안녕하세요 이번에 jurkat이랑 mouse primary CD4+ T cell에서 ChIP을 하고자 ChIP 실험 조건 세팅하고 있습니다. 저희 방이 ChIP을 많이 하지 않아서 경험 많으신 분들의 조언을 구하고 싶습니다. 우선 제가 현재 사용하는 protocol은 upstate에서 나온 protocol을 토대로 진행하고있습니다. T cell이 suspension cell이기 때문에 formaldehye를 처리하기 전에 cell을 걷어서 centri로 다운시키고 media에 풀어서 counting한 뒤 실험을 진행했습니다. -Add formaldehyde(final conc. 1%) to cells in media, incubate 10min, RT -Add glycine(final conc. 0.125M), incubate 5min, RT -Centrifuge at 4℃ -Wash with cold PBS, centrifuge, discard supernatant (repeat 2 times) - Lysis with 1ml SDS lysis buffer (1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris,pH7.5) per 2 x10^7 cells -Aliquot lysates 300ul per IP tube --> sonication(bioruptor) -Centrifuge sonicated sample -Transfer 10ul from supernatant, mix with loading dye, boil for 3 min, check the fragments by gel electrophoresis(2% agarose gel) 우선 sonication 조건부터 잡으려고 위의 step까지 진행해서 여러가지 sonication 조건으로 test해보고 있는데, 전기영동을 해보면 결과가 다음같습니다. 위 사진은 10sec ON/30sec OFF 를 30cycle(왼쪽lane), 40cyle(오른쪽 lane)로 sonication해본 결과입니다. 저는 대략 500bp 전후의 fragment를 원한는데 왼쪽 lane에서 보면 200bp size쯤에서 band가 확인되고 오른쪽 lane은 거의 band가 보이지 않습니다. 또 양쪽 lane에서 모두 1~3kb에서 smaer하게 보이는 band가 있는데 sonication이 덜된것처럼 보이지만 sonication 조건을 다르게 test해도(30sec ON/ 30sec OFF를 10cycle, 20cycle 해보는 등) 저것과 거의 똑같은 결과가 나옵니다. 1kb 넘는 smear한 band를 최대한 없애려면 sonication cycle을 더 늘려봐야 할까요? 아니면 crosslinking이 너무 과도하게 됐거나 lysis가 제대로 되지 않은 문제일까요? 어떤 부분에서 문제가 되는 것인지 감이 잡히지 않아 고민이 많습니다. ㅠㅠ 또 추가적으로 궁금한 점이 있는데 혹시 formaldehyde처리하기 직전 media에 있는 cell의 농도 또한 중요할까요? counting한 뒤 formaldehyde를 media volume에 맞춰서 넣어줬는데 이때 cell concentration에 대한 부분은 고려하지 못해서 혹시 이것이 큰 문제가 될까 싶습니다.

학부생인데 궁금증이 생겨서 질문 드립니다 왜 면역침강후에 western blot을 하는지 이유가 궁금합니다  구글링을 해도 그냥 ip후에 동정을 위해 western blot을 사용한다고 하는데 구체적인 이유가 궁금합니다   

안녕하세요 IP 실험을 training 중인 학생입니다. Training 중이라서 간단하게 Syk protein에 대해 IP를 진행하고 IB로 p-Tyr과 Syk를 detection하려고 하는데요... p-Tyr과 Syk조차도 detection이 안되고 있어요... 다른 과정에서 문제가 있을 수도 있겠지만 IB를 진행하면서 1st Ab 사용시 WB만을 진행할 때와는 다른 주의해야할 사항이 있을까요...?

안녕하세요, 이제 갓 대학원을 시작하는 햇병아리 입니다, 실험을 진행하는 도중 궁금한 점이 있어 여쭤보려합니다 NK실험시에는 MC-1이 결여된 YAC-1 cell을 사용하여 NK와 감수성이 좋다는 이유로 coculture하여 사용한다고 알고 있습니다, 그치만 세포독성평가(CTL)을 할 때는 YAC-1 cell이 아닌 실험실에서 보유중인 colon 26-m3.1(셀라인화한 암세포)을 사용중인데 무슨 이유에서 암세포와 coculture하는지 궁금합니다 아시는분 구원의 손길 부탁드릴게요!

안녕하세요, 공부한지 벌써 1년이 된 석사 2차 입니다!!   지금 co-IP 실험을 한지 꽤 되었지만 제대로 된 결과를 본 적이 없어 buffer에 대해 의구심이 들었습니다.   제가 현재 사용하는 IP buffer의 조성은 50mM Tris HCl pH7.4 15mM Nacl 1mM EDTA 0.1% triton x-100 입니다.   IP를 할 때는 cytoplasm fraction kit를 통해 뽑은 세포질 protien을 사용했습니다. 그러나 브릭에 검색해보니 'fraction으로 뽑은 단백질은 salt를 맞춰야한다', 'SDS는 들어가면 안된다' 등 있었습니다. 그래서 lysis buffer와 IP buffer에 대해 궁금점이 생겼습니다.   1. 제가 사용하는 IP buffer의 조성은 괜찮은가요? 2. 검색해보니 "lysis buffer=IP buffer"로 둘의 의미가 같은것 같은데 protein 뽑을 때 쓰는 RIPA buffer로 IP를 하시나요?? 혹은 IP buffer로 lysis를 하시나요?? 3. 만약 위의 대답이 모두 yes라면 제 IP buffer로 protein을 뽑아도 되나요??     지난 1년동안 선배님들 답변 덕분에 많은 것을 배웠습니다. 항상 감사합니다! 조금 늦었지만 새해 복 많이 받으세요:)!!

serum을 가지고 IP 시도해보려고 하는데요, serum내 IgG가 많이 존재하고 있어서 IP자체가 잘 안될 수도 있을 것 같습니다. preclearing 방법으로 bead만을 먼저 반응하여 IgG 제거가 가능할까요?

안녕하세요. NLRP3 인플라마좀 관련 연구를 수행중인 박사과정학생입니다. Co-IP 실험 setup중에 있는데... 몇개월째 해결이 안되고있어 전문가분들의 도조언을 구하고자 이렇게 질문을 올려봅니다...   일단.. NLRP3 인플라마좀이 활성되면 NLRP3 단백질이 ASC 단백질과 달라붙고 oligomerization이 되고... 최종적으로 IL-1 cytokine이 절단되어 세포외부로 방출되게되는데... NLRP3 인플라마좀을 활성시키고 NLRP3를 IP로 땡기면 ASC 단백질이 반드시 달라붙어져서 나오게됩니다. Coll R.C et al., Nat. Med. 2015   그런데 지금 5번정도 반복을 해보고있는데 계속해서... NLRP3는 땡겨지는데...ASC 단백질이 검출이되지 않고있네요...    NLRP3 활성은... BMDM세포에 LPS (100 ng/ml) 6시간 priming 한 이후에 ATP를 각각 1mM, 5mM 30분 처리하여 활성시켜 주었구요, 1. Cold PBS wash 이후 cold PBS 넣고 ice 위에서 cell scraper로 살살 cell을 긁어낸후 4'C 2000g로 10분 down 시킨후 상층액 제거하고 아래의 IP lysis buffer (protease inhibitor와 혹시몰라 phosphatase inhibitor도 첨가해줌) 넣고 조심스럽게 피펫팅 해서 펠렛을 잘 녹여주었습니다. 그리고 ice에서 1시간정도 incubation 하였습니다. Thermo Scientific™ Pierce IP Lysis Buffer is optimized for cell lysate yield, purity and compatibility with immunoprecipitation. The IP Lysis Buffer is a mammalian whole cell lysis reagent based on a modified RIPA buffer formulation without SDS 2. 4'C에서 2000g 10분 down 후에 상층액만 회수하여서 브래드포드를 통해 단백질정량 한 후 10% input 샘플 만들어주고, 전날 overnight 해놓은 ProteinG agarose bead + anti-NLRP3 Ab 시료(IP lysis buffer로 wash 충분히 해주었습니다)에다가 샘플들을 넣어주고 다시 overnight 해주었습니다. 작업 온도는 모두 4'C 조건은 맞춰주었구요. 3. 다음날 IP lysis buffer로 wash 충분히 해주고 나서 bead는 sample buffer를 넣고 10분간 끓여주었구요 spindown 충분히 해준다음에 bead가 안딸려오게 상층액만 조심히 따서 western blot 진행하였습니다.   그런데.. 계속해서 첨부의 이미지처럼 NLRP3는 정상적으로 땅겨져 오는데 ASC 단백질은 detection이 안되네요... 혹시 NLRP3 인플라마좀 활성이 잘 안된거아닌가 싶어서 실험할때마다 상층액에 release되어있는 IL-1 cytokine 측정해보는데... 인플라마좀 활성은 빵빵하게 잘 된 것이 맞습니다.  즉 한마디로 요약하자면...Co-IP 실험을 하는데...primary로 땡기는 단백질은 최종샘플에서 충분히 검출이되는데.. 같이 딸려나와야하는 target 단백질은 검출이 되지 않습니다....  (input에서 untreat에 비해 인플라마좀 활성군에서 NLRP3양이 증가된것은 LPS처리에 의해 나타나는 올바른 현상입니다) (anti-NLRP3 Ab는 source가 Rabbit, anti-ASC Ab도 Rabbit이나, ASC size가 IgG size와 겹쳐보이지는 않아서 그냥 사용하고있습니다) 단백질 샘플링할때 protein-protein interaction이 끊어져버리거나... 뭔가 buffer조성에 의해서 protein-protein interaction이 끊어져버리는거 아닌가 싶은데... buffer는 상용화된 IP용 제품을 쓰는데...왜 이런현상이 일어나는지 모르겠습니다..    두번했는데도 안나오길래, anti-NLRP3 Ab 농도도 높여보고... Wash 용 IP lysis buffer에도 protease inhibitor phosphatase inhibitor 다넣어줘도보고.... 뭘 바꿔봐야할지 감이 도저히 안잡혀서 이렇게 질문을 올려봅니다.   ***아 그리고..75-100kDa 사이에서 잡히는 밴드는 무엇인지도 궁금합니다... 실험이 잘되면 ASC 단백질이 딱 저위치에있는 양상으로 검출되는게 맞는데... 저기는 그냥 비특이이겠죠? 아니면... cleaved 되지않은 total IgG 일까요?..    

위 결과값에서 input은 positive control 인 것까지는 이해를 했는데  상단의 IP:AKT의 경우 면역침전을 진행하고 이후에 pull down assay를 통해 단백질의 유물를 확인한다는 것인지 궁금합니다. ㅠ  아래의 밴드를 보면 IP:AKT를 한 용액을 가지고 또다시 IP와 WB를 진행했을 경우의 밴드가 나온것인가요?

단백질의 양은 동일한데 IP했을때 밴드가 더 진하게 나오는 이유가 궁금합니다.

Ab agarose 대신 protein A/G agarose를 대체하여 사용하는 이유가 무엇인가요?

안녕하세요 생명과학과 학부생입니다 다름이 아니라 jak-stat signaling에서 western blot 결과 해석에 어려움을 겪고 있습니다 Western blot에서 band가 가로.세로의 친화력을 뜻하는 것인가요?

안녕하세요 면역학 전공중인 2년차 대학원생입니다.   immunoprecipitation 실험에서 어려움을 겪고 잇습니다ㅠㅠ bcl 2와 특정 protein의 interaction을 확인하기 위해 immunoprecipitation을 진행하였습니다. lipofectaine 2000 사용하여 transfection (24hr) 한 후, protein overexpression 시켰는데 pre-IP (lysate)에서 bcl 2가 같이 들어간 경우, 다른 protein의 expressino이 급격하게 감소하는 것을 확인하였습니다.   논문 여러개를 참고해서 조건 여러개를 바꿔서 진행해 보기도 했는데요 1) transfection incubation time 24 hr -> 48 hr 2) cell lysis buffer NP40과 RIPA 둘 다 진행 3) bcl 2에는 flag, protein 에는 myc 이 tagging 되어 있어서 immunoprecipitation 을 flag 과 myc 둘 다로 진행   이렇게 했는데도 사진에서 보이는 것과 동일하게 bcl 2 와 함께 들어갔을 경우 protein 의 급격한 감소가 나타났습니다.. bcl 2 가 apoptosis 와 관련된 protein 이라서 같이 들어간 protein 의 감소가 나타나는 건지ㅠ.. bcl 2와 interaction 한다고 잘 알려진 beclin1 도 같이 transfection 시키면 protein이 감소해서 interaction 이 잡히질 않습니다. protein 감소만 잡히면 될것 같은데 어디서 잘못 됐는지 감이 오지 않습니다...ㅠㅠ 도와주세요  

co-IP 실험을 처음하는 학생입니다. 혹시 Heavy chain과 light chain이 의미하는게 뭔가요?

안녕하세요 co-IP실험을 처음하는 대학원생입니다 제가IP sample까진 모두얻었는데 input으로사용되는 단백질은 어떤 sample로 사용을 해야하나요? IP하는도중 정제하는 단계의 sample응 사용해야하는지 아니면 처음에 단백질을 얻은 sample응 사용해야하는지 모르겠어요ㅠㅠ

안녕하세요. IP 실험을 처음하는 대학원생입니다. 실험디자인에서 antibody를 아예 넣지 않는 군은 어떠한 역할을 하는지 궁금해서 질문남깁니다.  

IP를 통해 얻은 protein샘플을 샘플버퍼를 넣어 100도씨에서 끓였습니다. 보관은 -20도에 해야되는게 맞나요?

immunoprecipitation 과정 중에 1차 antibody를 넣는데 antibody 회사에서 제시하는 농도가 1:50 이던데 그럼 cell lysate양에 대비하여 1:50이라는 뜻이 맞을까요? 

안녕하세요? immunoprecipitation을 하기 위해 방법을 정리하고 있는 대학원생 입니다 제가 IP할 단백질은 적은 양으로도 WB에서 발현이 잘 되는 단백질입니다 이럴 경우에는 IP실험 시 preclearing과정에서 whole cell lysate 200 ug + normal IgG 1 ug + ProteinA/G 20 uL를 사용하려고 하는데 괜찮을까요? normal IgG는 CST의 #2729를 사용할 예정입니다 Protein A/G는 산타크루즈의 SC-2003  

co-IP를 하기 위해 실험방법과 원리를 공부하고 있는 대학원생 입니다. 아래 그림은 다른 논문의 IP실험 결과를 가져온 것인데요 IP:YY1 옆의 IgG와 따로 밴드를 IgG의 차이점은 무엇인지 알고 싶습니다. 그림 상으로 보기에는 각각 negative control과 positive control로 보이는데요 그럼 모든 IP실험에서는 IgG를 control로 제시하여야 되나요?

IP의 IgG 선택하려는데요.. 제가 알아본 제품은 CST #2729의 Normal rabbit IgG입니다. 이 제품 사용해보신 분 평가나.. 다른 제품 추천해주실 분 ^^ 미리 감사합니다.