안녕하세요 저는 Raw cell을 이용해서 실험을 하고 있는 학생입니다. 다름이 아니라 p10 정도 되는 cell을 stock으로 만들었는데 이 stock을 다시 풀면 p10에서부터 카운트 해야 할까요? 아니면 p1에서 다시 시작하는건가요? 만약 p1부터 시작하는거라면 cell이 n2 tank에서 회복을 하는 것인지 궁금합니다 또한 passage 관리하는 방법도 알려주시면 감사드리겠습니다!

Brain을 FACS를 돌릴 수 있을까 생각하고있는데 문제는 살아있는 애를 금방 꺼내서 하려는게 아니고 Fixed brain을 갈아버린 후에 항체 붙여서 할 수 있나 여쭤봅니다. Single cell RNA-seq은 해보진 않았는데 찾아보니까 할려면 살아있는 애를 잡아서 장기 꺼내서 갈아버린 다음에 특정 Cell만 잡도록 CD4, CD8에 형광단백질 같은거 붙여서 FACS로 sorting해서 RNA뽑아서 맡기는 것 같던데 그럼 같은 원리로 그냥 Fixed brain 싹 갈아버린 다음에 조직염색 시키고 나서 FACS로도 볼 수 있는지 여쭤봅니다. 논문 찾아보면...잘 없는 듯 한데..해보신분이 계신가 궁금하네요. 교수님께서는 살아있는 세포를 갖고해야한다. 하시는데 이게 FACS를 한번도 안해봐서 프로토콜 찾아보면 결국 fixation하고 항체붙이는거 봐선...그 세포는 FACS돌리면 죽을텐데 그냥 Population만 보는 정도면 죽든 살든 상관없지않나요...?

안녕하세요 Nc/Nga mouse였고 아토피 유도된 쥐였는데 꽤 깊게 물려서 피가 철철 났습니다..ㅜㅜ 걱정되어서 찾아보니 대부분은 괜찮지만 conventional mouse에게 물리면 좋지 않다고 하는데 그 이유는 무엇일까요? 그렇다면 저는 어쩌면 좋을까요? 너무 걱정됩니다... 조언 좀 부탁드립니다 선생님들..ㅜㅜ 감사합니다

mouse whole brain을 '4% PFA -> 15% sucrose -> 30% sucrose' 후 OCT 하여 -80'c에 보관하였습니다.   이제 cryosection(24um)하여 슬라이드에 붙인 후 IHC-IF를 진행하려고 하는데.. 하여야 하는 IHC antibody 종류가 많다보니,  section 후에 slide 상태로 보관 후에 IHC를 진행하려고 합니다. 질문은 다음과 같습니다.   (1)아래와 같이 진행해도 괜찮을까요? 어떤 분은 slide에 올린 뒤 그냥 바로 -80'c에 넣어도 된다고 하시고,,, 조언부탁드립니다. 1) 자른 section을 slide에 올리기 2) PBS wash (5min X3) 3) Cold acetone (10min Fixation) -> 다 증발하면, deep freezer 보관     (2)보관 후 brain 붙은 slide 사용할때, 아래와 같이 사용하면 될까요..? #RT에 놔두고 온도 안정화 à PBS wash (5min X3) è PAP PEN è 4%PFA로 고정    (3)딥프리져에 slide 보관 후, 이후에 다시 사용할때  60도 dry oven에서 1시간 baking하고 사용하는 것이 좋다고 하는데.. 이것에 대한 의견도 궁금합니다.   바쁘신 시간 내어 글 읽어주셔서 감사합니다.

안녕하세요   WB을 통해서 특정 protein의 발현을 확인하려고 실험중인 대학원생입니다   시판중인 WB용 antibody를 이용해서 WB을 진행하니 결과가 제대로 나오지 않아서 antibody를 제작해서 진행해보려고 생각중입니다 (기존 논문들에서는 이 protein을 WB으로 발현확인하는 경우가 거의 없더라구요)   이와 관련해서 검색을 좀 해보니, 잘된다는 분들도 있고, 안된다고하시는 분들도 있어서, 진행 경험이 있으신 분들께 조언을 얻고자 질문드립니다     감사합니다!  

안녕하세요, 현재 IHC 컨디션을 잡고있는 대학원생입니다. 고수분들의 의견을 얻고자 질문글을 올립니다. DAB으로 staining을 하는데,  Background가 너무 심하게 잡히며 특히 처리 하자마자 색이 변할정도로 반응이 너무 빨리일어나기도 하고 Control에서 계속 염색이됩니다... 2차 항체를 1:1000으로 dilution하니 조금 덜하긴 해도 계속해서 염색이됩니다.   Peroxidase Quenching 10분, Pressure cooker 및 Trilogy로 deparaffinize, antigen retrieval 하였습니다. Control은 두가지가 있습니다. 그 Control 군에 1차 항체 단계에서 No antibody (PBS), Rabbit IgG 를 사용했고 10% Normal Goat serum blocking, 2차 항체 Goat anti-rabbit 사용하였습니다. DAB은 Vector laboratory에서 제시한 프로토콜 대로 사용하고 있습니다.   현재 생각해본 개선점으로는 1. Wash buffer로 PBS-0.1% Triton X-100 을 사용중입니다. TritonX-100을 Tween20으로 바꿔보려합니다. 2. DAB을 더 Dilution 해보는 것도 좋을 것 같습니다. 3. Wash 를 더 많이 해보려 합니다. 4. Antigen retrieval 시 Pressure cooker를 사용했는데, 이게 damage를 주었을 수 있을 것 같습니다. Microwave로 바꿔서 시도해보려 합니다.   위 네가지 외에 제가 더 해봐야할 부분이 있을까요? 감사합니다.

안녕하세요! immunofluorescence(IF) 실험을 셋팅중인 연구원입니다.   다름이 아니라 A라는 특정 물질을 처리한 후 세포에 잘 투과되었는지를  IF로 확인하려고 하고있는데요.   세포에 A 샘플을 처리하여 방치한 후 Fixation, permeabilization, blocking 과정을 거친 후 A primary antibody, primary에 해당하는 secondary antibody를  붙여서 진행했습니다.   실험과정에서는 크게 문제가 없어 보이는데 문제는 A 라는 샘플을 처리하지 않은 컨트롤에서도 A 단백질의 발현이 관찰되어 난황을 겪고있는 상황입니다.   컨트롤에서도 A단백질 발현이 관찰 되었다는 것은 A primary antibody가 세포에 붙었다고 생각이 되는데.. 그럼 세포 자체에서 A라는 단백질을 생산하거나 A primary antibody 결합부위와 맞는 유사한 단백질이 있다고 해석을 해야할까요?   A 물질 뿐만 아니라 다른 물질로 실험해도 계속 컨트롤에서 샘플 처리한 것과 비슷하게 발현이 관찰되어 고민 끝에 질문드립니다.   혹시 비슷한 경험을 해보신 분이 계시다면 도움 부탁드립니다.     1, 3번 Control / 2, 4번 Sample    

invitrogen 제품으로 IL-1b를 측정하였습니다. 계산을 해야하는데용 만약에 blank 값이 0.03 이고 결과 값이 0.13이면 (결과값 0.13 - blank값 0.03 ) / 표준곡선 에 있는 x축 값 x 스탠다드 최대 농도 라고 하는데 스탠다드 최대 농도 값을 왜 곱하는 건가요 ..? 키트마다 스탠다드 범위가 다른데 스탠다드 최대 농도 값을 곱하라고 하시더라고요 ..? 왜 곱하는지 모르겠어요 근데 안곱하면 수치가 엄청 작더라고요 0.001 이런식으로 .. 궁금합니다 ~ ㅠㅠ

ELISA 초보의 질문입니다... 환자에서 자가항체를 검출하기 위해 ELISA를 계획하고 있는데, 발견되지 얼마 안 된 항체라 그런지 제대로 된 kit가 없어서 antigen을 코팅해서 직접 develop할 계획입니다. 근데 중간중간 헷갈리는 스텝이 많아서 도움 요청합니다ㅜ 제가 있는 실험실은 ELISA를 거의 하지 않아서 잘들 모르시네요.  우선 Nunc Maxisorp ELISA plate에다가 1) 자가항체가 타깃하는 항원 (protein)을 coating하고, 2) Blocking 후 환자 혈청을 dilution해서 incubation, 3) Human IgG Fc에 대한 HRP-conjugated 2'를 붙이려 합니다.  이 과정에서 각종 buffer 조성이 고민입니다. 제가 참고하는 논문들은 제각기 다르고 언급이 없는 논문들도 많아서요... 1. Coating buffer: 그냥 PBS에다 해도 되는 것인지, 별도 buffer가 추천되는지요? 제가 찾은 reference들은 절반 이상은 PBS에다 한다고 하고, 0.1M carbonate buffer에 썼다는 논문도 있습니다.  2. Diluent buffer: serum을 dilution하는 용액도 마찬가지로 PBS에다 하는건지, 보편적으로 추천되는 희석 버퍼가 있는지요?  3. Blocking buffer: 논문들에 따라 5% nonfat milk in PBS 혹은 0.5% casein sodium in 0.05% PBS-Tween20을 얘기하는데 어떤 차이점이 있는건가요...? 감사합니다.      

제가 BL6 Mouse의 Spleen에서 splenocyte를 분리해서 실험을 하고 있습니다. 그런데 가끔 Splenocyte를 isolation한 후에 pelleting 하였을 때 한두마리씩 pellet 색이 이상하게 검은 개체들이 있었습니다. 이상하지만 계속 사용하였는데, 이후 실험에서 이러한 것들만 튀는 값을 가지는데 혹시 그 개체들에서 문제가 있는건지 궁금합니다. 분리방법은 RBC lysis, Ficoll 모두에서 이러한 현상이 나타납니다.

안녕하세요 Influenza a virus로 연구하고있는 대학원생입니다.  influenza a virus 로 plaque assay 진행중인데, 어느순간부터 staining하면 사진처럼 제대로 plaque 형성이 되지않고 모양만 남게되는데, 도저히 문제를 모르겠습니다. 혹시 저런현상 겪어보거나 해결방안 아시는분 도와주실 수 있을까해서 절박한 마음으로 올려봅니다.. 감사합니다.

brain IHC staining을 준비 중 입니다. 1차 antibody와 2차 antibody를 정하는데 궁금한 것이 있어서 질문 남김니다.   first antibody: Ki-67 Monoclonal Antibody ((Host/isotype: Rat/IgG2a kappa) secondary antibody: Goat Anti-Rat IgG Antibody 이렇게 구매하고자 계획 중인데.. first antibody의 isotype은 IgG2a이고, secondary antibody는 IgG여서요...   구매하여 사용하여도 가능할까요?  아니면 IgG2a로 구매하여서 사용해야 할까요?   추가적으로 IgG2a와 IgG2b도 큰 차이가 나나요?   미리 답변 감사합니다 :)

immunofluorescence에 필요한 cell antibody를 찾고 있는데, 랩실에서 사용한 장비를 가지고 실험한 antibody가 찾아도 나오질 않습니다,, cell에 특이적으로 붙는 antibody도 없는 것 같은데 이럴 땐 어떠한 방식으로 찾아보아야 하는지 조언 부탁드립니다 ,,

  Procollagen 생합성 키트 사용 중 no signal 문제로 질문드립니다. 키트에 동봉된 Standard 물질로 실험했을 땐 문제가 없었습니다. 잘 반응하고 그래프도 잘 그려졌습니다. 그런데 섬유아세포 상층액을 취해서 실험을 진행하면 반응을 하지 않습니다. 다른 논문에서 사용한 방법대로 했음에도 반응을 하지 않아서 프로토콜에 안내된 용량인 20ul보다 더 많이(30ul)로 샘플처리를 했음에도 반응이 없습니다. 혹시 이와 비슷한 문제를 겪으시고 해결하신 사례가 있다면 도움을 부탁드립니다.  

안녕하세요 compensation이 안되서 집에 못가고 있는 불쌍한 대학원생 입니다...ㅠㅠ spleen lysate로 unstain 및 각 형광별 single stain sample을 준비해서 compensation을 조절하고 있는데요 보시면 FITC single stain에서 PE signal이 대각선으로 증가하는 듯한 모습이 계속 나타나는데요 이 signal들은 compensation이나 voltage를 조절해도 계속 나타나더라구요 혹시 정체가 뭘까요?? 또 어떻게 없앨 수 있을까요?? 고수님들의 의견 부탁드립니다.. ㅜㅜ

안녕하세요. 이미지제이로 IHC 조직분석 시 두개의 signal 의 colocalization 된 정도를 확인하고 있습니다.    총 DAPI 수에서 두 시그널이 merge된 세포 수의 % 를 구하려고 합니다만, merge 된 signal 의 area 가 아닌 개수를 확인하는 방법을 모르겠습니다.   youtube, google 을 포함하여 다양한 매체로 확인해보았으나... 결국 글 남기게 됩니다. 읽어주셔서 감사합니다!

CD3 antibody로 activate 된 Tcell 은 non-specifically kill 할 수 있나요? 논문을 보니 그런 것 같네요.   CD3 agonist 로 activate 한 PBMC T cell이 cancer cell line non-specifically 하게 kill 했다고 하네요.    연구에 써 보신 분들 정말 그랬나요?   그냥 constitutively active 라서 가까이 있는 세포 죽이는 것인가 싶네요.  

마우스한테 Matrigel을 주입하고 7일 이후에 Matrigel을 회수해서  PBS 10ml이 들어있는 15ml tube로 회수 할건데요. 24시간동안 overnight를 진행하고 다음날 10,000rpm, 10분간 centrifuge를 돌려서 분리된 상층액에서 1ml을 따서 Drabkin's reagent solution 1ml과 1:1 비율로 혼합후 540nm 에서 흡광도를 측정하려고 하는데요. 이후에 측정된 수치값을 어떻게 계산 해야 하는지 궁금해서 질문 드립니다. 물론, 상층액 흡광도 측정전에 Hemoglobin standard curve를 그릴것이구요 그거에 나온 기울기 값도 확인 할거에요.

안티바디 저 뒤에,14C10이 무슨 의미인가요??? GAPDH (14C10) Recombinant (14C10)

뼈에서 칼슘 정량할 때 어떤 방법이 있을까요?