안녕하세요 유산균의 CEP 관련 탐구를 진행하고자 하는 학생입니다.  여러 선행 논문을 찾아보는 중 제목에서 처럼  Free - Calcuim buffer에 배양함으로써~라는 문구가 나오는데 이 Free - Calcuim buffer가 뭔지 모르겠습니다...! 단순히 칼슘이 없는 버퍼인건지 아니면 특별한 조성이 있는건지 의문이 생겨 글 남깁니다. 감사합니다!

cell을 harvest 하고 western을 진행하기 위해 protein extraction을 기계로 결과값을 내는데요. protein 농도가 마이너스가 나오는 경우는 왜 그런건가요ㅜㅜ?   lysis buffer는 늘 같은 걸로 이용을 해왔는데 언제는 값이 잘 나오다가 언제는 마이너스 나오고 참 들쑥날쑥 한데 이 원인이 왜 인지 혹시 저같은 경험 해보신 분 계신가요 ㅜㅜㅜ? cell lysis가 충분히 되지 않은 것 같은 경우도 생각해서 충분히 lysis 한 후 4도씨에서 rotation 하고 15000rpm, 15min centri 진행 하고 protein assay 용액 500ul에 protein 2ul 넣고 96 well에 200ul씩 2번 분주 하는데요    마이너스 값이 나오는데 왜 그러는 건가요ㅜㅜㅜ

안녕하세요. western blot을 하는 석사생입니다. gel을 만들어서 사용하고 있는데 running gel과 stacking gel 사이에서 버블이 만들어집니다.  comb를 뽑으면서 젤 사이가 벌어지곤 하는데 왜이런 현상이 나타나는건지 알 수 있을까요? 두 젤은 충분히 굳고나서 사용하며, running젤 먼저 분주 후 isopropanol로 수평을 맞추고 난 뒤에 gel이 굳으면 isopropanol을 제거합니다. 그 뒤에 증류수로 한번 더 wash하구요,,   비슷한 경험 있으신분이 계시다면 조언 부탁드립니다.

안녕하세요 WB 고수님들께 의견을 묻고자 남깁니다. 최근 gel을 내리는 과정에서 가운데 있는 Marker가  보이는 것 (1번) 처럼 쓸려(? 이 표현이 맞는지...) 내려가는 듯하게 눈으로 보이고 그렇다 보니 transfer 해도 그대로 옮겨지고  실제 detection 을 해보면 2번 그림처럼 되더라구요. 왜 그러는지 혹시 아시는 고수님님 알려주세요. 그렇게다 모든 가운데 marker가 다 그런거 또 아니더라구요. 같은날 내린 gel 에서 다른 gel은 그렇게 안 되기도 해서... 1. 2. 

westen blot 실험 진행중인데 항체를떼어내려고 stripping 버퍼에 워시를 진행했는데 스트리핑 처리를 길게 했더니 마커와 단백질이 날아가서 사라져서요ㅠㅠㅠ 스트리핑버퍼가 조성이 너무쎈 경우 이런현상이 나타나기도 하나요?

Western Bolt 실험 하는데 1차 항체랑 2차 항체 희석해야하는데, 1차 항체는 베타액틴으로 1:1000 2차 항체는 1:5000 으로 희석하라는데 몇으로 넣고 희석해야하는지 계산법 과 같이 알려주세용 ... 몇대 몇으로 희석하라는 방법만 봐도 머리가 너무 복잡해요  ㅠ ㅠ

염기서열을 아미노산 서열로 변환하는건 아는데 반대는 어떻게 해야하는지 몰라서요ㅜ 혹시 아는분들 답변 부탁드립니다!

웨스턴할때 1차 안티를 저희 실험실은 4도에서 16시간을 인큐베이션합니다. 만약 20시간을 인큐베이션을 하게 되면 어떻게되나요? 결과에 많은 영향을 주게되나요? 

HPLC 관련 실험을 진행하고 있는 연구원 입니다. 관련 공부를 할려고 논문을 보다보니 식물 추출물 관련해서 두가지 다른 물질이 같은 retention time 을 가지고 다른 wavelength를 가집니다. 논문에서는 retention time과 wavelength를 기반으로 분류하였다고 되어 있는데 같은 부서의 연구원 분이 이 부분이 이상하다고 합니다. wavelength의 차이는 피크의 크기 차이만 생길 뿐이지 wavelength차이로는 다른 물질의 구분이 안되고 다른 물질의 구분은 retention time 만으로 한다고 합니다.  그리고 연구원 분의 말씀이 맞다면 retention time이 같은데 어떻게 다른 물질로 판단하는 기준이 뭔지 궁금합니다.  앞선 실험을 하셨던 여러 선배님들의 조언을 구합니다. 

어떤 protein의 E3 ligase가 밝혀져 있지 않았을 때 이를 찾아내기 위해 어떤 step을 거쳐서 밝혀낼 수 있을까요?

선배님께서 웨스턴을 두번 돌리기 싫을때 먼저 phospho-p70 antibody를 붙이고 결과를 본뒤 phospho-p70 antibody 붙인 membrane에 milk로 blocking하고 total-erk1/2 antibody를 붙이면 된다고 하시는데 아무래도 detection을 위해서 sustrate를 분주하다보니 washing을 잘해야될거 같은데 저희는 보통 washing할때 10분씩 3반복을 해주는데 이렇게만 해도 sustrate가 완전히 washing이 될까요? 1시간은 해주어야되나요?  

웨스턴을 하였는데  1. a+b처리 2. a라는 처리 3. b라는 처리 4. none 순서대로 하였습니다. phospho-s6 antibody를 붙였는데 none은 당연히 처리가 안되있어서 연해야하는데 제일 진하게 나왔습니다. 제 기억으로는 위에 언급한 순서대로 하였는데 1번과 4번이 바뀐걸까요? 결과만 보면 4번이 none인데.... 처음에 protein 뽑을때 제가 tube를 바꿔 담은건지 ㅜㅜ  현재 다시 protein을 뽑는게 가장 베스트이지만 시간도 없고 treatment가 부족해서 다시할 여건이 되지 않습니다. 저의 실수이지만 도와주세요.ㅜㅜ

웨스턴 결과를 오늘 찍었는데 결과 사진이 밴드가 아예 안 나오고 그냥 검은색으로만 나오는데 이건 뭐 때문에 그런건가요ㅜㅜ    제가 2차를 붙이고 워싱을 원래 10분 3회 하는데 이번엔 까먹고 워싱을 shaker위에 두시간 가량 냅두고 책상 위에 한시간 가량 냅둔 후에 사진을 찍었는데요! 혹시 워싱이 잘 안되면 밴드가 아예 안 보이기도 하나요? 아니면 그 전 과정들이 문제 인가요ㅜㅜ?    진짜 말 그대로 그냥 까매요 아무것도 안 보여요ㅜㅜ gapdh도, target protein도 ,,, 한 membrane에서 잘라서 두개로 나눠서 보는데 안 나와서 당황스러워요.. 웨스턴 하고 transfer 할 땐 마커가 다 넘어가서 transfer까진 문제가 없는 거 같은데ㅜㅜ

제목 그대로, p-AKT와 AKT를 디텍션하려고 하는데, 둘 다 60 kDa에서 뜨는 안티바디라서요. 첨엔 두 gel을 만들어서 각각 찍고 정량을 해봤는데 같은 샘플이어도 gel마다 크리티컬하진 않아도 좀 차이가 있길래 혹 같은 gel에서 찍어야 할까요? 하나 먼저 찍고 washing 후 같은 membrane으로 다음 안티바디 붙여서 찍는걸 추천하시나여? 아님 그냥 각각 다른 gel에서 찍고 정량해도 큰 문제 없을까요? (+)덧붙여, 각각 다른 gel에서 찍었을경우 p-AKT, AKT를 각각의 gel에서 뜬 b-actin으로 정량한 후 그 값을 p-AKT/AKT로 계산하나요, 아니면 p-AKT, AKT 각각의 밴드만 image J로 정량한 후 그 값을 바로 p-AKT/AKT ratio 값으로 계산하시나요?

제목 그대로 membrane에 뜬 beta actin band를 image J 같은걸로 정량해서 다시 western blot용 protein sample 제조 할때 protein 갚을 늘리는 방법이 있을까요? rat brain을 일부 잘라서 protein을 추출하여 standard curve로 protein 정량 했었는데 beta actin band의 크기가 일정하지 않더라구요. 교수님께서 샘플의 크기가 일정하게 똑같지 않아서 이런 결과가 나온거 같다며 beta actin band로 정량해서 protein 용량을 늘려보라는데 제가 이렇게 해본적이 없어서 문의 합니다... 방법 아시는 분 답변 부탁드려요!!

안녕하세요, 스펀지 형태의 콜라겐을 버퍼나 물에 분산시켜 콜로이드 용액을 제조하고싶습니다. 그런데 계속 용해되고 나서 굳어버리네요,, 콜라겐이 녹지 않고 고르게 분산만 시킬 수 있는 방법이 없을까요?