안녕하세요 이제 막 2달된 대학원생입니다... 저희 실험실은 cancer cell 을 주로 다루는데 이때까지 아무도 해보시지 않으신 SH-SY5Y cell 을 제가 처음으로 맡아서 하게 되었습니다.. 그래서 더더욱 공부도 더 해보고 하고있는데요.. 세포주은행에서 p.26 을 받아서 subculture 해 왔었는데 bacteria contamination이 되어서 stock 도 다 버리게 되었습니다..ㅠㅠ  심지어 같은 인큐베이터를 쓰시는 다른분의 cell 마저도 오염 되어서 죄책감이 진짜 이만저만이 아닙니다....하.... 저희 실험실에서 아무도 한번도 이런적이 없다고 하는데 왜 저만 이렇게 자꾸 세포가 오염이 되는걸까요 ㅠㅠㅠ 진짜 너무 스트레스 받네요.... 이번에 세포주은행에서 p.19 로 다시 한번 세포를 분양받았습니다.. 진짜 이번마저도 그렇게 되면 대학원 생활 어떻게 해야할지 모르겠습니다 ㅜㅜ Media, trypsin, DPBS, cell freezer 등등 필요한 것들은 다 버리고 새로 만들어서 다시 한번 해보려고 합니다... 다른분들과 하는 방법도 다 똑같은 것 같은데 대체 무엇이 문제일까요....실험 진행도 안되고 다른분한테 피해까지 끼치고 진짜 멘탈이 나가버릴것같네요... 어떻게 하면 cell contamination 을 줄이면서 심기일전 할 수 있을지.. SH-SY5Y cell 은 어떻게 cell culture 를 하면 좋을지 제가 다시 심기일전 할 수 있게 도와주세요.... 항생제 농도를 더 높여야 할지 어떨지 ㅜㅜ 여러가지 방법 등등이요!!도와주세요!!! Media 는 DMEM (low glucose) + F12 + 10% FBS + 1% P/S(항생제) + 1% non-essential amino acid 를 사용하고 있습니다. 참고로 media contamination 은 인큐베이터에 넣어보고 확인했을 시 문제는 없었습니다...

세포 동결보존을 할 때 세포 수를 정해놓고 보관을 하는데 그 이유가 궁금합니다

MSC adipogenesis 실험하는데 oil red o staining 실험을 하게 되었는데 회사에선 해본적 없는 실험이고 관련 자료가 없어 실험방법을 찾아보았는데 이게 맞는 방법인지 확인해주시면 감사하겠습니다!   1. 4% formaldehyde 1ml 넣어주고 10분간 RT 2. PBS로 2번 washing 3. ORO 1ml 넣고 15분간 RT 4. 증류수로 한번 washing 해서 제거하고 증류수 1ml 넣고 관찰.   뭘 더 추가해야하거나 해야할 게 있을까요..?   ORO solution이어서 녹일 필요는 없어보입니다. 시그마 사의 O1391-250ml 을 쓸겁니다!

전에도 질문드렸는데 헤매고있어서 재질문드립니다..ㅠㅠ..   96 well에 poly l lysine을 코팅 처리해야하는데 제가 붙이려는 cell의 모든 논문에 아래와 같이 기재되어있습니다. 96-well microtiter plate was coated with 100uL of poly-L-lysine solution (0.2%, Sigma)   0.2%의 poly l lysine을 100ul 처리한다고 되어있는데 아무리 찾아봐도 sigma에 0.2%는 없고, 대부분 다른회사도 0.01% 또는 0.1%를 판매합니다... ㅠㅠ   그리고 다른 프로토콜이나 다양하게 찾아보면 0.01%조차도 희석해서 사용하는 경우가 많은데요..   왜 96well 코팅에 0.2%의 고농도로 깔려야 하는건지.. 왜 모든 논문이 0.2%로 써져있는데 왜 안파는건지 모르겠어요 ㅠㅠ..   그래서 파우더로 구매해서 0.2%로 만들어야하나 했는데 파우더 조차도 0.01%로 제조해서 쓰라고 되어있더라구요.   ㅠㅠ...뭘까요 대체

LB에서 cell harvest 할때    viability는 최대한 보존하면서 CFU는 그대로 유지시켜주는 resuspend 용 buffer가 있을까요?   그냥 식염수에다 풀면 될까요?

HAM F-10 media를 incubator에 넣고 warming 하는 동안 tube 뚜껑을 열어놓으라고 하시는데 이유를 잘 모르겠습니다. 그 외에도 다른 media들도 incubator에 넣을때 뚜껑을 열어놓으라고 하시는데 혹시 특별한 이유가 있나요?

안녕하세요. 세포배양의 많은 경험 없이 시작하다보니 그저 프로토콜 순서대로만 움직이는 것이 실력의 전부가 되어 버렸습니다... 그러다 보니 자꾸나는 오염에 특별한 대응책도 생각해보는 것이 너무나 어려워 도움을 구하고자 글을 남깁니다. 현재 배양중인 세포는 인체유래 지방줄기세포입니다.       셀 카운팅시 셀 수 및 viability 모두 좋으나, 청소된 인큐베이터에 넣고 하루만 지나면 뿌옇게 상층액이 변해서 나옵니다. 같은 세포를 계대해도 어떤 플라스크는 멀쩡하며, 어떤 플라스크는 아래와 같은 양상을 보입니다.  왼쪽/ 세포 넣기전 맑은 배지상태(정상 배양시, 맑은 상층액과 유사) 오른쪽/ 세포 넣은 후 24시간 뒤 오염?으로 의심되는 배지상태(불투명) 오염된 상층액과 셀이 담긴 모니터링 Flask에서 관찰할 수 있는 cell의 모양은 이런 모습이며, 오염된 상층액을 트리판 블루로 염색한 뒤 (그냥 궁금해서, 뭔가 보기 편할 것 같아서 해보았습니다;;) 얇은 셀카운팅플라스크에 깔아 관찰하면 상층액에 이런 붉은 건더기?도 보입니다. 이외 동글 동글한 것두 있습니다. 때론, 맑은 상층액에 곰팡이 포자 하나가 오르기도 합니다.   도대체 무엇이 문제일까요 미치고 환장하겠습니다. 저 건더기는 무엇인지, 의심되는 모든 의견들에 감사히 생각하겠습니다.

Carbon source로 olive oil을 사용하여 균주를 배양하고있습니다.    이 균주가 olive oil을 먹으면서 자라게 되는 것을 확인하기 위해 cell grouwth 를 측정하려고 하는데 olive oil에 의해 생기는 흰색의 emulsion 때문에 O.D측정이 상당히 어렵습니다.    이 경우 O.D를 측정하는 방법은 무엇이며 아니면 다른 방법으로 cell이 자라는 것을 확인할 수 있을까요?? 

NBT환원으로 ROS를 측정하는 실험을 짜고 있습니다.   1. MCHBSS (modified complete Hank's balanced salt solution) 라고 되어있습니다.  이해하기로는 뭔가 첨가해서 완성되어진 HBSS를 뜻한다고 생각했는데.. 실험에 참고하고있는 논문에는 딱히 성분이 써져있지않아서 더 찾아본 결과 MCHBSS containing 10 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM MgSO4, 24 mg ml−1 HBSS (Sigma). 라고 있더라구요.   10 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM MgSO4   를 HBSS 1X에다가 섞으면 되는걸까요? 24 mg ml−1 HBSS 이게 뭔지 모르겠습니다. 24mg/ml 이랑 같은말 같은데 HBSS 파우더를 또 구매해야되는걸까요 ㅠㅠ   다른회사꺼 HBSS 10X 액체시약이 있는데 그냥 이걸 써도될지...           2.  96well에서 cell 부착력을 주기위해 poly-L-lysine solution (0.2%, Sigma) 을 100ul 처리하라고 되어있는데요.   찾아본결과 보통 sigma 포함 다른 회사들은 0.01% solution으로 많이 팔고 또 그걸 보통 더 희석해서 사용을 하시더라구요.   sigma에 파우더로도 있긴하지만 .. 이걸 0.2%로 만들어서 ( 즉 ml당 2mg 녹여서) 사용하는게 0.2% 라는건지..   아니면 지금 계산을 잘못하고 있는건지 모르겠습니다. 0.01% 솔루션으로 20ul만 96well에 바르는 프로토콜도 있던데  또 많이 치게되면 독성이 있고, 적당량을 발라야 한다고 하니   0.01% 솔루션으로 0.2%로 사용을 하라는뜻을 제가 잘못 이해하고있는건지 모르겠습니다. ㅠㅠ        

안녕하세요. 세포를 분양받고 싶습니다. NK cell 을 얻고 싶은데..  논문을 검색하다보니 nk-92 cell line 이 있더라구요.   혹시 있으신분은 연락 주시면 감사하겠습니다   lethargic@naver.com 연락 부탁드려요...

안녕하세요. 현재 MEM배양액을 조제할때 Penicillin/Streptomycin 항생제를 1% 넣고 조제하고있습니다. 얼마전부터 곰팡이균 같은 오염이 관찰되어서 항진균제인 . Amphotericin B를  첨가하려고 하는데, 기존에 넣었던 항균제와 같은용량으로 첨가해도 될까요? 늘 항균제만 넣어왔어서 혹시나 첨가하는 용량이 다른가 해서요. 그리고   Penicillin/Streptomycin 와 Amphotericin B를 함께 첨가하여도 무관한지 궁금합니다. Amphotericin B 처음 사용해봐서 조심스럽네요, 혹시 항진균제가 세포의 성장 속도에도 관련이 있나요? 답변부탁드립니다 : )  

세균염색은 네이버 지식 백과에 따르면 세균을 특성에 따라 분류하고 관찰하기 쉽도록 물감을 이용하여 착색시킴이라고 합니다. 왜 살아있는 세균을 보는 것 보다 염색을 하고 현미경으로 보면 더 잘보이는 건가요?? 

nude mouse에 human cancer를 sc하려는데 보통 cell를 키울때 FBS를 먹이니 starvation을 두세시간이라도 해주는게 좋을까요? 아니면 harvest할때 wash해주는걸로도 충분하나요? xenograft 할때마다 mouse에 초기 inflammation이 너무 일어나요 붓기 빠지고 ip를 시작하려니 타이밍 잡기가 너무 어렵더라구요.. 보통 inflammation을 어떻게 잡나요?

안녕하세요. Raw cell 키우고 있는 학부생입니다. 다름이 아니라 cell freezing시 cell counting을 하시는지 궁금합니다. 저 같은 경우 T-25 flask의 경우 바이알 1개로 freezing하는데 T-75 flask의 경우 바이알 몇개로 나눠서 freezing하는게 좋을지 70-80% confluent한 상태가 아니라 꽉찰때 freezing해야하는지 궁급합니다. 또 IPA 들어 있는 freezing container에 넣어 영하 80도 냉장고에서 이틀 정도 보관하고 질소통으로 옮기려고 하는데 하루 지나고 이틀정도 보관해도 괜찮을지 궁급합니다...   도와주세요,,,,,

셀 실험을 해본지 오래되어서 부끄럽지만 질문 드립니다.   셀을 키워달라는 부탁을 받았는데  이게 무슨 균인지 확인이 안되나 락토바실러스로 추측됩니다.   질문은 이 균을 배양까지는 할 수 있으나 cell counting 방법을 몰라 질문 드립니다.  고체 배지의 경우 콜로니를 세면 되겠으나  액체 배지의 경우는 어떻게 셀 수 있나요? hemocytometer로도 카운팅이 가능한가요?

안녕하세요. 선배님들. 혹시 Hepatocyte 분리 과정에서 blood perfusion 과정시 확실하게 피가 빠지지 않았을경우에 collagenase 처리 과정에서 cell viability에 크게 영향을 미치는지가 궁금합니다. 미친다면 그 이유가 무엇인지 알고 싶습니다..