실험 관련 내용은 아니지만 여쭙고 싶은게 있습니다 암세포는 성장인자 같은 외부 신호가 없어도  G1기 검문 지점을 지날 수 있나요? 만약 그렇다면, 역으로 암세포가 G1기 검문 지점을 통과할 수 없게 만드는, 즉 G0 성장 정지 상태에 계속 머물게하는 외부 신호를 찾는 연구를 통해서 암세포가 분열할 수 없게 만들 수 있지 않을까요? 혹시 이러한 원리를 가진 항암 요법이 사용되고 있나요? 

안녕하십니까 먼저 U0126은 항산화 물질로 작용한다고 알고있었습니다. 하지만 밑에 논문에서 가져온 자료를 보면 U0126을 처리한 군에서 형광 세기가 강하게 나온걸로 보아 ROS가 대조군에비해 증가한걸 알수있는데요.. 그림 자료는 MCF7세포에 처리한 상황입니다.. U0126이 왜 이런 결과를 나타낸건지 알려주실 고수분 계신가요??

안녕하세요 7월의 첫 글이네요 질문이 있어 들렀습니다!!   어제 Cell stock를 만들던 도중 든 생각인데 1. Stock은 cell cycle중 어느 phase일 때 만들어야 하는건가요? log phase인가요 stationary phase인가요??.. 2. 만약 어느 bacteria가 16시간이 지나면 death phase에 진입한다고 알려져 있다면 한다면 10ml liquid medium에 single colony를 접종하고 1L liquid medium에 single colony를 접종했다면 전자가 영양성분들이 더 빨리 소실될테니 후자보다 훨씬 빨리 death phase에 진입할 것 이라는 제 생각이 맞을까요?? (쓰다가 생각해보니 이건 제가 직접 실험해봐도 재밌을 것 같네요!! OD600값을 재서 cell cycle중 어느 단계인지 알 수 있겠군요) 3. 만약 훨씬 많은 volume의 media에서 incubation하여 영양성분들이 소실 될 걱정이 없다면 death phase에 진입하는데 막 며칠이 걸리고 그럴 수 있는 건가요..?? 간단하고 어이없을 질문일거 같은데 ㅜㅜ 아직 정말 많이 부족한 석사 1학기 생이라서,, 너무 궁금해서 못 참고 질문을 올려봅니다 ㅜㅜ  

안녕하세요 현재 ROS activity, Apoptosis rate에서 Apoptotic cell 증가 확인 후 Cell cycle analysis 진행중인 대학원생입니다...   논문에서 나온 프로토콜로 진행중인데 도저히 G0/G1 phase, S phase, G2/M phase 층 생기는게 관찰되지 않습니다. 이렇게 찍혀버리는데 왜 층이 안생기는지 모르겠어요...   프로토콜은 다음과 같습니다. 1. 6well plate에 well당 10만 seeding 2. chemical 처리 후 24hr treatment. 3. Media, DPBS washing buffer, Trypsin-EDTA 후 Media 추가한 용액까지 전부 모음. 4. 상층액 제거 후 DPBS resuspension, 300g로 5분 centrifugation 후 상층액 suction. 5. 상층액 suction 후 각 PBS 500ul로 resuspension 6. chilled 70% ethanol in DW로 4.5ml 약하게 vortexing 하면서 첨가 7. 4도 냉장고에 30분 이상 incubation (or more) 8. incubation 후 300g로 5분 centrifugation. 9. 상층액 suction 후 PBS 5ml로 resuspension 10. 300g로 5분 centrifugation. 11. 상층액 제거 후 PI staining solution (0.1% Triton X-100, 100ug/ml RNaseA, 15ug/ml PI in PBS) 각 Sample당 1ml로 resuspension후 37도에서 10분 암조건으로 incubation 12. FACS 측정.   여기서 혹시 제가 어떤 문제가 있을까요...? 프로토콜 논문을 2개를 찾아보면서 이것저것 1달을 해봤는데 도저히 층이 생기지 않아서 여쭤봅니다..... 살려주세요.... cell cycle했던 사람들이 다 졸업하거나 사라져서 물어볼 사람이 없어요,,,

안녕하세요 FACS BD calibur를 이용하여 drug 처리한 샘플의 apoptosis 를 확인하는 실험을 하고 있습니다.  Annexin V 는 사용하지 않고 일단 PI staining 만 하여 sub-G1 증가를 확인하려고 하는데요. drug 처리 하였을 때 cell proliferation 은 감소하는데 control, treat에서 sub-G1 및 다른 cell cycle 마저도 변화가 없어서 답답하여 질문 드리게 되었습니다. 첨부 된 피피티에서 위가 control, 아래가 treat 입니다. 일단 제가 하고 있는 프로토콜은요 1. cancer cell에 드럭 처리하여 24, 48시간 후 cell harvest (미디어 까지 다 따줍니다) 2. 150*10^4 의 셀을 모아 센트리 돌려서 미디어 석션, PBS wash 두번  3. 70% ethanol fixation, FACS 찍기 전까지 -20도 보관 4. FACS 찍는 날 샘플 센트리 돌려서 ethanol 석션, cold PBS wash 두번, cold PBS 에 cell suspension 5. RNase 5ul 넣고 30 분 상온에서 incubation, 10분마다 약하게 볼텍싱 6. PI 12.5ul 넣고 약하게 볼텍싱 후 10분 ice 에서 incubation 후 FACS 찍기 입니다.   혹시 왜 죽은 셀들이 FACS만 찍으면 안보이고 sub-G1에 변화가 없는지 아시는 고수님 계실까요ㅠㅠ 감사합니다. 

 specific growth rate를 보통 log phase에서 구하는 것이 stationary phase에서는 생성되는 cell과 사멸하는 cell의 수가 비슷하여 유의미한 값이 나오지 않고, death phase에서는 사멸하는 cell의 수가 더욱 많아 specific growth rate 값이 양수가 될 수 없기에 log phase에서 구하는 것인지 궁금하여 질문드립니다.   또한 만약 death phase에서 specific growth rate를 구한다고 하면 음수가 나올 것인데 이를 성장을 하지 않는다고 판단하여 0으로 보는 것과 음의 성장을 하고 있다고 판단하여 음수의 값을 가진다고 보는 것, 둘 중 어떤 것이 맞는 것인지 궁금하여 질문드립니다.

안녕하세요. 현재 진행 중인 cell cycle analysis로 애를 먹고 있어서 처음으로... bric에 질문을 올리게 되었습니다. 혹시 아시는 분 또는 이와 비슷한 경험이 있으신 분 있으시다면 공유해주시면 큰 도움이 될 것 같습니다.ㅠ [1] 저의 실험 조건은 다음과 같습니다. 1. human primary cell로 실험 중 (human biopsy를 가지고 해서요ㅠ). 2. FACS sorting 후 cell 수가 얼마 나오지 않기 때문에 5k의 cell을 가지고 histogram (G1,S,G2 %)을 얻으려고 합니다. 3. PI staining을 하고 있으며, 70% ethanol을 fixative로 사용 중입니다. [2] 어려움 1. 10k로는 어느정도... 성공을 했는데 (이것은 cell line으로 성공한 것입니다.).. 5k는 예쁜 histogram이 나오지 않네요.. FACS에서 읽히는 cell수도 너무 적구요.. 한 300-400 정도입니다.. 쉽지 않네요 ㅠㅠ [3] 아래의 질문에 어떻게 생각하시나요? ㅠ 1. 저는 70% ethanol fixation하고 나면 cell이 buoyant해지기 때문에 cell loss가 많아서 그런가해서.. fixation방법을 바꿔야하는지 생각 중입니다. 2. ethanol fixation하고 cell down, suction 후, 뒤져본 대부분의 protocol에서는 pbs로 2번 washing 이 있는데... pbs washing을 skip하고 바로 PI (in PBS) staining soln.을 치면 cell loss를 줄일 수 있지 않을까... 생각 중입니다.. 3. reference 찾아보니.. 물론 거의 cell line으로 해서 그런것이겠지만 1000k 정도 되는 cell로 하던데... primary로 저렇게 적은 수로 cell line은 하는게 당최.. 가능한 것인지.. 몰겠습니다. ㅠ    답변 감사드립니다.

과학실험을 진행하려고 하는데요.. 일상생활에서 세균이 많을 곳을 두가지 고르고 그 곳에서 3m piette swab(BPW)로 세균을 추출하고 그 용액을 배지에다 도말하고 배양기에서 40도에서 24시간 있은 후 미리 생강을 빻고 에탄올에 넣은 후 파라필름으로 비커를 막고 24시간 기다린 후 상류층을 피펫으로 추출한 후 거름종이로 걸러서 만든 추출물을 배지에다 도말해야 하는데 여기에서 추출물을 그냥 스포이트로 2방울 떨어뜨린후 도말하려고 했는데 만약 그렇게 되면 곰팡이 같은게 피어있는 상태에서 위에 쓱쓱 바르는 거라서 안 될 것 같더라고요.. 일단 바로 같이 세균 도말하고 천연항생제추출물을 떨어뜨리면 세균이 안 자랄 것 같아서 세균배양을 하고 시간 간격을 둔 다음 천연항생제 추출물을 접종하려고 하는 건데.. 어떻게 해야 할지 모르겠어요ㅠㅠ 아시는분 도와주세요 참고로 아직 어리숙하기에 용어선택 잘못해서질문했을수도 있어요 그리고 세균 배양기에 24시간이 좋을까요 48시간이 좋을 까요 천연항생제 접종하기 전이요

안녕하세요.  제가 facs(유세포 분석)으로 cell cycle을 확인하고 있습니다.    여러 번 시도하였지만 결과가 명확하게 나오지 않아 프로토콜을 공유하고 조언을 얻고자 질문 올립니다.   1. 약물처리한 대조군과 실험군의 세포를 트립신으로 cell down (15mL conical tube) 2. 1xPBS 1mL로 워싱 후 다시 cell down(1000rpm, 3min) 3. cell fix 단계 - 1mL 1XPBS로 cell을 풀어준 후  - 9mL의 70% ethanol(v/v PBS)을 약하게 vortexing 해주면서 넣어준다 - 35 min동안 -20도에서 보관 ( overnight 하시는 분도 봤습니다... 아마도 시간을 더 늘려야할까요...?) 4. fix 후 2000rpm, 5min centri 5. 1mL 1XPBS로 cell을 풀어준 후 1.5mL micro tube로 옮긴다  6. 8000rpm, 5min, centri washing 7. PI 농도 (500ug/mL)로 총 부피 500uL를 넣어 RT, 암실, 30min 염색 8. facs 분석 PI정보: FxCycle™ PI/RNase Staining Solution (cat. F10797) Analyze using 488-nm, 532-nm, or similar excitation, and collect using 585/42 bandpass filter or equivalent. 샘플만 제가 준비하고 분석은 맡기는거라 결과가 항상 분명하게 cell cycle 구간이 나눠지지 않는 것같습니다.  위는 대조군 아래는 실험군 결과입니다.    프로토콜이 잘 못된 걸까요...? 아님 raw data를 분석해봐야 할까요,..?   도무지 감이 잡히지 않아 질문 올려봅니다....    

안녕하세요. 제가 cell migration 실험을 하고 있는데 protocol이 없어서 고군분투하고 있습니다.ㅜㅜ cell migration을 하기 위해서 ibidi회사의 2well dish를 사용하고 있습니다. 한개의 dish는 None, 한개의 dish에는 IGF-1처리를 하려고 합니다. 저희 위에 졸업하신 선배님의 결과를 그대로 해보기 위해서 논문만 보고 제가 알아서 하고 있는 중인데요. 순서로는  1. dish에 well당 셀을 3*10^5cell/ml , 70ul씩 seeding을 하고 2. 하루뒤에 셀이 가득 성장하면 starvation을 24시간을 하고 3. suction후 well을 핀셋으로 떼고 4. none- dish : fbs없는 배지만 넣고 , treatment-dish: fbs없는 배지에 igf-1을 넣어 원하는 농도를 만들고  5. dish에 2ml씩 넣고 바로 사진을 찍고 6. 2시간 뒤에 사진을 찍으려고 합니다.   교수님께서는 2시간이면 충분하다고 하셨는데 2시간이 되어도 셀이 0시간때와 동일합니다. 몇번의 실패로 한번 3일동안 인큐베이터에 그냥 둬봤는데도 셀이 이동하지를 않습니다. ㅜㅜ 제가 머가 잘 못된걸까요?.... treatment도 배지도 다 지금까지 계속 잘 사용하고 있는 시약들입니다. 

안녕하세요. cell cycle gating 관련 문의드립니다.   aneuploidy를  PI staining을 통해 분석하고자 하는데 어떻게 gating 을 하는것이 맞는지 모르겠어서 질문 드립니다. 보통 cell cycle 분석시 gating을 Gate3부분만 잡아서 histrogram으로 보고 있는데요.  주로 cancer cell에서 gate4 부분이 많이 생긴다고 하는데 그 이유가 궁금해요... 혹시 이부분을 aneuploidy로 볼 수 있는 건가요?? chromosomal instability에 의해서 gate4 부분이 증가 할 수있나요?   아시는 선생님들 답변 부탁드립니다ㅠㅠ 

식물은 생장점과 형성층 조직을 관찰하면 세포분열 중인 세포를 쉽게 관찰할 수 있는데, 동물세포는 거의 모든 세포가 분열 중이니 어떤 조직을 관찰해야 할지 잘 모르겠습니다. 어떤 조직을 관찰해야 세포 분열을 잘 확인할 수 있을까요? 또 관찰에 필요한 염색약은 메틸렌블루로 하면 될까요?

제가 그람 염색 실험을 준비하고 있는데요. 대장균과 황색포도상구균이 필요해서 "살아있는 대장균"과 "살아있는 황색포도상구균 "를 구매했습니다. 근데 이 용액을 배양시켜서 사용해야하는건지 바로 사용해도 되는건지 잘 모르겠어서 질문합니다! 또한 사용시 10배 희석 시켜서 사용하라는데 그냥 사용해도되는지, 만약 희석해야 한다면 어떤 것과희석 시켜야하는지 궁금합니다!

Double Thymidine block 이후 PI로 염색하여 FACS로 cell cycle을 찍었는데 궁금한 점이 생겨서 질문 드립니다   Thymidine block은  Transfection 후 24 hrs culture -> Thymidine 추가 후 18 hrs culture (final concentration 2 mM) -> PBS로 wash 후 fresh media에서 12 hrs culture -> Thymidine 추가 후 16 hrs culture (final concentration 2 mM) -> PBS로 wash 후 fresh media에서 release 하였습니다. 일단 release 후 0 h 샘플에서 피크는 하나처럼 보이는데 그 피크가 G1기에만 있는 것이 아니고 G1~M기에 걸쳐서 큰 피크처럼 보입니다. 참고한 protocol에 따르면 원래 첫번째 Thymidine을 처리하고 새로운 media에서 9 hrs culture를 해야하는데 12 hrs를 하고, 두번째 Thymidine 처리 시간도 18 hrs을 해야하는데 16 hrs으로 짧게 처리하였습니다. 그래서 아직 G2/M기의 cell 들이 G1기로 넘어가지 못한 걸까요? 어떻게 실험 방법을 수정해보면 좋을지 의견 부탁드립니다.   그리고 Mock control과 sample의 G2/M기를 비교해보면, 6시간에서는 sample의 G2/M기가 더 낮고, 12시간에는 비슷해졌다가 오히려 24시간에서는 sample의 G2/M기가 더 높아졌습니다. 0-12시간 까지는 sample군에서 cell cycle이 지연되었다가, 12시간 이후 cell cycle이 오히려 더 빨라져서 해석을 어떤 식으로 해야할 지 모르겠습니다,,   도움 부탁드립니다!!

플라스미드가 없는 세균을 이용하여 변이 실험을 진행하려는 한 고등학생입니다.  그치만, 어디서 플라스미드가 없는 세균을 판매하는지, 잘 모르겠고  어떠한 종이 플라스미드가 없는지도 잘 모르겠습니다 제발 도와주세요 ... ㅠ0ㅠ   어디서 팔고, 어떤 종이 플라스미드가 없는 세균인가요?

안녕하세요 선생님들 지금 alpha-factor로 yeast cell을 synchronize하려고 하는데 너무 안돼서  질문올려봐요  사용하는 strain은 BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)이구요  열댓번 해봤는데 딱 한번 성공하고 나머지는 같은조건으로해도 안먹어서  이 실험 해보신 선생님들의 프로토콜이나 노하우를 좀 알고싶습니다.  제가 지금 하고있는 프로토콜은 간략하게  seed culture->OD 0.3이 되게 sub-culture -> alpha-factor(10ug/ml) 2h 처리 -> SYTOX green staining 후 FACS 일단 이렇게 하고있습니다. 싱크로가 돼야 릴리즈를 하든 뭘 하든 하는데  싱크로 자체가 안되어서 뒷 실험을 못하고있습니다...  지금 yeast를 culture하는 media를 SD(dextrose,Yeast nitrogen base, ammonium sulfate, CSM) media 6~10ml 정도를 쓰고 있습니다.  대부분의 논문에서 YPD(yeast extract, peptone, dextrose)를 사용하길래 YPD로도 테스트해봤지만 계속 실패했고 운좋게 한번 성공한 것은  SD media에서 성공을했습니다.   지금 테스트해본 조건으로는 seed culture하는 시간을 12~24 시간, alpha-factor양(1x, 2x) , 처리시간(2~4h) 정도 입니다.  논문들에서는 깔끔하게 분봉이 하나가 나오는데 제가 실험하면 FACS 데이터 상 분봉이 거의 동일하게 두개가 나오는 경우가 대부분이네요 이 실험을 진행해보신 분들의 조언을 얻고싶습니다.