안녕하세요 이제 막 2달된 대학원생입니다... 저희 실험실은 cancer cell 을 주로 다루는데 이때까지 아무도 해보시지 않으신 SH-SY5Y cell 을 제가 처음으로 맡아서 하게 되었습니다.. 그래서 더더욱 공부도 더 해보고 하고있는데요.. 세포주은행에서 p.26 을 받아서 subculture 해 왔었는데 bacteria contamination이 되어서 stock 도 다 버리게 되었습니다..ㅠㅠ  심지어 같은 인큐베이터를 쓰시는 다른분의 cell 마저도 오염 되어서 죄책감이 진짜 이만저만이 아닙니다....하.... 저희 실험실에서 아무도 한번도 이런적이 없다고 하는데 왜 저만 이렇게 자꾸 세포가 오염이 되는걸까요 ㅠㅠㅠ 진짜 너무 스트레스 받네요.... 이번에 세포주은행에서 p.19 로 다시 한번 세포를 분양받았습니다.. 진짜 이번마저도 그렇게 되면 대학원 생활 어떻게 해야할지 모르겠습니다 ㅜㅜ Media, trypsin, DPBS, cell freezer 등등 필요한 것들은 다 버리고 새로 만들어서 다시 한번 해보려고 합니다... 다른분들과 하는 방법도 다 똑같은 것 같은데 대체 무엇이 문제일까요....실험 진행도 안되고 다른분한테 피해까지 끼치고 진짜 멘탈이 나가버릴것같네요... 어떻게 하면 cell contamination 을 줄이면서 심기일전 할 수 있을지.. SH-SY5Y cell 은 어떻게 cell culture 를 하면 좋을지 제가 다시 심기일전 할 수 있게 도와주세요.... 항생제 농도를 더 높여야 할지 어떨지 ㅜㅜ 여러가지 방법 등등이요!!도와주세요!!! Media 는 DMEM (low glucose) + F12 + 10% FBS + 1% P/S(항생제) + 1% non-essential amino acid 를 사용하고 있습니다. 참고로 media contamination 은 인큐베이터에 넣어보고 확인했을 시 문제는 없었습니다...

세포 동결보존을 할 때 세포 수를 정해놓고 보관을 하는데 그 이유가 궁금합니다

MSC adipogenesis 실험하는데 oil red o staining 실험을 하게 되었는데 회사에선 해본적 없는 실험이고 관련 자료가 없어 실험방법을 찾아보았는데 이게 맞는 방법인지 확인해주시면 감사하겠습니다!   1. 4% formaldehyde 1ml 넣어주고 10분간 RT 2. PBS로 2번 washing 3. ORO 1ml 넣고 15분간 RT 4. 증류수로 한번 washing 해서 제거하고 증류수 1ml 넣고 관찰.   뭘 더 추가해야하거나 해야할 게 있을까요..?   ORO solution이어서 녹일 필요는 없어보입니다. 시그마 사의 O1391-250ml 을 쓸겁니다!

전에도 질문드렸는데 헤매고있어서 재질문드립니다..ㅠㅠ..   96 well에 poly l lysine을 코팅 처리해야하는데 제가 붙이려는 cell의 모든 논문에 아래와 같이 기재되어있습니다. 96-well microtiter plate was coated with 100uL of poly-L-lysine solution (0.2%, Sigma)   0.2%의 poly l lysine을 100ul 처리한다고 되어있는데 아무리 찾아봐도 sigma에 0.2%는 없고, 대부분 다른회사도 0.01% 또는 0.1%를 판매합니다... ㅠㅠ   그리고 다른 프로토콜이나 다양하게 찾아보면 0.01%조차도 희석해서 사용하는 경우가 많은데요..   왜 96well 코팅에 0.2%의 고농도로 깔려야 하는건지.. 왜 모든 논문이 0.2%로 써져있는데 왜 안파는건지 모르겠어요 ㅠㅠ..   그래서 파우더로 구매해서 0.2%로 만들어야하나 했는데 파우더 조차도 0.01%로 제조해서 쓰라고 되어있더라구요.   ㅠㅠ...뭘까요 대체

사람들이 흔히 돼지피부와 인간의 피부가 유사하다고 말하는데, 그렇다면 그 피부 중에서도 어떠한 부분(EX: 지방세포가 차지하는 비율) 이 비슷하여서 비슷하다고 하는건가요? 또 그러한 결과를 어떠한 실험 방법으로 알게 되는건가요?

LB에서 cell harvest 할때    viability는 최대한 보존하면서 CFU는 그대로 유지시켜주는 resuspend 용 buffer가 있을까요?   그냥 식염수에다 풀면 될까요?

logp 0.1인 compound가지고 세포 실험을 하려고 합니다.  친수성 물질이여서 세포 안으로 들어가질 않을 것 같아서 제형을 바꿔보려고  했는데 (리포좀으로) 학교에 장비도 없고, 재료비도 비싸서 이 방법은 포기해야 할 것 같은데, 혹 좋은 방법이 있다면 선배님들... 도와주세요.

HAM F-10 media를 incubator에 넣고 warming 하는 동안 tube 뚜껑을 열어놓으라고 하시는데 이유를 잘 모르겠습니다. 그 외에도 다른 media들도 incubator에 넣을때 뚜껑을 열어놓으라고 하시는데 혹시 특별한 이유가 있나요?

    Facs를 찍으려고 합니다.  Cell을 trypsin으로 detach 한 다음에 harvest 하고 pi, annexin v5 염색 하기 전에 1X binding buffer를 넣은 다음 cell을 잘 풀어주는거는 알고 있습니다.  1X binding buffer를 넣어 주고 나서 4도씨에 몇 시간 정도 보관이 가능한가요?  binding buffer 넣어주고 염색을 바로 시켜야 하는 건가요?? 

안녕하세요. 세포배양의 많은 경험 없이 시작하다보니 그저 프로토콜 순서대로만 움직이는 것이 실력의 전부가 되어 버렸습니다... 그러다 보니 자꾸나는 오염에 특별한 대응책도 생각해보는 것이 너무나 어려워 도움을 구하고자 글을 남깁니다. 현재 배양중인 세포는 인체유래 지방줄기세포입니다.       셀 카운팅시 셀 수 및 viability 모두 좋으나, 청소된 인큐베이터에 넣고 하루만 지나면 뿌옇게 상층액이 변해서 나옵니다. 같은 세포를 계대해도 어떤 플라스크는 멀쩡하며, 어떤 플라스크는 아래와 같은 양상을 보입니다.  왼쪽/ 세포 넣기전 맑은 배지상태(정상 배양시, 맑은 상층액과 유사) 오른쪽/ 세포 넣은 후 24시간 뒤 오염?으로 의심되는 배지상태(불투명) 오염된 상층액과 셀이 담긴 모니터링 Flask에서 관찰할 수 있는 cell의 모양은 이런 모습이며, 오염된 상층액을 트리판 블루로 염색한 뒤 (그냥 궁금해서, 뭔가 보기 편할 것 같아서 해보았습니다;;) 얇은 셀카운팅플라스크에 깔아 관찰하면 상층액에 이런 붉은 건더기?도 보입니다. 이외 동글 동글한 것두 있습니다. 때론, 맑은 상층액에 곰팡이 포자 하나가 오르기도 합니다.   도대체 무엇이 문제일까요 미치고 환장하겠습니다. 저 건더기는 무엇인지, 의심되는 모든 의견들에 감사히 생각하겠습니다.

Carbon source로 olive oil을 사용하여 균주를 배양하고있습니다.    이 균주가 olive oil을 먹으면서 자라게 되는 것을 확인하기 위해 cell grouwth 를 측정하려고 하는데 olive oil에 의해 생기는 흰색의 emulsion 때문에 O.D측정이 상당히 어렵습니다.    이 경우 O.D를 측정하는 방법은 무엇이며 아니면 다른 방법으로 cell이 자라는 것을 확인할 수 있을까요?? 

제가 caspase3 kit로 활성을 보려고 합니다. 그런데, 세포를 모아서 lysis buffer로 lysis후에 protein 을 뽑아서 50ug으로 하면 된다고 하십니다 선생님이,,, 그런데 protocol을 보아도 몇 ug으로 해라 라는 말이 없고, 그냥 dilution해서 100ul를 adding하라고 되어있는데 혹시 실험 해보신 분 있나요,,? ㅠㅠ 제품은 invitrogen 입니다.

NBT환원으로 ROS를 측정하는 실험을 짜고 있습니다.   1. MCHBSS (modified complete Hank's balanced salt solution) 라고 되어있습니다.  이해하기로는 뭔가 첨가해서 완성되어진 HBSS를 뜻한다고 생각했는데.. 실험에 참고하고있는 논문에는 딱히 성분이 써져있지않아서 더 찾아본 결과 MCHBSS containing 10 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM MgSO4, 24 mg ml−1 HBSS (Sigma). 라고 있더라구요.   10 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM MgSO4   를 HBSS 1X에다가 섞으면 되는걸까요? 24 mg ml−1 HBSS 이게 뭔지 모르겠습니다. 24mg/ml 이랑 같은말 같은데 HBSS 파우더를 또 구매해야되는걸까요 ㅠㅠ   다른회사꺼 HBSS 10X 액체시약이 있는데 그냥 이걸 써도될지...           2.  96well에서 cell 부착력을 주기위해 poly-L-lysine solution (0.2%, Sigma) 을 100ul 처리하라고 되어있는데요.   찾아본결과 보통 sigma 포함 다른 회사들은 0.01% solution으로 많이 팔고 또 그걸 보통 더 희석해서 사용을 하시더라구요.   sigma에 파우더로도 있긴하지만 .. 이걸 0.2%로 만들어서 ( 즉 ml당 2mg 녹여서) 사용하는게 0.2% 라는건지..   아니면 지금 계산을 잘못하고 있는건지 모르겠습니다. 0.01% 솔루션으로 20ul만 96well에 바르는 프로토콜도 있던데  또 많이 치게되면 독성이 있고, 적당량을 발라야 한다고 하니   0.01% 솔루션으로 0.2%로 사용을 하라는뜻을 제가 잘못 이해하고있는건지 모르겠습니다. ㅠㅠ        

안녕하세요. 요즘 HepG2를 이용하여 간보호효과의 실험으 구상중인 대학원생입니다.  간보호효과와 관련하여 정상간세포를 이용하여 실험하는 것이 가장 베스트라고 알고 있습니다. 하지만 정상 간세포의 경우 실험하는데 제한이 많아 간암세포주인 HepG2 cell로 간 보호효과관련하여 많이 실험이 이루어지고 있는데요. 이럴경우에 HepG2 cell에서 간보호효과가 있다고했을 때, 이 실험에서 반대로 생각해보면, 암 증식효과가 있다고 할 수 있는게 아닌가 생각이 듭니다. 혹시 이부분에 대해서 HepG2 cell을 이용한 간보호효과는 암증식효과와는 다르다라는 내용의 논문이나 참고할만한 문헌이 있을까요?? 혹은 HepG2 cell에서 간보호효과가 인정된다는 내용의 참고할만한 논문이나 문헌, 식약처에 발표된 내용이 있을까요?? 논문에는 HepG2를 통한 간 보호효과에 대한 내용이 대부분이고 위와 관련된 내용은 찾아보기 힘들더라구요.    

안녕하세요. 세포를 분양받고 싶습니다. NK cell 을 얻고 싶은데..  논문을 검색하다보니 nk-92 cell line 이 있더라구요.   혹시 있으신분은 연락 주시면 감사하겠습니다   lethargic@naver.com 연락 부탁드려요...

안녕하세요. cell lysis 과정이 잘 되지 않는 것 같아서 질문드립니다.. 1. ripa buffer 넣고나서 아이스에 두면서 시간마다 볼텍싱을 해주고 마이크로 튜브에 옮기려고 했는데 가느다란 실타래 같은 것이 있더라구요.. 그래서 아이스에 두는 시간과 볼텍싱 횟수를 늘려서 했는데 실타래가 좀 남아있었습니다.. 이거 버퍼의 문제일까요...? 2. 상층액인 extract을 얻기 위해 원심분리기를 돌려주었는데 상층액에 1번과 같은 실타래..?(1번의 경우보다는 좀 더 가느다랗고 흐릿했습니다..)가 뜨더라구요.. 대체 이 실타래가 뭔지 모르겠습니다......