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BioLab 신동혁 교수
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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunofluorescence
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질문/투표/프로토콜 등록
Q. IF double staining 관련 질문
두가지 primary 항체를 써서 각각 다른색으로 labeling하려고 하는데요, 만약에 다른 1차항체 두개가 같은 단백질에 결합할 수 있으면 두 색으로 모두 염색되는게 아니라 결합자리를 경쟁하게 되어서 하나의 색으로만 염색이 되는건가요?  예를들어,   1차항체 #1 (초록색): A단백질, B단백질   1차항체 #2 (빨간색): B단백질, C단백질 위와 같이 반응시키면, B단백질은 초록색/ 빨간색으로 둘 다 염색이 되는게 아니라 둘 중 하나의 색으로만 염색되는건가요...?
회원작성글 snkd  |  11.29
Q. IHC .. Dehydrate 질문드립니다.
안녕하세요    최근들어 조직염색을 하고 있는 대학원생입니다.   조직을 염색하는데 프로토콜마다 좀 다른것같아서요..     파라핀 조직이고 deparaffin 하는건 알겠는데 (자일렌-알콜 고->저)   Dehydrate 할때 알콜 저->고농도 하고 자일렌하고 끝내는 것도 있고 (ex>H&E) 그냥 absolute alcohol 으로 끝내는 것도 있는데..(ex>sirius red) 이게 무슨 차이가 있는건지 궁금합니다.   DAB염색시 자일렌을 해주는게 좋은가요?(이것도 프로토콜마다 달라서..)     그저 키트마다 다른건지.. 마지막에 자일렌을 무조건 해주는게 좋은건지 궁금합니다.   그리고 absolute alcohol으로 끝냈을때 마운팅은 지용성으로 해야하는지 수용성으로 해야하는지도 궁금해요...         감사합니다!
회원작성글 찌랭이  |  11.28
Q. 현미경 으로 동물조직을찍을때
현미경에서 동물조직을 찍을때, DAPI와 594 red signal을 확인을 해야하는데요. 컨트롤(약물을 처리하지 않은 샘플)을 우선 찍으려고 아이스피스로 봤을때 잘보이는데, 현미경컴퓨터상에서는 흐리게 보여 레이저 파워를 조절한다면, 그 다음 대조군(약물처리한 샘플)에서는 DAPI 레이저 조절를 하면 안되는건가요? 차이를 비교하려면 어떻게 조건을 잡아야하는지 궁금합니다. ㅠㅠ 초보라 많이 어렵네요
회원작성글 초코파티  |  11.25
Q. IF permeabilization 생략?
IF에서 membrane protein & intracellular protein을 둘다 labeling하는 항체를 사용하려고 하는데요. 너무 강하게(?) permeabilization하면 membraine protein이 망가질 우려가 있지 않을까 싶어서 검색하다가  antibody dilution을 PBS-Trition으로 하니까 permeabilization 과정을 생략하는 사람도 있는 것 같아서요. 혹시 이렇게 해보신 분 계신가요?  아니면 membrane protein & intracellular protein 동시에 labeling하신 분 어떻게 진행하셨는지 여쭤보고 싶습니다. 
회원작성글 enedd  |  11.22
Q. 면역형광염색 IF 1차, 2차항체 확인 부탁드립니다 + 관련질문
3종류의 다른 단백질의 발현을 확인하고 싶어서 triple로 IF를 진행하려고 합니다.  처음 해보는거라 불안한데 물어볼 선배가 없어서요ㅠㅠ 도움 부탁드려요.   <primary antibody> 1. Mouse 유래 2. Rabbit 유래 3. Gout 유래   <secondary antibody> 1. Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 2. Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 3. Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647   + 추가적으로 질문드립니다. 위와 같이 염색진행 후, 동일한 sample에서의 ER이나 mitochondria와 같은 subcellular 구조를 염색해서 단백질 위치를 확인하려고 합니다.  연구실 항체리스트를 보니까 subcellular marker의 primary antibody가 전부 rabbit 유래인데, 위의 2번째 단백질 primary antibody를 rabbit 유래를 썼는데 또 다음 염색에서 동일한 host꺼를 사용해도 되는지 궁금해서요ㅜㅜ 사용해도 된다면, secondary antibody 선택 시 alexa 488, 594, 647을 제외한 색의 anti-rabbit 항체를 선택하면 되나요?
회원작성글 세포실험초보입니당  |  11.18
Q. alkaline phosphatase 조직 염색!? 첨부파일
hair dermal papilla 부분 stemness 확인 위해 마우스 피부 조직 cryomold sample을 ALP 염색해 볼 예정입니다. 1. EC나 골세포 ICC외에, 조직 염색 방법은 찾아봤을 때 많이 없어서 과정을 여쭙 싶습니다. 밑의 과정이 맞는지 확인해주시면 감사하겠습니다. PBS wash --> NBT/BCIP sol. add 15min in dark (파랑색 띄면 멈춤) --> PBS wash --> mounting 2. ALP 염색 자체는 조직이 본래 가지고 있는 효소를 염색하는 것이라, 따로 항체(ex)anti-ALP antibody)를 붙여줄 필요 없나요? NBT/BCIP sol.이 발색제 용도인건 알겠으나, 다른 여러 프로토콜들에 only substrate를 첨가한다고 하지 따로 1차 항체를 붙여준 다는 내용이 없어 궁금합니다. 3. SIGMAFAST™ BCIP®/NBT(B5655)를 사용해 염색해 볼 예정인데 첨부해놓은 데이터시트지에서 보시다시피, 과정 자체가 블롯용이라 IHC에 참고하기는 어려워보이는데 1.기입해놓은 과정으로 진행하면 될까요..   도움주시면 정말 감사하겠습니다..!
회원작성글 12312  |  10.17
Q. mouse 조직면역염색 4color 관련
안녕하세요.  저는 mouse 조직으로 면역염색을 하려는 대학원생입니다. 다름이 아니라 antibody 구입하려고하는데 dapi 포함 4color 염색 조합을 찾는게 매우 어렵네요... A,B,C,DAPI 염색을 한다고했을때 A- 2차 goat anti-rabbit 488 B- 2차 goat anti-rat 594 C- 2차 goat anti-mouse 647 ->>>>>>> 여기가 문제..   로 단순하게 생각했는데 mouse 조직이다 보니 2차 host가 mouse 인 antibody가 없더라구요.... 이런경우는 어떻게해야 4 color를 염색할 수 있을까요?   ㅠㅠㅠ    노하우 공유부탁드립니다.
회원작성글 신경생물  |  10.05
Q. CMV culture urine검체 양성 첨부파일
안녕하세요 전에 검사들 토대로 culture 배양시켜서 눈에 익히려구 공부를 하고있는데 urine 검체로 배양시켜본 검체가 양성인지 여쭙고 싶습니다 다른 양성 검체들과는 세포가 배양된 모양이나 양상이 다르게 나와서 너무 헷갈리네요ㅠㅠ 다른 검체들은 셀 크기도 확실히 더 크고 모양도 돼지코 모양으로 딱 이쁘게 나오는데 혹시 왜 다른 검체와 양상이 다른지도 아시는분이 계시다면 가르쳐 주셨으면 합니다 저배율로 보다가 찌꺼기인지 구분이 어려워 고배율로 최대 확대했는데 양성인걸까요?
회원작성글 pink1048  |  09.30
Q. IHC 조직 두께 관련
안녕하세요!   MOUSE brain 을 30~40um 두께로 cryosection 하여 형광 염색을 할 예정입니다.  free floating 기법으로 염색을 할 예정이며 confocal로 사진 찍을 예정인데, 30~40um 두께로 잘라도 confocal에서 초점이 잘 잡히고 사진이 잘 찍히는지 궁금합니다. 
회원작성글 졸려요  |  09.22
Q. DC Maturation 후 FACS
안녕하세요  현재 BMDC maturation 실험 준비중인 학부연구생입니다. cell을 키운 후에 LPS 처리하여 FACS를 찍어보려고 하는데 compensation 이 무엇인지 잘 모르겠습니다.  positive와 negative를 걸어서 일종의 기준점?을 만드는 것 같은데 맞나요? plate design 시에 comp.well은 어떻게 design 해야하는건가요?실험군 수대로 맞추는건가요 아니면 처리하는 형광 수대로 design하는건가요? 참고로 형광은 PE와 PE-cy7을 사용합니다 아직 학부생이라 많이 부족합니다. 열심히 찾아보고 공부하는데도 잘 모르겠어서 질문올려요 도와주세요ㅠ
회원작성글 호구마  |  09.08
Q. 세포에 형광염색할때
안녕하세요. 세포실험은 초짜인 대학원생입니다. 저는 mammalian cell에 bacteria를 처리한 후 약물처리를 해서, bacteria가 줄어드는 양상을 현미경으로 관찰하는 실험을 하고 싶습니다만... 저희 연구실에서 아무도 해본 적이 없고 저도 처음이라서 막막하여 글을 남깁니다. 1. 항체는 꼭 2차까지 처리를 해야하나요? 만약 Mammalian cell의 세포질을 타겟하는 형광이 붙은 antibody와 bacteira를 타겟하고 형광이 붙은 antibody가 존재한다면 그 두 개를 동시에 처리하고 바로 형광 현미경을 보아도 될까요?? 2. 찾아보니 Mounting용액에 DAPI가 섞인 제품도 있던데 ... mounting?? 봉입체?? 를 꼭 해주어야하는건가요? 그리고 mounting 용액에 DAPI가 들어간 것은 DAPI가 핵을 염색시키면 그 후에 추가 wash과정 없이 현미경을 보는 건가요? ㅠㅠ 초보라 질문이 많고 기본적인것일수도 있지만 아시는 분은 상세한 답변 부탁드리겠습니다.
회원작성글 와디와디  |  08.03
Q. cytoflowmetry 분석 관련 질문입니다
안녕하세요, 늘 브릭을 통해 많은 도움을 받고 있습니다. 이번에 하고 있는 연구로 인해 외국 연구실에 교환학생을 오게 되었습니다. T cell 활성화 관련 실험을 진행하고 있는데요, cytoflowmetry 경험이 별로 없어서 첫주부터 진행이 막혔습니다ㅜㅜ 영어가 짧은 탓에 대혼란을 겪고 있습니다... 거두절미하고 질문을 드리자면, NFAT-GFP tag된 T cell을 live/dead cell stain 한 뒤 cytoflow 찍었습니다. 아래 데이터는 별도로 activation 시키지 않은 세포의 분석결과인데요.   보시면 GFP signal이 뜹니다. anti CD3/CD28 친 실험군이랑 별반 차이도 없어요. 바보같은 질문이지만 원래 항상 NFAT의 GFP가 뜨나요? 활성되었을 때만 뜨느 게 아닌가요?? 대체 뭐가 문제일까요...... 월요일에 교수님과 미팅인데 큰일났네요. 절박합니다...... 도움부탁드립니다 .... 감사합니다ㅜㅜ
회원작성글 9383  |  07.30
Q. image J positive cell counting하는 방법 첨부파일
immunohistochemistry 데이터 분석 중인데,  total DAPI로 염색 된 세포 중에서 특정항체에 특이적으로 발현 된 (ex) KI67+ 세포들 만 Counting 하고 싶은데,  gray scale로 바꿔서 하자니 RFP, GFP 구분 없이 DAPI+ 포함 모든 세포가 잡혀서 counting하기가 힘들고 bit 전환없이 일일히 세자니 그 수가 너무 많고 전체 세포 대비 %를 구하기 힘들 것 같아 고민입니다. 논문들 보면 형광면염염색 figure와 함께 %막대그래프로 수치화한 figure를 함께 보여주던데, 딱히 method를 보아도 counting 방법은 나와있지 않네요ㅠ  
회원작성글 12312  |  07.17
Q. [westernblot] 첨부한 detection 사진 결과 좀 봐주세요! (어떤 의견이라도 남겨주세요) 첨부파일
안녕하세요. Western blot 실험 결과 detection만 하면 결과가 이런데 혹 이유를 아시는 분들 계신가요?  일단 실험과정 간단히 요약하면 이렇습니다. 전기영동, transfer(100V, 1h), blocking(5% skim milk and 5% BSA 둘다 써봄, 1h), 1st antibody(Nrf-2, 1:1000, overnight), 2st antibody(HRP, 1:4000, 1h), detection(ECL reagent A:B=1:1) antibody 부착 후 washing(TBS-T 10mL, 15 min, 3번) Trouble shooting 시도 해보려고 washing도 15분씩 4번으로 변경하고, antibody 희석배수가 너무 높아서 그럴수도 있다고 하길래 1:2000정도로 늘려보았는데요.. 여전히 사진처럼 뿌옇게 나옵니다,, 추측하기로는 단백질양이 너무 적어서 signal 자체가 좀 약한것 같긴한데 어떻게 생각하시나요...? 일단 b-actin 자체는 계속 반복실험해도 잘 나타나서 transfer나 blocking 문제같지는 않거든요,, 어떤 의견이라도 남겨주시면 감사하겠습니다 :) 
회원작성글 experiment  |  06.15
Q. DAB staining 1차항체 안붙인샘플에서도 발색이 됩니다ㅠ 첨부파일
이전에도 질문했긴한데, 다른 문제로 질문을 또 올립니다ㅠ 1차항체로 ki67을 붙여 hair follicle 관찰이 주 목적이고, 왼쪽 사진은 negative control용으로 1차항체 대신 5%BSA를 붙여 o/n 후, 2차는 동일하게 (2시간30분 반응) 진행하였습니다. dab(vector)시약은 10분 처리하였습니다. 1. 오른쪽 1차붙인 사진 보면 갈색점점이 있는 걸 보아 염색이 안된 건 아닌것 같은데 negative에선 단지 비특이적으로 염색이 된 걸 까요? 혹시 그렇다면 이유가 뭘까요ㅠ 2. 한날한시에 같이 진행한 염색인데 왼쪽오른쪽 사진 발색이 너무 달라서 황당했습니다. 샘플수도 5개 밖에없었어서 염색하면서 delay는 거의 없다고 봐도 되거든요.. 왜그렇죠ㅠ 3. 디지털슬라이드스캐너(image scanner)로 촬영하는데 원래 현미경상으로 볼때 아주아주 연하게 뜨나요? h&e샘플 촬영때는 현미경 auto focus하면 자동인식 아주 잘됫는데 dab샘플들은 너무 연해서 잡히지가 않았습니다. 원래 이런가요..?
회원작성글 12312  |  04.26
Q. IF 항체와 관련 제품 고르는 것 도와주실분ㅠ 첨부파일
안녕하세요. 3T3-L1 지방세포로 연구 중인 대학원생입니다.    IF를 셋팅 중에 있습니다. 다른 연구실을 통해서 배우고 있는 중이라,  사소한 것 하나하나 물어보기가 쉽지 않네요..    저는 산타크루즈의 UCP1 (E-6): sc-518171 항체를 사용하려고 합니다.  그런데 UCP1 항체 (E-6) FITC (sc-518171 FITC) 라는 항체가 또 있더라고요.    저는 일차 항체를 붙이고, FITC가 붙은 이차 항체를 사용할 예정인데,  혹시 일차 항체도 FITC가 붙은 것으로 사야만 하나요?    그리고, 일차항체는 UCP1 항체 (E-6)를 사용하고 이차항체는 아래 두 제품 중 하나를 사용할 예정입니다.  - Goat Anti-Mouse IgG Antibody, (H+L) FITC Conjugated (Sigma, AP124F) - Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC (A16079, Invitrogen)   또한 MitoTracker 제품도 두 제품 중에 하나를 선택할 예정입니다.  - MitoTracker® Red CMXRos (CST, 9082S) - MitoTracker® Red CMXRos (Invitrogen, M7512)   마지막으로 DAPI DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (Thermofisher, D1306)   제가 일련의 제품들을 잘 선택한게 맞을까요..?   추가적으로 현재 학교에서 사용중인 컨포칼용 현미경 셋팅 사진을 첨부합니다. 
회원작성글 살려주세요1234  |  04.13
Q. pbmc facs population 어떤 부분인지 알려주세요
PBMC를 가지고 FACS 를 찍고 lymphocyte를 게이팅 해야되는데  일반적인  PBMC facs population과 달라서 어떤게 lymphocyte 의문입니다.  일반적인 pbmc  population  제가 찍은 PMBC population 1번과 2번중에 어떤게 lymphocyte 인가요? 혹시 1번은  debris인가요?? 아님 1번과 2번을 다 같이 잡아야 할까요? 왜 population이 저렇게 나오는 걸까요? FACS 고수님들 알려주세요 ㅠㅠ  
회원작성글 힛  |  03.29
Q. Flow cytometry; Fixation/Permeabilization 시, Live cell이 너무 많이 감소합니다,,
안녕하세요. 약 1년 간, flow cytometry 조건을 잡고 있는 대학원생입니다.. 주변에 조언을 구할 곳이 없어, 계속 구글링하다가 질문 드리게 되었습니다.   저는 마우스에서 primary cell을 분리한 후, flow cytometry로 분석하고 있습니다. 세포를 분리한 후에는 총 두 개의 그룹으로 나눠 staining을 진행합니다. 1. 2개의 surface staining. 2. 1개의 surface staining -> Fixation/Permeabilization -> 1개의 intracellular (nucelar) staining. Staining을 하기 전까지의 모든 과정은 동일하게 진행합니다. Fixation/permeabilization 단계에서는 'eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set' 제품을 사용하여 4℃에서 O/N 한 후, 다음날 intarcellular staining을 진행합니다.   제가 질문 드리고 싶은 부분은 surface staining만 한 후, 7aaD를 이용하여 live cell을 gating하면 약 90 ~ 95% 정도가 live cell인 반면, fix/perm 과정을 거친 후, live cell을 gating하면 50~70%만이 live cell이라는 점입니다. (Fix/perm하는 sample의 경우 live/dead Ab를 이용하여 staining합니다.) 이렇게 까지 live cell이 감소하는건 제 실험방법에 문제가 있는 것 같아서요.. 다양한 조언을 부탁드리고 싶습니다..   또한 Fix/perm을 하면 cell debris가 많아진다고 들었는데 약 1X10^6개의 cell을 염색할 경우, flow cytometry에서 모든 샘플을 다 읽혀봐도 total events 수가 1X10^6개에 가깝게 나타나는데, stainging 과정에서 저도 모르게 loss를 많이 내고 있는 것일까요..   읽어주셔서 감사합니다:)
회원작성글 타타  |  03.27
Q. IHC 문의드립니다
안녕하세요 IHC 문의 드릴점이 있어서 글을 씁니다. 제가 double staining을 하려고 합니다. primary antibody들은 mouse, goat 입니다. secondary antobody들을 goat anti-mouse 와 donkey anti-goat를 사용하였습니다. 염색을 확인해봤을때는 염색이 잘 되었는데 2차 항체를 이렇게 사용하면 문제가 되는걸까요? 꼭 알려주세요ㅠㅠ
회원작성글 퐁퐁퐁듀  |  03.23
Q. in vivo CFDA-SE staining...
CFDA-SE를 staining하여 in vivo로 실험 중인데 FACS로 high가 잘 보이지 않네요 ㅠㅠ 현재 저희는 RF2.5 + CFSE 20uM media로 37도 조건(CO2 incubator)에서 5분간격으로 tapping하며 15min간 staining 후 PBS로 washing 진행합니다. 혹시 CFSE가 staining이 잘 되도록 효율을 높일 수 있는 방법이 있을까요..?? 선배님들의 도움 기다리겠습니다 ㅠㅠ
회원작성글 mmm_aa_  |  03.14
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