안녕하세요. 물질의 보호효과를 보기위해서 pretreat 개념으로 약물 처리 후 독성을 쳐서 cell viabilty를 확인하고자 mtt assay를 진행 중에 있습니다. 여러 프로토콜을 찾아보다가 저희 실험실에서 사용되어온 프로토콜이랑 달라 여쭤봅니다. 저는 cell seeding 24hr뒤 약물 처리 시간 지난다음 독성물질 24hr을 처리한 뒤 MTT 시약을 처리하는 데요. MTT 시약 5mg/ml 을 pbs에 녹인 후 1/10 dilution(0.5mg/ml) 된 mtt 시약을 처리합니다. 대부분의 프로토콜에서는 미디어 제거 후 페놀레드가 없는 미디어 90ul+mtt시약(5mg/ml) 10ul 처리하던데 저희 방에서는 페놀레드가 없는 미디어 대신 pbs에 희석하여 처리하는데 괜찮은 걸까요? cell culture medium에 희석해서 사용해야하나요? 정리하자면 저희방에서는 0.25g/50ml (10xmTT시약)이라 칭하고 1x로 희석하여서 바로 처리하는데 그 희석 용액이 pbs인데 맞는 건가 해서요. ㅠㅠ cell culture medium을 사용해야한다면 MEM gibco 제품 사용하고있는데 혹시나 MEM phenol red 없는 제품 사용하시는 분 계시면 답변 부탁드리겠습니다.

APC gene mutation 된 MACF10를 ctl 10A와 비교하여  b-catenin 의 nuclear translocation을 confocal로 live image 찍으려고 합니다. cell이 살아 있는 상태여야해서 fix는 안될 것 같은데 Ab가 nucleus안까지 들어갈까요? cell에는 damage 주지않으면서  Ab를 넣는 방법 뭐가 있을까요?   의견 부탁드립니다.

흰색 가느다란 줄 같은게 보이는데 문제가 있는건가요? 배지를 갈아줘야하나요?

96 well plate에 같은 양의 cell을 seeding 하고 농도를 다르게 해서 시약을 처리하였습니다.  plate를 한개는 10,000 cells/well, 다른 한개는 100,000 cells/well로 10배 차이나게 해서 두 plate를 깔고 시약의 처리농도는 각 plate마다 같게 하였고 24시간 처리 후 CCK-8 assay를 하였습니다. 시약의 농도가 높아질 수록 viability가 감소경향을 보이는 것 같기는한데요,  문제는 cell이 10배 높게 seeding 된 plate에서 viability 감소경향이 더 가파릅니다.  10,000 cells per well plate에서는 비처리군과 가장 높은 처리군의 차이가 10%가 안되는데, 100,000 cells per well plate에서는 30% 정도 차이가 날정도로 가파르게 감소합니다.  제가 생각할때는 cell이 10배나 차이가나는데 만약 시약에 독성이 있다고 하더라도 cell이 더 적은 쪽에서 급격한 감소를 보일 것이라고 생각했는데 그반대라 오히려 납득이 안되서요..   이런경우가 가능할지.. 혹시 아신다면 왜 그런지 알려주실 수 있으실까요..  

LIVE/DEAD™ Cell Imaging Kit 이용하여 셀 염색 진행하고 있습니다.   petri dish에 cell suspension (DMEM) + 염색약  -- 1:1 15분 염색 후 관찰하는데, live/dead 색이 동시에 보이는 세포가 존재해서요.   dead cell 같은 경우에, raw data에서 너무 보이지 않아 형광 이미지가 잘 보이도록 스케일을 조절해준 결과입니다. 그 스케일을 live cell의 이미지에도 적용했습니다! (HaCaT cell 입니다!)

현재 SW1353 세포에 H2O2 와 샘플을 처리해서 샘플의 H2O2에 대한 보호능을 보고 있습니다. 그런데 문제가, 같은 농도의 H2O2를 같은 시간 처리해도 CTL 군에서 어떨땐 20% 정도의 생존률이 나오다가 어떨땐 40% 대의 생존률이 나오는 등 재현성이 잘 안나타나네요. 이런식이면 샘플의 효능 측정도 일정하지 않을텐데 말이죠. 이런경우를 겪어보신 분이나 원인을 알고 계신 분이 계실까요?

CCK-8을 이용한 cell viability 측정에서 microplate reader기로 흡광도를 측정하는데요. 적정 CCK-8 incubation time을 정해야 해서 연달아 찍어봐야 하는데 이럴때 뚜껑을 씌우고 reading 하면 안될까요? 이 실험만 하면 잠깐 열고 찍어도 되겠는데, 불행히도 같은 plate 내에 다른 실험군이 있어서 몇일 더 culture 해야 해서 가급적이면 뚜껑을 안열고 싶네유.. ㅠㅠ    

저는 현재 NK cell을 activation 시키는 추출물을 찾는 실험을 하고 있는 대학원생입니다. 현재 그 추출물이 NK cell을 activation 시키는지 확인하기 위해 recombinant IL-15과 비교하려고 treat하였습니다. 근데 제가 현재 사용하고 있는 NK cell은 IL-2가 들어가지 않는 NK-92MI 입니다. 이미 활성화가 되있는 것인지 recombinant IL-15를 넣어도 control(IL-15를 넣지않은 군)과 차이가 나지 않습니다. NK cell activation 실험에 NK-92MI을 사용하는게 맞는지 궁금합니다.. 

polydopamine (PDA) 와 Indocyanine green(ICG) 약물의 역할은 무엇인가요? 자료를 검색해도 잘 나오지 않아서 질문드립니다.

well 에 시료 주입할때 팁을 배지에 닿게 하시나요 아니면 well 벽면으로 주입하시나요? 보통 팁으로 액체를 따면 지정량보다 좀 더 많이 들어가잖아요? 배지에 직접 주입하면 실험 결과가 부정확하겠죠?

안녕하십니까 치과 보건학 전공자입니다. 현재 치과재료에 항균 능력과 세포생존율을 보려고 합니다. 비전공자라 여러 실험 방법을 찾아보고 알아보고 있는데,   제가 여러 관련 논문을 알아본 결과 할 수 있는 방법 중 Disk diffusion method 으로 알아보려고 합니다. 비전공자인 제가 직접 실험 해볼 수 있는 그 외에 까다롭지 않은 실험방법이나 실험 방법 관련된 자료를 공유해 주실수 있으실까요?

기초적인 질문입니다. hemocytometer 에서 12.5 UL를 넣는다고 알고있는데 이 이유는 무엇인가요?

MTT assay 0.5%로 쓰고 있는데 약물을 treat하고 현미경으로 IC50가 대충 요정도겠구나 예상하고 결과를 찍어보면 제가 예상한것보다 약 2배 높은 농도에서 IC 50가 잡히는데 이유가 뭘까요?

Mtt로 간암세포의 viability를 확인하고 있습니다. 1. Hepg2 cell을 96well에 씨딩, 24시간 배양 2. 에탄올 처리하여 24시간 배양 3. mtt 처리 의 순서로 진행 중입니다 6%의 높은 농도까지 사용했는데도 viability가 떨어지지 않습니다.. 이론상 말이 안되는 것 같은데 무엇이 문제일까요..? Culture 및 희석에는 MEM 배지 사용하였고, 6% etoH로 처리하고자 하는 경우에는 100% absolute ethanol을 60%로 희석하여, MEM배지 180ul + 60% etoH 20ul 처리하여 최종적으로 6%가 들어가게 하였습니다. 도움 부탁드리겠습니다ㅜㅠ

안녕하세요 제가 있는 곳에는 FACS (유세포분석기) 장비가 없어서  다른곳으로 이동하여 분석을 해야 합니다.   샘플은  당일 들어온 사람의 조직에서 세포를 추출하여  이 세포를 가지고 안티바디 염색 + FACS 를 찍어야 하는데 분석장비실에서는 라이브셀과 PFA고정된 세포랑 결과가 다를수 있기 때문에 라이브셀을 권장합니다.   문제는 장비예약은 미리 해두어야 하고 그날에 샘플이 들어올지 미리 알 수 없다는 것입니다 그렇다면 2-3일전에 샘플이 들어온다면 이 세포를 미리 추출해서 최대한 고정없이 분석날까지 살려둘수 있는 방법은 뭘까요?    

안녕하세요. 세포주를 이용한 기능성평가 실험 중 문제가 생겨 문의드립니다. 시험물질 처리 시 최종 농도에서 pH가 11까지 올라가는 경우 pH를 7.4 수준으로 맞춰줄 수 있는 방법이 있을까요?? 버퍼를 사용하여 stock을 만들면 어느정도 완충이 될까하여 물질을 PBS에 녹여서 처리해보기도 하고, 세포배양배지에 바로 녹여서 처리해봐도 pH가 너무 높아요..  이 경우 HCL을 이용하여 적정을 해야할까요? 좋은 아이디어나 경험이 있으시면 조언 부탁드립니다.