제가 cell cycle stage분석을 위해 PI staining을 하는 중인데, 문제가 G1 peak 왼쪽에서 대조, 실험군 모두 균일한 20%의 population을 보이고 있습니다. 처음에는 제가 cell 관리를 잘못하여 실제 sub G1 population인가 하였지만, brdu-7aad kit로 염색하였을 때에는 sub G1 population이 보이지 않는 것으로 보아서는 실험단계중에서 문제가 생긴 것 같은데 도저히 모르겠어서 질문합니다..  일단 프로토콜은 1. trypsin으로 cell harvest 후 PBS wash ( 1200 rpm, 상온 ) 2. cold PBS 500 ul로 resus. 3. -20도에 보관해둔 75% 에탄올 3ml을 vortexing하면서 (기계에 따라 강도가 다르지만 가장 약한 세기로 합니다) 떨어뜨려 fix 후 4도씨에 최소 2시간 incubation 4. 에탄올 원심분리로 제거 후 cold PBS 2ml로 wash * 2 ( 1500 rpm, 4 도) 5. RNase A가 들어있는 PBS 500 ul (100 ug/ml)로 resus 후 37도 water bath에서 30분 incubation 6. PI가 들어있는 PBS 500 ul (50 ug/ml, 최종농도 25 ug/ml) 추가 후 상온에서 15~30분 incubation 후 바로 detection 입니다. 추가로 결과 첨부하겠습니다. FSC-A/SSC-A, FSC-H/FSC-A gating 후 PE channel에 대한 histogram입니다. 고수분들의 도움을 요청합니다.. 읽어주셔서 감사합니다.

논문을 읽다가 궁금증이 생겨 구글링을 해보았지만 속시원한 답을 찾기 어렵네요ㅠㅠ

동물세포 배양을 통해 얻어낸 cell을 nanodrop형 분광광도계로 dna의 농도를 측정해서 cell cycle을 알아낼 것인데 단일 세포를 얻어내는 건 어떻게 하면 될까요?

분열하는 세포 특이적인 프로모터와 GUS gene(reporter gene)을 fusion해서 plant에 introducing하면 분열하는 세포만 염색이 될까요? ProCYCB1;4:GUS

도대체 어떻게 계산해야하는지 모르게습니다ㅠㅠㅠ 아시는분 제발 알려주세요

ug/ml를 ml로 계산하는 방법을 아직도 모르겠네요 단위 좀 알려주세요 ex) 1L = 1000ml 이런식으로요   1ml = ? ug/ml

처음에 7x10^5/ml cell을 0.2x10^5/ml로 dilution해서 2ml seeding 했습니다. 그래도 오늘 harvest 했는데 1.3x10^5/ml cell이였습니다. 다시 seeding을 0.2, 0.5, 1 x 10^5으로 2ml씩 seeding하려면 어떻게 해야하나요..??ㅠㅜㅠ 초짜인 저에게 고수님들의 자세한 설명 기다립니다ㅠㅜ

마이신 계열 항생제의 작용원리에 대해 궁금합니다 항생제가 유입된 직후부터의 과정을 알려주세요

미생물의 생장곡선 중 대수기의 성장 속도를 구할 때, 그냥 시간에 따른 세포수의 증가량을 구하는 것이 아니라 이 값에서 초기 세포수를 나누어 비성장속도를 구하는 이유가 무엇인가요? 명확한 이유가 궁금합니다!

실험 관련 내용은 아니지만 여쭙고 싶은게 있습니다 암세포는 성장인자 같은 외부 신호가 없어도  G1기 검문 지점을 지날 수 있나요? 만약 그렇다면, 역으로 암세포가 G1기 검문 지점을 통과할 수 없게 만드는, 즉 G0 성장 정지 상태에 계속 머물게하는 외부 신호를 찾는 연구를 통해서 암세포가 분열할 수 없게 만들 수 있지 않을까요? 혹시 이러한 원리를 가진 항암 요법이 사용되고 있나요? 

안녕하십니까 먼저 U0126은 항산화 물질로 작용한다고 알고있었습니다. 하지만 밑에 논문에서 가져온 자료를 보면 U0126을 처리한 군에서 형광 세기가 강하게 나온걸로 보아 ROS가 대조군에비해 증가한걸 알수있는데요.. 그림 자료는 MCF7세포에 처리한 상황입니다.. U0126이 왜 이런 결과를 나타낸건지 알려주실 고수분 계신가요??

안녕하세요 7월의 첫 글이네요 질문이 있어 들렀습니다!!   어제 Cell stock를 만들던 도중 든 생각인데 1. Stock은 cell cycle중 어느 phase일 때 만들어야 하는건가요? log phase인가요 stationary phase인가요??.. 2. 만약 어느 bacteria가 16시간이 지나면 death phase에 진입한다고 알려져 있다면 한다면 10ml liquid medium에 single colony를 접종하고 1L liquid medium에 single colony를 접종했다면 전자가 영양성분들이 더 빨리 소실될테니 후자보다 훨씬 빨리 death phase에 진입할 것 이라는 제 생각이 맞을까요?? (쓰다가 생각해보니 이건 제가 직접 실험해봐도 재밌을 것 같네요!! OD600값을 재서 cell cycle중 어느 단계인지 알 수 있겠군요) 3. 만약 훨씬 많은 volume의 media에서 incubation하여 영양성분들이 소실 될 걱정이 없다면 death phase에 진입하는데 막 며칠이 걸리고 그럴 수 있는 건가요..?? 간단하고 어이없을 질문일거 같은데 ㅜㅜ 아직 정말 많이 부족한 석사 1학기 생이라서,, 너무 궁금해서 못 참고 질문을 올려봅니다 ㅜㅜ  

안녕하세요 현재 ROS activity, Apoptosis rate에서 Apoptotic cell 증가 확인 후 Cell cycle analysis 진행중인 대학원생입니다...   논문에서 나온 프로토콜로 진행중인데 도저히 G0/G1 phase, S phase, G2/M phase 층 생기는게 관찰되지 않습니다. 이렇게 찍혀버리는데 왜 층이 안생기는지 모르겠어요...   프로토콜은 다음과 같습니다. 1. 6well plate에 well당 10만 seeding 2. chemical 처리 후 24hr treatment. 3. Media, DPBS washing buffer, Trypsin-EDTA 후 Media 추가한 용액까지 전부 모음. 4. 상층액 제거 후 DPBS resuspension, 300g로 5분 centrifugation 후 상층액 suction. 5. 상층액 suction 후 각 PBS 500ul로 resuspension 6. chilled 70% ethanol in DW로 4.5ml 약하게 vortexing 하면서 첨가 7. 4도 냉장고에 30분 이상 incubation (or more) 8. incubation 후 300g로 5분 centrifugation. 9. 상층액 suction 후 PBS 5ml로 resuspension 10. 300g로 5분 centrifugation. 11. 상층액 제거 후 PI staining solution (0.1% Triton X-100, 100ug/ml RNaseA, 15ug/ml PI in PBS) 각 Sample당 1ml로 resuspension후 37도에서 10분 암조건으로 incubation 12. FACS 측정.   여기서 혹시 제가 어떤 문제가 있을까요...? 프로토콜 논문을 2개를 찾아보면서 이것저것 1달을 해봤는데 도저히 층이 생기지 않아서 여쭤봅니다..... 살려주세요.... cell cycle했던 사람들이 다 졸업하거나 사라져서 물어볼 사람이 없어요,,,

안녕하세요 FACS BD calibur를 이용하여 drug 처리한 샘플의 apoptosis 를 확인하는 실험을 하고 있습니다.  Annexin V 는 사용하지 않고 일단 PI staining 만 하여 sub-G1 증가를 확인하려고 하는데요. drug 처리 하였을 때 cell proliferation 은 감소하는데 control, treat에서 sub-G1 및 다른 cell cycle 마저도 변화가 없어서 답답하여 질문 드리게 되었습니다. 첨부 된 피피티에서 위가 control, 아래가 treat 입니다. 일단 제가 하고 있는 프로토콜은요 1. cancer cell에 드럭 처리하여 24, 48시간 후 cell harvest (미디어 까지 다 따줍니다) 2. 150*10^4 의 셀을 모아 센트리 돌려서 미디어 석션, PBS wash 두번  3. 70% ethanol fixation, FACS 찍기 전까지 -20도 보관 4. FACS 찍는 날 샘플 센트리 돌려서 ethanol 석션, cold PBS wash 두번, cold PBS 에 cell suspension 5. RNase 5ul 넣고 30 분 상온에서 incubation, 10분마다 약하게 볼텍싱 6. PI 12.5ul 넣고 약하게 볼텍싱 후 10분 ice 에서 incubation 후 FACS 찍기 입니다.   혹시 왜 죽은 셀들이 FACS만 찍으면 안보이고 sub-G1에 변화가 없는지 아시는 고수님 계실까요ㅠㅠ 감사합니다. 

 specific growth rate를 보통 log phase에서 구하는 것이 stationary phase에서는 생성되는 cell과 사멸하는 cell의 수가 비슷하여 유의미한 값이 나오지 않고, death phase에서는 사멸하는 cell의 수가 더욱 많아 specific growth rate 값이 양수가 될 수 없기에 log phase에서 구하는 것인지 궁금하여 질문드립니다.   또한 만약 death phase에서 specific growth rate를 구한다고 하면 음수가 나올 것인데 이를 성장을 하지 않는다고 판단하여 0으로 보는 것과 음의 성장을 하고 있다고 판단하여 음수의 값을 가진다고 보는 것, 둘 중 어떤 것이 맞는 것인지 궁금하여 질문드립니다.

안녕하세요. 현재 진행 중인 cell cycle analysis로 애를 먹고 있어서 처음으로... bric에 질문을 올리게 되었습니다. 혹시 아시는 분 또는 이와 비슷한 경험이 있으신 분 있으시다면 공유해주시면 큰 도움이 될 것 같습니다.ㅠ [1] 저의 실험 조건은 다음과 같습니다. 1. human primary cell로 실험 중 (human biopsy를 가지고 해서요ㅠ). 2. FACS sorting 후 cell 수가 얼마 나오지 않기 때문에 5k의 cell을 가지고 histogram (G1,S,G2 %)을 얻으려고 합니다. 3. PI staining을 하고 있으며, 70% ethanol을 fixative로 사용 중입니다. [2] 어려움 1. 10k로는 어느정도... 성공을 했는데 (이것은 cell line으로 성공한 것입니다.).. 5k는 예쁜 histogram이 나오지 않네요.. FACS에서 읽히는 cell수도 너무 적구요.. 한 300-400 정도입니다.. 쉽지 않네요 ㅠㅠ [3] 아래의 질문에 어떻게 생각하시나요? ㅠ 1. 저는 70% ethanol fixation하고 나면 cell이 buoyant해지기 때문에 cell loss가 많아서 그런가해서.. fixation방법을 바꿔야하는지 생각 중입니다. 2. ethanol fixation하고 cell down, suction 후, 뒤져본 대부분의 protocol에서는 pbs로 2번 washing 이 있는데... pbs washing을 skip하고 바로 PI (in PBS) staining soln.을 치면 cell loss를 줄일 수 있지 않을까... 생각 중입니다.. 3. reference 찾아보니.. 물론 거의 cell line으로 해서 그런것이겠지만 1000k 정도 되는 cell로 하던데... primary로 저렇게 적은 수로 cell line은 하는게 당최.. 가능한 것인지.. 몰겠습니다. ㅠ    답변 감사드립니다.