invitrogen 제품으로 IL-1b를 측정하였습니다. 계산을 해야하는데용 만약에 blank 값이 0.03 이고 결과 값이 0.13이면 (결과값 0.13 - blank값 0.03 ) / 표준곡선 에 있는 x축 값 x 스탠다드 최대 농도 라고 하는데 스탠다드 최대 농도 값을 왜 곱하는 건가요 ..? 키트마다 스탠다드 범위가 다른데 스탠다드 최대 농도 값을 곱하라고 하시더라고요 ..? 왜 곱하는지 모르겠어요 근데 안곱하면 수치가 엄청 작더라고요 0.001 이런식으로 .. 궁금합니다 ~ ㅠㅠ

ELISA 초보의 질문입니다... 환자에서 자가항체를 검출하기 위해 ELISA를 계획하고 있는데, 발견되지 얼마 안 된 항체라 그런지 제대로 된 kit가 없어서 antigen을 코팅해서 직접 develop할 계획입니다. 근데 중간중간 헷갈리는 스텝이 많아서 도움 요청합니다ㅜ 제가 있는 실험실은 ELISA를 거의 하지 않아서 잘들 모르시네요.  우선 Nunc Maxisorp ELISA plate에다가 1) 자가항체가 타깃하는 항원 (protein)을 coating하고, 2) Blocking 후 환자 혈청을 dilution해서 incubation, 3) Human IgG Fc에 대한 HRP-conjugated 2'를 붙이려 합니다.  이 과정에서 각종 buffer 조성이 고민입니다. 제가 참고하는 논문들은 제각기 다르고 언급이 없는 논문들도 많아서요... 1. Coating buffer: 그냥 PBS에다 해도 되는 것인지, 별도 buffer가 추천되는지요? 제가 찾은 reference들은 절반 이상은 PBS에다 한다고 하고, 0.1M carbonate buffer에 썼다는 논문도 있습니다.  2. Diluent buffer: serum을 dilution하는 용액도 마찬가지로 PBS에다 하는건지, 보편적으로 추천되는 희석 버퍼가 있는지요?  3. Blocking buffer: 논문들에 따라 5% nonfat milk in PBS 혹은 0.5% casein sodium in 0.05% PBS-Tween20을 얘기하는데 어떤 차이점이 있는건가요...? 감사합니다.      

  Procollagen 생합성 키트 사용 중 no signal 문제로 질문드립니다. 키트에 동봉된 Standard 물질로 실험했을 땐 문제가 없었습니다. 잘 반응하고 그래프도 잘 그려졌습니다. 그런데 섬유아세포 상층액을 취해서 실험을 진행하면 반응을 하지 않습니다. 다른 논문에서 사용한 방법대로 했음에도 반응을 하지 않아서 프로토콜에 안내된 용량인 20ul보다 더 많이(30ul)로 샘플처리를 했음에도 반응이 없습니다. 혹시 이와 비슷한 문제를 겪으시고 해결하신 사례가 있다면 도움을 부탁드립니다.  

ATCC 에서 AR42J cell을 구매하여 사용하고 있습니다. ATCC에서 받은 설명서 따라서 F12K media에 20%FBS로 배양하여 passage5~7정도 왔습니다.   가볍게 cerulein+LPS를 treat하여 농도를 잡아보려고 논문들 참고하여 실험해서 ELISA로 측정해 봤는데, 결과가 전부 <0pg 으로 나오고있습니다 ㅠㅠ   지금까지 해 본 setting은  모두 24well에서 진행했습니다.   Final농도/ LPS: Non-treat, 100ng/ml 고정 Final농도/ cerulein: Non-treat, 100nM, 1uM    cell number: 1E+5(50,000cells/cm2), 5E+5(250,000cells/cm2)   Time: 8hour, 24hour    심지어 cell을 24well에 seeding하면서 LPS,cerulein 을 treat, 24well에 seeding 후 24hour 뒤 LPS,cerulein media change 조건에서도 해보고,   다른 논문들 보니까 DMEM으로도 키우는것 같아서 DMEM으로도 media바꿔보고 어차피 24hour~48hour만 배양할거 24well seeding시 FBS도 빼보고 다 해봤습니다만,   논문에 의하면 최소 60~100pg/ml은 나와야할 것 같은데 5pg/ml이하(사실상 안나온거라고 할 수 있죠... )로 나오네요...   사소한거라도 좋으니... 해본 적 있거나 수정해야할 부분 보이시면  선배님들 도와주시면 감사하겠습니다.  

안녕하세요 Elisa 셋팅 중 질문 드립니다. 현재 제가 사용하는 시스템에서 A 단백질 코팅 -> B단백질-biotin 반응-> streptavidin-hrp순으로 반응을 진행하고 있습니다. 이때 블랭크로 1: A코팅, streptavidin 반응/ 2: B-biotin+streptavidin 어떤게 적절하다고 생각하시나요? 2번을 계속해서 블랭크로 사용하였는데 블랭크 발색이 너무 심해 질문드립니다. 답변해주신다면 정말 감사하겠습니다.

2차 항체 (HRP conjurated goat anti-rabbit IgG)는 염소에서 얻었다고 하는데, 이 항체가 토끼 혈청의 모든 IgG와 결합하는 이유가 뭐죠..? ㅜㅜ 아시는 분 좀 설명해주세요 

고등학생입니다 흡광도 측정할 때 450nm 의 빛을 사용하는 이유가 뭔가요? 

Sandwich ELISA 실험중인데 전문적 지식이없어서인지 이론이 이해안가는부분이 있습니다   positive control과 negative control이 왜 필요한지..역할이 어떻게 쓰이는지 정확히 이해가 안갑니다...   그냥 실험 후 샘플 OD측정해서 샘플의 OD값이 정해둔 cut-off값 이상인지 이하인지만 확인하면 되는거 아닌가싶은데..   positive control과 negative control이 왜 필요한지를 모르겠습니다 ㅠ  

Sandwich ELISA 실험중입니다   같은 농도와 양의 항원,항체인데..   왜 PLATE마다 표준물질의 OD값이 다를까요?   표준물질은 동일한거고 PLATE도 동일한 방법으로 제작한건데요   예를들면   PLATE 1,2,3  = 3개가있다고 하면   PLATE1은 표준물질의 농도가 1,3,5,7,9 PLATE2는 표준물질의 농도가 2,4,6,8,10 PLATE3은 표준물질의 농도가 5,7,9,11,13   이렇게 나옵니다   plate 1,2,3 모두 1,3,5,7,9이던...5,7,9,11,13 이던.... 좀 비슷하거나 동일하게 나오는게 아니고 다르게나오네요   OD값은 다 다르지만  실질적으로 표준물질 농도에따라 커지는 비율은 2씩 커지는거라 비율적으론 문제가안되는데요..   표준물질,항원,항체 모두 다 똑같은건데 PLATE별로 OD값이 다르게 나오는 이유가 궁금합니다...    

코팅된 셀용 플레이트만 가능한건지...

ELISA 실험중인데   표준물질의 OD값이 커진다는게 어떤 의미가 있을까요?     

현재 Anti-HIV 검사에 사용되는 kit는 antigen-sandwich assay를 이용하고 있고 Anti-HCV 검사에는 indirect assay를 이용하고 있습니다. 둘 다 HIV 항체, HIC 항체를 검출해냄으로써 감염력이 있는 지 확인하는 것인데 이처럼 항원을 검출하는 게 아니라, 항체를 검출하는 데에 장점이 있을까요? 의견 부탁드립니다.

ELISA 키트를 구매해서 실험을 진행했는데 흡광을 찍으면 거의 대부분의 웰에서 측정범위보다 높게 찍힙니다. 육안으로 봐도 연노란색이 아니고 갈색으로 보입니다. 샘플의 농도문제라고 하기엔 키트에 들어있던 스탠다드도 측정범위를 벗어납니다. 워싱이 제대로 안됐나해서 두번째 실험에서는 워싱도 신경써서 진행했습니다.(30초간 플레이트를 바닥에 대고 흔들며 5회 반복해줬습니다.) 혹시 ELISA하면서 이렇게 나올만한 다른 원인이 있을까요..

안녕하세요. 저는 현재 CIA mouse로 RA 유도하여 약물의 항염증성을 확인하는 동물 실험을 진행중입니다. 저희 실험실에서 류머티스 관절염을 다루는게 처음이라 선배분들이나 교수님께 질문하는 것에 한계가 있어 조언을 구하고자 글을 올립니다. 지금은 CIA model 유도 과정에 있으며 2nd immunization 후 약물 treat 후, 약 2주간 tracking할 예정입니다.  이후 sacrifice하여 serum 및 조직 내의 pro-inflammatory cytokine level을 ELISA로 확인하려고 하는데, mouse joint의 어느 부분을 section하여 조직을 분리해야할지 도통 감을 잡을 수가 없더라고요. H&E나 safranin과 같은 staining을 할 경우에는 femur 및 tibia site를 모두 section하여 고정하는 것으로 알고 있는데, cytokine level을 볼 때는 어떤 식으로 실험들을 진행하시는건지 궁금합니다.  혹은 IHC로도 cytokine을 staining하여 확인하는 경우도 있는 것 같던데, tissue의 경우에는 ELISA보다는 IHC가 더 유리한 것인지, 아니면 tissue 내 cytokine 양이 detect하기에는 너무 적어서 그런 것인지 궁금합니다. 긴 글 읽어주셔서 감사합니다.

안녕하세요 저는 운동 전,후의 NK cell의 IFN-gamma를 측정하는 실험을   했는데 Kit은 NKmax의 NK vue kit을 사용했습니다.   궁금한 것이  36명을 대상으로 측정했고 standard range가 0~2000pg인데 대상자의 절반이 이상이 2000pg가 넘게 나오더라구요 standard에는 문제가 없어 보이고 saturation 된 것 같다고 하는데 saturation 된 데이터는 사용 할 수 없는 건가요? 재실험을 할 수 없는 상황이라 데이터를 사용 할 수 있는 방법은 없는걸까요?  

안녕하세요! ELISA 질문드립니다!!ㅠㅠ 도와주세요 제가 R&D사의 human eotaxin ELISA kit를 사용하여 실험을 진행하였는데요! 아에 모든 sample의 흡광도 수치가 blank만큼 바닥을 찍어서요,,,, 프로토콜에는 Assay diluent RD1W를 100ul를 넣고 sample과 STD를 50ul 넣으라고 되어있어서 그대로 진행을 했습니다! 혹시 RD1W없이 SAMPLE만 150ul 넣은 후 실험을 진행해도 괜찮을지 질문드립니다ㅠㅠㅠㅠ