있습니다 그런데 어떤 논문에서는 질병에서 autophagy가 증가하는 양상을 보이므로 치료제를 써서 autophagy를 억제시킨다 라고 이야기를 하더라구요 그래서 이autophagy를 어떻게 해석해야 하는지 궁금합니다 .. 저는 실험에서 autophagy 마커로 lc3를 보구요 치료제에 의해 Toxic 물질이 감소한 것을 western으로 확인한 후 lc3를 보았을 때 증가할 것이라는 예상결과를 가지고 실험하고 있습니다 . 다른 논문을 공부하다가 거기서는 또 lc3가 감소한게 좋은 것이라고 하길래 이해가 안가서 질문 드립니다 .... 답변 부탁드립니다

안녕하세요 논문공부를하고있는 학부생입니다  다름아니라 d,e,f그림을 보려고 하는데  실험은 종양조직을 가지고 세포사멸에대해 분석한건데 ihc그림에서 d에서 rb가 인산화 덜된것은 관찰이 되어서 e그래프에 저렇게 나온게 이해가 되는데  d그림에서 p-ampk가 분명 육안으로 4-oht, rg2를처리하면 줄어든것처럼 보이는데 그래프에서는 늘어났다고 보여서 제가 보는법이 틀렸나 질문드립니다. 

안녕하세요  annecxin v를 이용한 apoptosis assay에서요 flowcytometry를 진행한다음 그래프에서 기준선을 잇는게 임의로 지정하는건지 궁금합니다. 사진의 빨간색 박스로 되어있는부분이 기준선입니다. 지금 annecxin v의 기준선은 10^4에 되어있는데요 다른 논문의 결과를 보면 10으로 되어있어서요...

안녕하세요. 이제 석사 2학기 되는 대학원생입니다. 작년부터 올해까지 HT22 세포에 Glutamate로 세포 독성을 유도하고 있는데 계속 잘 안풀려서 여기에 질문 드립니다.   상황을 간략하게 설명드리면, glutamate는 sigma Cat.no 46912 제품을 사용하고 있습니다. HT22cell (LM001-05배지 사용)로 96-well, 60mm 모두 유도 해보았고, 여러 시도끝에 10mM이라는 농도도 잡았습니다. (처리할때는 serum free에 녹여서 10배 높은 농도로 처리합니다. (ex) final : 10mM이면, Treat : 100mM))   하지만 늘 Glutamate를 새로 만들고, 만드는 방식도 Glutamate양과 분자량 비율대로 계산해서 녹이고, 필터하고, 처리하는 방식인데 어떤날은 세포를 50% 죽이고, 어떤날은 10%도 안죽이고.... 하....   실험실 선배님들과도 이야기를 해보았지만 도저히 이유를 모르겠어서 올려봅니다. 혹시 제가 못보는 부분이 있다면 가르침 부탁드립니다...   긴 글 읽어주셔서 감사합니다!!   질문 요약 1. Glutamate의 HT22cell 사멸유도에서 주의해야할 점이 있나요? 2. 늘 같은 방식으로 Glutamate를 만들고 처리해도 유도되는 cell death의 %가 다른걸까요..?

Apoptosis 유도 효과를 보기 위하여 Annexin V5/ PI staining을 진행하려고 합니다.  일단 샘플은 총 3개이고,  보정을 하기 위해 Non-staining, PI staining, Annexin V staining 을 따로 준비하고 PI + Annexin staining을 처리한 control, 물질 처리군 2개를 준비하였습니다.  Non, PI staining의 gain값 세팅 후에 Annexin V gain값 세팅 중 PI값을 좀 낮추고 PI + Annexin staining (control, 물질처리군 2개)은 무조건 gain값이 일정한 상태에서 찍는게 맞는거죠?