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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunofluorescence
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Q. 세포에 형광염색할때
안녕하세요. 세포실험은 초짜인 대학원생입니다. 저는 mammalian cell에 bacteria를 처리한 후 약물처리를 해서, bacteria가 줄어드는 양상을 현미경으로 관찰하는 실험을 하고 싶습니다만... 저희 연구실에서 아무도 해본 적이 없고 저도 처음이라서 막막하여 글을 남깁니다. 1. 항체는 꼭 2차까지 처리를 해야하나요? 만약 Mammalian cell의 세포질을 타겟하는 형광이 붙은 antibody와 bacteira를 타겟하고 형광이 붙은 antibody가 존재한다면 그 두 개를 동시에 처리하고 바로 형광 현미경을 보아도 될까요?? 2. 찾아보니 Mounting용액에 DAPI가 섞인 제품도 있던데 ... mounting?? 봉입체?? 를 꼭 해주어야하는건가요? 그리고 mounting 용액에 DAPI가 들어간 것은 DAPI가 핵을 염색시키면 그 후에 추가 wash과정 없이 현미경을 보는 건가요? ㅠㅠ 초보라 질문이 많고 기본적인것일수도 있지만 아시는 분은 상세한 답변 부탁드리겠습니다.
회원작성글 와디와디  |  08.03
Q. cytoflowmetry 분석 관련 질문입니다
안녕하세요, 늘 브릭을 통해 많은 도움을 받고 있습니다. 이번에 하고 있는 연구로 인해 외국 연구실에 교환학생을 오게 되었습니다. T cell 활성화 관련 실험을 진행하고 있는데요, cytoflowmetry 경험이 별로 없어서 첫주부터 진행이 막혔습니다ㅜㅜ 영어가 짧은 탓에 대혼란을 겪고 있습니다... 거두절미하고 질문을 드리자면, NFAT-GFP tag된 T cell을 live/dead cell stain 한 뒤 cytoflow 찍었습니다. 아래 데이터는 별도로 activation 시키지 않은 세포의 분석결과인데요.   보시면 GFP signal이 뜹니다. anti CD3/CD28 친 실험군이랑 별반 차이도 없어요. 바보같은 질문이지만 원래 항상 NFAT의 GFP가 뜨나요? 활성되었을 때만 뜨느 게 아닌가요?? 대체 뭐가 문제일까요...... 월요일에 교수님과 미팅인데 큰일났네요. 절박합니다...... 도움부탁드립니다 .... 감사합니다ㅜㅜ
회원작성글 9383  |  07.30
Q. image J positive cell counting하는 방법 첨부파일
immunohistochemistry 데이터 분석 중인데,  total DAPI로 염색 된 세포 중에서 특정항체에 특이적으로 발현 된 (ex) KI67+ 세포들 만 Counting 하고 싶은데,  gray scale로 바꿔서 하자니 RFP, GFP 구분 없이 DAPI+ 포함 모든 세포가 잡혀서 counting하기가 힘들고 bit 전환없이 일일히 세자니 그 수가 너무 많고 전체 세포 대비 %를 구하기 힘들 것 같아 고민입니다. 논문들 보면 형광면염염색 figure와 함께 %막대그래프로 수치화한 figure를 함께 보여주던데, 딱히 method를 보아도 counting 방법은 나와있지 않네요ㅠ  
회원작성글 12312  |  07.17
Q. [westernblot] 첨부한 detection 사진 결과 좀 봐주세요! (어떤 의견이라도 남겨주세요) 첨부파일
안녕하세요. Western blot 실험 결과 detection만 하면 결과가 이런데 혹 이유를 아시는 분들 계신가요?  일단 실험과정 간단히 요약하면 이렇습니다. 전기영동, transfer(100V, 1h), blocking(5% skim milk and 5% BSA 둘다 써봄, 1h), 1st antibody(Nrf-2, 1:1000, overnight), 2st antibody(HRP, 1:4000, 1h), detection(ECL reagent A:B=1:1) antibody 부착 후 washing(TBS-T 10mL, 15 min, 3번) Trouble shooting 시도 해보려고 washing도 15분씩 4번으로 변경하고, antibody 희석배수가 너무 높아서 그럴수도 있다고 하길래 1:2000정도로 늘려보았는데요.. 여전히 사진처럼 뿌옇게 나옵니다,, 추측하기로는 단백질양이 너무 적어서 signal 자체가 좀 약한것 같긴한데 어떻게 생각하시나요...? 일단 b-actin 자체는 계속 반복실험해도 잘 나타나서 transfer나 blocking 문제같지는 않거든요,, 어떤 의견이라도 남겨주시면 감사하겠습니다 :) 
회원작성글 experiment  |  06.15
Q. DAB staining 1차항체 안붙인샘플에서도 발색이 됩니다ㅠ 첨부파일
이전에도 질문했긴한데, 다른 문제로 질문을 또 올립니다ㅠ 1차항체로 ki67을 붙여 hair follicle 관찰이 주 목적이고, 왼쪽 사진은 negative control용으로 1차항체 대신 5%BSA를 붙여 o/n 후, 2차는 동일하게 (2시간30분 반응) 진행하였습니다. dab(vector)시약은 10분 처리하였습니다. 1. 오른쪽 1차붙인 사진 보면 갈색점점이 있는 걸 보아 염색이 안된 건 아닌것 같은데 negative에선 단지 비특이적으로 염색이 된 걸 까요? 혹시 그렇다면 이유가 뭘까요ㅠ 2. 한날한시에 같이 진행한 염색인데 왼쪽오른쪽 사진 발색이 너무 달라서 황당했습니다. 샘플수도 5개 밖에없었어서 염색하면서 delay는 거의 없다고 봐도 되거든요.. 왜그렇죠ㅠ 3. 디지털슬라이드스캐너(image scanner)로 촬영하는데 원래 현미경상으로 볼때 아주아주 연하게 뜨나요? h&e샘플 촬영때는 현미경 auto focus하면 자동인식 아주 잘됫는데 dab샘플들은 너무 연해서 잡히지가 않았습니다. 원래 이런가요..?
회원작성글 12312  |  04.26
Q. IF 항체와 관련 제품 고르는 것 도와주실분ㅠ 첨부파일
안녕하세요. 3T3-L1 지방세포로 연구 중인 대학원생입니다.    IF를 셋팅 중에 있습니다. 다른 연구실을 통해서 배우고 있는 중이라,  사소한 것 하나하나 물어보기가 쉽지 않네요..    저는 산타크루즈의 UCP1 (E-6): sc-518171 항체를 사용하려고 합니다.  그런데 UCP1 항체 (E-6) FITC (sc-518171 FITC) 라는 항체가 또 있더라고요.    저는 일차 항체를 붙이고, FITC가 붙은 이차 항체를 사용할 예정인데,  혹시 일차 항체도 FITC가 붙은 것으로 사야만 하나요?    그리고, 일차항체는 UCP1 항체 (E-6)를 사용하고 이차항체는 아래 두 제품 중 하나를 사용할 예정입니다.  - Goat Anti-Mouse IgG Antibody, (H+L) FITC Conjugated (Sigma, AP124F) - Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC (A16079, Invitrogen)   또한 MitoTracker 제품도 두 제품 중에 하나를 선택할 예정입니다.  - MitoTracker® Red CMXRos (CST, 9082S) - MitoTracker® Red CMXRos (Invitrogen, M7512)   마지막으로 DAPI DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (Thermofisher, D1306)   제가 일련의 제품들을 잘 선택한게 맞을까요..?   추가적으로 현재 학교에서 사용중인 컨포칼용 현미경 셋팅 사진을 첨부합니다. 
회원작성글 살려주세요1234  |  04.13
Q. pbmc facs population 어떤 부분인지 알려주세요
PBMC를 가지고 FACS 를 찍고 lymphocyte를 게이팅 해야되는데  일반적인  PBMC facs population과 달라서 어떤게 lymphocyte 의문입니다.  일반적인 pbmc  population  제가 찍은 PMBC population 1번과 2번중에 어떤게 lymphocyte 인가요? 혹시 1번은  debris인가요?? 아님 1번과 2번을 다 같이 잡아야 할까요? 왜 population이 저렇게 나오는 걸까요? FACS 고수님들 알려주세요 ㅠㅠ  
회원작성글 힛  |  03.29
Q. Flow cytometry; Fixation/Permeabilization 시, Live cell이 너무 많이 감소합니다,,
안녕하세요. 약 1년 간, flow cytometry 조건을 잡고 있는 대학원생입니다.. 주변에 조언을 구할 곳이 없어, 계속 구글링하다가 질문 드리게 되었습니다.   저는 마우스에서 primary cell을 분리한 후, flow cytometry로 분석하고 있습니다. 세포를 분리한 후에는 총 두 개의 그룹으로 나눠 staining을 진행합니다. 1. 2개의 surface staining. 2. 1개의 surface staining -> Fixation/Permeabilization -> 1개의 intracellular (nucelar) staining. Staining을 하기 전까지의 모든 과정은 동일하게 진행합니다. Fixation/permeabilization 단계에서는 'eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set' 제품을 사용하여 4℃에서 O/N 한 후, 다음날 intarcellular staining을 진행합니다.   제가 질문 드리고 싶은 부분은 surface staining만 한 후, 7aaD를 이용하여 live cell을 gating하면 약 90 ~ 95% 정도가 live cell인 반면, fix/perm 과정을 거친 후, live cell을 gating하면 50~70%만이 live cell이라는 점입니다. (Fix/perm하는 sample의 경우 live/dead Ab를 이용하여 staining합니다.) 이렇게 까지 live cell이 감소하는건 제 실험방법에 문제가 있는 것 같아서요.. 다양한 조언을 부탁드리고 싶습니다..   또한 Fix/perm을 하면 cell debris가 많아진다고 들었는데 약 1X10^6개의 cell을 염색할 경우, flow cytometry에서 모든 샘플을 다 읽혀봐도 total events 수가 1X10^6개에 가깝게 나타나는데, stainging 과정에서 저도 모르게 loss를 많이 내고 있는 것일까요..   읽어주셔서 감사합니다:)
회원작성글 타타  |  03.27
Q. IHC 문의드립니다
안녕하세요 IHC 문의 드릴점이 있어서 글을 씁니다. 제가 double staining을 하려고 합니다. primary antibody들은 mouse, goat 입니다. secondary antobody들을 goat anti-mouse 와 donkey anti-goat를 사용하였습니다. 염색을 확인해봤을때는 염색이 잘 되었는데 2차 항체를 이렇게 사용하면 문제가 되는걸까요? 꼭 알려주세요ㅠㅠ
회원작성글 퐁퐁퐁듀  |  03.23
Q. in vivo CFDA-SE staining...
CFDA-SE를 staining하여 in vivo로 실험 중인데 FACS로 high가 잘 보이지 않네요 ㅠㅠ 현재 저희는 RF2.5 + CFSE 20uM media로 37도 조건(CO2 incubator)에서 5분간격으로 tapping하며 15min간 staining 후 PBS로 washing 진행합니다. 혹시 CFSE가 staining이 잘 되도록 효율을 높일 수 있는 방법이 있을까요..?? 선배님들의 도움 기다리겠습니다 ㅠㅠ
회원작성글 mmm_aa_  |  03.14
Q. beta cell function볼 때 glucagon염색 이유
안녕하세요 석사 연구원인데 궁금한게 있어 질문드립니다. beta cell function을 알아볼때 ihc로 insulin을 염색해 beta cell을 quantification시키는걸로 아는데 논문들을 보니까 대부분 glucagon으로 alpha cell도 함께 염색하시더라고요. beta cell funtion을 볼 때는 insulin염색만 하면 되는게 아닌가요? glucagon 염색의 이유를 찾아보려고 해도 논문에는 쓰여있지 않고 단지 morphology를 확인하기 위해서인건지 아니면 beta cell을 염색했으니 alpha cell도 염색해야되는건지 궁금합니다.  
회원작성글 본도르  |  03.14
Q. resin enbedding
안녕하세요 대학원을 준비하면서 논문을 읽어보고 있는 대학생입니다.   현미경에 관심이 많아 관련 논문을 읽고 있는데,   세포를 가지고 현미경을 찍을 때 샘플 준비 과정인 것 같은데   resin enbedding이라는 단어가 꽤 많이 등장하더라고요   논문에도 나와있지만 정확히 어떤 과정인지 이해가 잘 가지 않아서 질문 드립니다.   고수님들 부탁드립니다..물어볼 곳이 여기밖에 없네요..
회원작성글 dkaneh  |  03.10
Q. Mouse lung 을 이용한 IHC Sirius red staining 후 glass에 mount 시 색이 빠지고 번집니다.
안녕하세요 Mouse lung의 collagen 변화를 보기 위해  이 제품을 이용해 Picro Sirius Red Stain Kit (Connective Tissue Stain (ab150681) IHC를 진행하고 있습니다.   Picro sirius red staining protocol summary: - deparaffinize sections if necessary and hydrate in distilled water - cover sections in picro-sirius red solution and incubate for 60 min - wash slide with acetic acid solution - wash slide with absolute alcohol - dehydrate, clear and mount slide 제품의 protocol 대로 진행하고 있는데, slide에 mount 시 색이 빠져서 조직이랑 염색된 액이 glass 사이로 빠져나옵니다. 염색을 덜 빼서 그런것인지 아니면 다른 문제가 있는건지 잘 모르겠습니다. 혹시 사용해보신분 있으시면 경험좀 공유해주실 수 있을까요? 아니면 mount medium을 Fluromount-G (Invitrogen)을 써서 그런걸까요?
회원작성글 쥐포구이  |  02.25
Q. IF할 때 각각antibody 에서 각각의 역할
안녕하세요 이번에 세포를 처음 키워보는 공대생 입니다..   논문을 읽다가 면역형광법이 나왔는데(IF) 각 antibody 들이 각각 어디에 붙는지 어떻게 작용을 하는지 궁금합니다...   mouse anti-b-III-tubulin (Covance MMS-435P, 1:50), rabbitanti-glial fibrillary acidic protein (GFAP, DAKO Z0334,1:200), rabbit anti-laminin (BTI BT594, 1:100), mouse antinestin(Millipore MAB353, 1:200), mouse anti-CD11b(Millipore CBL1512, 1:25), mouse anti-O1 (MilliporeMAB344, 1:50), Cy3 goat anti-mouse ( Jackson 115-165-068,1:500), Alexa488 goat anti-rabbit ( Jackson 115-545-146,1:500).   생물쪽은 거의 무지해서..ㅠㅠ 고수님들 부탁드립니다...ㅠㅠ
회원작성글 gudrhkd  |  02.24
Q. 안녕하세요 FACS를 찍는데 cell down이 안되서 문제입니다 도와주세요
안녕하세요 cell profiling을 위해 FACS를 찍고 있습니다.   제가 하는 방식은 cell을 fixation한뒤 1st antibody처리 후 2nd antibody- FITC를 처리하고있습니다. 여기서 5000g로 3분 centrifuge 하는데 1st ab까지는 cell down이 잘 되어 pellet이 되는게 보이는데 2nd를 처리하면 pellet이 안생기네요.. 10000g이상으로 돌리면 cell이 데미지를 받아 실험에 영향이가서 7000g 까지는 해봤는데 cell down이 안됩니다. fixation한지 6개월이상된 cell에서 보통 이런 현상이 일어나고 1개월 미만 cell에서는 이런현상이 일어나지 않습니다.   혹자는 2nd ab의 FITC의 charge가 영향을 줘서 cell에 붙은 형광끼리 같은 charge라 안붙는거일수도 있다고 하는데 이유가 무엇인지, 해결방법좀 알려주세요 ㅠㅠ  그리고 fixation한 cell을 저는 얼린뒤 녹여서 사용하는데 몇번정도 얼렸다 녹였다 할수있는건지도 아시는분 같이 부탁드리겠습니다ㅠㅠ 
회원작성글 엄선우  |  02.15
Q. sodium citrate dihydrate로 antigen retrival buffer를 만들고자합니다.
sodium citrate dihydrate로 antigen retrival buffer를 만드는과정에서 D.W와 sodium citrate dihydrate를 넣고 pH를 맞추는데 HCl로 맞추다가 너무 낮아졌을 경우 NaOH로 맞췄을 때 NaCl이 생길텐데 이는 antigen retrival buffer 역할을 하는데 영향을 줄까요..? 보통 다른 buffer pH를 맞출 때 HCl로 맞추다가 pH가 너무 낮아졌을 때 NaOH를 사용하나요 아니면 새로 만들어서 사용하시나요?
회원작성글 실험어린이1  |  02.14
Q. immunofluorescence에서 U0126 , RAPAMYCIN
immunofluorescence 실험중에서 treatment과정에서  U0126 , RAPAMYCIN 억제제를 사용하였습니다.  U0126 , RAPAMYCIN이 억제제 역할을 하는 것은 알고 있는데 어떤 역할을 하나요?
회원작성글 oneday  |  02.08
Q. FACS에서 CD25 staining 관련해 여쭤봅니다.
FACS 실험을 진행중에 있습니다. CD25(clone PC 61.5) 를 스테이닝해야하는데, 이 친구가 포르말린 fixation 이후에는 staining 이 잘되지 않는거 같습니다ㅠ  fresh 한 상태에서는 잘되는듯합니다만, fixation 했다가 나중에 다시 염색해서 재분석하고 싶을 때는 안되더라구요ㅠㅠ 혹시 이 부분 해결하신 분들이 계신가요?ㅠㅠ
회원작성글 아이고야  |  01.19
Q. FACS MFI 값 계산에 대해 궁금한 점이 있습니다.
FACS  분석을 한창 하고 있는 대학원생입니다. 히스토그램으로 표현된 그래프에서 MFI 값을 구해야하는데, BD FACS calibur 를 이용해 통계치를 내보면 Mean, geometric mean, median 값이 나옵니다. MFI 값은 여기서 Mean 값을 의미하는걸까요..? 그리고 구하는 공식이나 다른 수식이 있나요? 구글링을 해봐도 딱 MFI 가 어떤 값이다! 하고 보여주는 글은 못찾겠어서(median 이다 mean 이다 왔다갔다하더라구요ㅠ) 확실하게 알고넘어가려고 질문글을 올려봅니다.  
회원작성글 아이고야  |  01.18
Q. MitoTracker working solution
안녕하십니까...이런 실험이 처음이라 한번 여쭤봅니다. 난자에 mitochondria 분포도 검사를 위해 MitoTracker  green 키트를 사용하려고 합니다.  MitoTracker stock solution을 만들기 위해 DMSO를 넣어 1mM의 농도로 희석 (vial당 50ug이 들어 있으므로 DMSO 약 74.4ul 첨가하면 1mM. MW:671.88) 하였습니다.  그런데 working solution 1nM은 어떻게 만들어야 하는지 모르겠습니다.. 실제 실험에 사용되는 working solution은 200nM입니다.  구하는 공식쫌 가르쳐 주십시요....ㅜㅜ 감사합니다. 
회원작성글 조ps  |  01.14
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