안녕하세요, Bcl-family에 대해 연구하고 있는 학생 입니다. ABT-263을 가지고 실험 중인데요 왜 Bcl-w는 사람들이 잘 연구하지 않을 까요,,? Bcl-2 and Bcl-xL은 많이 알려져 있는데 그만큼 Bcl-w는 많이 없습니다. 특이점이 있나요,,? 혹시 anti-apoptotic에 대해 연구중인 분들 답변해주시면 정말 감사하겠습니다.

안녕하십니까 1. U0126은 항산화 물질로 작용한다고 알고있었습니다. 하지만 밑에 논문에서 가져온 자료를 보면 U0126을 처리한 군에서 형광 세기가 강하게 나온걸로 보아 ROS가 대조군에비해 증가한걸 알수있는데요.. 그림 자료는 MCF7세포에 처리한 상황입니다.. U0126이 왜 이런 결과를 나타낸건지 알려주시면 감사하겠습니다.   2.그리고 NAC(N-acetyl cystein)과 U0126, LY294002를 처리시 ROS가 증가된다면 그 작용기전을 알려주시면 감사하겠습니다.   논문:Ginsenoside-Rg2 affects cell growth via regulating ROS-mediated AMPK activation and cell cycle in MCF-7 cells 

한달차 학부연구생입니다. HCT116 Cell 에서 물질처리에 의한 Apoptosis에 대한 Western blot 실험을 진행하였습니다. P53, MDM2를 확인하였고 P53에선 변화가없었으며 MDM2에선 물질처리에 의해 감소하였습니다.  Control을 확인하였으나 과도한 Stripping으로 제대로 확인이 불가하였습니다. 그래서 P-P53(S15)와 P14ARF를 확인하였고 P-P53은 물질처리에 의해 감소하였다고 보이며 P14ARF는 원인은 모르나 밴드가 detection되지않아  Control을 찍어볼 예정입니다.    gene들이 제가 생각하던 것과 다르게 나타나서 너무 당황스럽습니다. Control을 제대로 확인할 수 없으니 실험을 다시 진행하는것이 맞는것인가요?

안녕하세요,   Primary chicken의 뒷다리 살에서 Isolation 후 preplating을 거쳐서 근육줄기세포를 획득한 후, 세포증식 및 세포분화 실험을 하고 있는 연구원입니다.   제가 알기로 해당 cell은 쭉쭉 길게 뻗는 cell shape이 이상적이라고 하는데, 제가 키우는 cell은 조금 잘려져 있는 모양이어서, 주위에 도움을 요청해보니 apoptosis 혹은 necrosis가 많이 일어났으며, 이는 세포 배양 시 오염 발생으로 인한 것으로 추정된다고 조언받았습니다. p/s. 세포배양액 : Ham'sF10 media + 20% FBS + 1% penicillin/streptomycin + 5 ng/ml FGF2 (성장인자)   1) 이러한 상태가 apoptosis/necrosis가 맞나요? 2) 사용 시약들은 all fresh하게 사용했으며, 실험시 늘 라텍스장갑과 알코올 소독을 습관화하고 있습니다. 그렇다면 인큐베이터 내부 오염이 가장 크게 생각되는 게 맞을까요?   전문가분들이 세포 상태를 봐주시면 크나큰 영광이겠습니다.   감사합니다.

안녕하세요, 단백질 정제하는 석사 1학기입니다. 제가 elution buffer 조성을 바꿨더니 sample buffer가 노란색이 되며 산성을 띄는것 같습니다. 기존 elution buffer 조성은 20mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 5mM MgCl2, 0.5mM DTT, 300mM Imidazole에서 20mM Tris(pH 7.0), 150mM KCl, 10mM MgCl2, 0.5mM DTT, 5% Glycerol, 300mM Imidazole로 바꿨습니다. 현재 하루 지난 elution buffer가 완전 갈색으로 바뀌었는데, 어떤 화학반응이 일어났는지 자문좀 구할 수 있을까요?ㅠㅠ Imidazole과 DTT와의 반응인건지, MgCl2와의 반응인건지 잘 모르겠습니다...

LDH assay를 진행하려고 합니다 (THERMO 제품으로)   처음해보는 실험인데, 이게 색깔의 변화를 보고 흡광도를 재는 실험이더라고요   제가 96well plate에서 키워서 진행을 하려고 하는데,   이럴경우 그러면 메디아의 색상이 중요한것 같아서    페놀레드를 뺀 메디아를 사용하는 것이 맞는지 문의 드립니다.   그리고 High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine, Phenol Red가 원래 사용하는 메디아의 메인 조성입니다.   여기서 Phenol Red를 빼면 High Glucose, HEPES, L-Glutamine 구성으로 된 메디아 밖에 없는데 셀에 특별한 영향을 줄까요?  

세포주 분양이 혹시 가능하신 실험실이 계신지... 계시면 혹시 세포주 분양을 해주실 수 있는지.. 알고 싶습니다.  breast cancer cell line, BT474, MCF-10A, BT-549 이중 한개라도 상관없으니 분양 가능하신 분은 답변 부탁드립니다. 

안녕하세요. 만들어 쓰는 버퍼로는 세포질-핵 분리가 잘 되지 않아 active motif 사의 핵 추출 키트를 주문했는데요, 이 키트 효율 괜찮나요? 예전에 다른 회사의 키트를 써봤을 때는 아예 분리가 안 되어서 이 회사 것도 분리가 잘 되지 않을까봐 걱정입니다.. 참고로 western blot으로 NF-kB 보고 있습니다.

desalting yield가 100% 넘어가는 원인에는 어떤게 있나요?

안녕하세요 석사 1학기 대학원생입니다. Western blot 실험 준비중에 계속 cell 손실이 납니다.. Cancer Cell 깔고 24h 키운 후 약을 칩니다. 1, 2, 3, 4, 5, 6번이고 뒷번호로 갈수록 약을 늘려서 몇시간동안 키운뒤 cell harvest 합니다. 1, 2, 3번 cell들은 아주 잘 모여요. 그러나 4, 5, 6번 cell은 거의 안모입니다... 물론 cell 수는 모두 비슷합니다. 현미경으로 관찰 한 후 harvest해요.   cell harvest 과정은   1. media를 5ml tube에 담는다. 2. pbs washing 후 pbs도 5ml tube에 담는다. 3. TE를 넣고 2~3분 보관. 4. 5ml에 든 media +pbs를 well에 넣고 팁으로 cell을 모은다. 5. 다시 5ml 튜브에 넣는다. 6. centrifuge 1800rpm 3min  이때 너무 세게 돌려서 셀이 터져서 그런가 싶어 1700rpm으로 했으나 cell이 잘 안모여요... 약을 적게 친 애들은 여전히 잘 모이구요.  7. 펠렛 확인후 sup suction 8. pbs 1ml로 resuspention 9. centrifuge 13,300rpm 1min  혹시나 싶어 여기서 시간을 2~3min으로 늘려도 안모입니다.. 여기서는 거의 안보여요. 약을 적게 친 애들은 너무 잘 모입니다... 10. pbs suction   어느 부분이 문제일까요ㅠㅠㅠㅠ 박사님이 주신 protocol에서는 죽은 cell 까지 모을때는 1800rpm 으로 돌리랬는대 왜...약을 많이 친 애들은 안모일까요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

안녕하세요 현재 암세포에 물질을 처치해 apoptosis 관련 밴드를 띄우고 있는 대학생입니다.  다름이 아니라, 제가 암세포에서 물질을 처치한 후 단백질 수거를 하기 전에 control 과 물질처치군을 확인했는데 확실히 물질처치군이 셀의 수가 적어보였습니다.(debris는 둘 다 비슷했습니다) 그리고 cell counting을 했을 때도 확실히물질처치군의 세포 수가 적었습니다.  하지만 cleaved parp 밴드를 띄우면 계속 control에서 apoptosis가 더 잘 일어난 것처럼 control이 더 진하게 나옵니다.  이런 경우 있던 분 있으신가요 ㅠ?

안녕하세요? 처음 질문 올려보는 석사 1년차 대학원생입니다. 다름이아니라 제가 FACS를 통한 Apoptosis 실험을 시작하고 있는데 도저히 답을 얻을 수 없어서 질문을 드립니다... 우선 cell line을 이용하여 Annexin V/PI or 7AAD staining을 하고 있습니다. 다만 약물을 treatment하지 않은 DMSO만 처리한 control cell 에서도 FITC staining이 확연하게 관찰되고, 심지어 DMSO를 처리하지 않은 live cell에서도   Annexin V-FITC가 염색이 됩니다... FACS기기는 Beckman Coulter cytoflex를 사용하고 있으며 Annexin-V 및 Annexin-V binding buffer, cell staining buffer는 모두 Biolegend 제품을 사용하고 있습니다. adhesion cell을 수거할 때 Trypsin을 이용하여 harvest하는데 harvest직후 측정해보면 dead cell population이 심각하지는 않지만, cell staining buffer로 2회 wash 후 Ab를 처리하여 측정하면 FSC SSC에서 Dead cell population이 Live cell, Dead cell 모두에서 동일하게 측정됩니다ㅠㅠ cell line을 바꿔도 비슷하게 측정되어, 왜 live cell에서도 Annexin V-FITC positive하게 나오는지 해결 방법은 어떻게 해야하는지 여쭤봅니다.. 가능한 모든 경우의 수를 측정해보았지만 해결이 되지 않습니다ㅠㅠ 고수님들의 조언 부탁드립니다...   사진은 순서대로 어디서나 두개의 population을 보이는 cell line들.. unstaining 대비 모두 FITC positive 하게 나타나는  cell 들 마지막으로 Live cell에서도 모두 positive하게 나타나는 cell 들 입니다ㅠㅠ  

cell wall을 잠깐 물리적으로든 효소로든 열어서 약물이 들어가게 하고 다시 닫히게 하는 그런 방법은 아직 없나요…? lysis enzyme을 써버리면 세포가 그냥 죽어버리고.. 다른 방법은 없을까요

안녕하세요. 이번에 처음으로 Cell에서 RNA를 추출하게 되어 구체적인 Protocol을 만들어야하는데, 모르는 사항이 많아 여쭤보게 되었습니다 ㅠ Maturation까지 완료된 12 well plate에서 RNA를 추출한 후, 최종적으로는 PCR을 돌릴 예정입니다. 흔히 논문에는 Trizol을 많이 사용한다고 적혀있던데, 1) plate에 바로 trizol을 처리하는 것인지, 아니면 계대와 같은 과정으로 Typrsin-EDTA 처리를 한 후 media로 reaction stop후 trizol을 처리하는 것인지 감이 잡히지 않습니다. 2) 또한, trizol은 cell 몇당 얼마만큼 넣는것인지도 구체적으로 알려주시면 감사드리겠습니다. RNA 추출 키트의 경우 Invitrogen kit를 사용할 예정인데, 설명서에 따르면 lysis buffer를 이용하라고 되어있습니다. 3) 이 또한 trizol 처리를 한 후에 lysis buffer를 이용하는 것인지, kit를 사용할 경우 trizol 처리를 하지 않고, plate에 lysis  buffer만 처리하는지도 궁금합니다... 처음 실험을 진행하는 부분이라 미흡한 점이 많습니다,, 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ      

안녕하세요. 면역학 실험실에서 연구중인 대학원생 입니다. 요즘 t cell이용하여 LDH assay 통한 독성테스트 중입니다. 보통 calcein을 이용하여 했는데  96well에 target cell, effector cell을 100ul씩 넣을때 target cell의 media에 resuspension을 해서 loading하는데  target cell이 293T일 경우 DMEM + 10% FBS로 culture하고 있어서 그대로 이 media에 하면 될지.. 다른 논문들에서는 RPMI를 쓰는 것 같아서요.. 그리고 car t cell 이용하여 독성테스트의 경우 O/N으로 실시하는데 이때 cytokine은 따로 넣을 필요가 없는 것인지..  논문을 찾아봐도 도통 찾질 못하겠네요.. 고수님들 알려주시와요

고2 의학동아리 학생인데 mic실험을 해보려고 합니다. 고등학생인만큼 수준에 맞게 조건을 최소화해서 하려고 하는데요. 예산이 20만원 정도인데 생물나라에서 대장균을 사보려고 했는데 너무 비싸더라고요. 혹시 수족관에 쓰는 생균제 박테리아를 써도 될까요? 안되면 손에 있는 세균이나 변기, 문 손잡이 같은 데에 있는 세균은 써도 되나요? 아 그리고 과산화수소를 쓸 건데 가능한가요?  

  안녕하세요. 저는 석사과정 중에 있는 대학원생 입니다. 현재 HCT116 세포에 물질 처리로 인해 apoptosis가 유발되는지를 알아보는 실험을 FACS 측정을 통해 알아보고 있습니다. 그러나 FACS operator 분이 따로 계시질 않아 직접 기기를 사용하는 중이고, 할때마다 이게 맞는 data인지.. 아닌지 .. 구분이 잘 안되서 어려움을 겪고 있습니다. sampling 하는데는 BD의 FITC annexin V Apoptosis Detection Kit를 사용하고 있습니다.  프로토콜은  1. 6 well plate에서 HCT116 2x10^5 cells/ml 배양 후 80% 자랐을 때 물질 처리 24h 2. Trypsin으로 cell harvesting 3. Cold DPBS로 2번 washing 4. 1X Binding Buffer로 resuspension 하여 1x10^6cells/ml의 농도로 맞춤 5. Cell 100ul (1x10^5 cell)을 tube에 옮김 6. sample에 Annexin V FITC 5ul와 PI 5ul를 첨가 7. Vortexing 이후 RT에서 차광한 상태로 15min incubation 8. 1X Binding buffer를 400ul 첨가 9. 1시간 이내로 FACS 찍기 이렇게 하고 있습니다. 첨부파일로는 이전에 제가 실험했던 facs data를 첨부하였고요,   여기서 궁금한 점 1) unstain sample에서 gain값, gating, singlet gating 을 먼저 해준 뒤 FITC, PE single positive에서는 각각 compensation만 해주면 되는건지? compensation도 했다면 이후 샘플들은 그냥 쭉 측정하면 되는지? 2) 지금 data의 FITC/PE 그래프 보면 signal 모양이 논문과 다르게 너무 artificial한데 이러한 원인에는 무엇이 있는지? 3) 현재 제 data가 맞게 나온건지 ㅠㅠ...?     혼자서 하려니 너무 힘들고 진전도 없는거 같아서.. 이렇게 도움을 청해봅니다 ㅠㅠ 고수님들 부디 도와주세요 ~~        

BCBM과 nanoparticle 관련 논문을 읽다가  'mice treated with (    )-loaded NPs(...) showed the latest loss of body weight, suggesting the modest intervention of progress of BCBMs.' 라는 문장을 많이 접했습니다!  혹시 body weight와 intervention of progress of BCBM의 연관성을 알 수 있을까요?? 척척석사,박사님들 도와주세요~~~!!! 

안녕하세요. 실험 관련 질문은 아니지만.. Viral infection으로 인해 발생하는 cell death는 necrosis인가요? 아니면 intrinsic 또는 extrinsic apoptosis인가요?

안녕하세요.  BCA assay 과정에서 의문점이 생겨 질문드립니다. 저희 Lab에서는 sample preperation을 할때 lysis buffer를 사용하지 않고 2X laemmli buffer를 넣고 100도에서 7분가량 끓여 만들고 있습니다. 1. Sample prep에서 BPB를 넣지 않은 buffer면 정량이 가능하다고 들었는데 boiling을 통해 끓여 protein 변성 후 centrifuge로 supernatant를 따면 침전물을 제외하고 순수 protein만 얻을 수 있을까요? 2. 1항의 방법을 통해 얻은 protein으로 standard curve를 만들 수 있나요? protocol도 간단히 알려주시면 감사하겠습니다..   항상 답변해주시는 분들께 감사드립니다.