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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein
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Q. Streptavidin (conjugate용) 국내 제조업체 문의
안녕하세요.  현재 streptavidin conjugate 실험을 하고 있습니다. streptavidin 1g 이상 한번에 구매를 하고 싶은데요. 혹시 국내 제조업체가 있을까요? 문의 드립니다. 
회원작성글 전사  |  02.06
Q. protein purification 중 binding 문제
안녕하세요, protein purification 실험 진행하는데 막히는 부분이 있어 여기에 여쭤봅니다.  단백질 실험은 처음 해보는지라 모르는 점이 많음을 양해 부탁드립니다.    target 하는 단백질 size 는 대략적으로 28kDa(his tag size 포함) 이고, Ni-NTA resin 을 이용하는 Affinity chromatography 를 통해 정제하려고 하였습니다. 사용한 Tag은 His-tag이며, N-term과 C-term 양쪽에 모두 6x His를 가지고 있습니다 (N-term이 stable 하다는 얘기를 듣긴 했지만, 양쪽에 his tag를 가지고 있으면 binding 이 더 잘될 것이라는 생각이 들어 N/C -term 모두에 his-tag를 달았습니다.) 실험 방법은 다음과 같습니다.  1. 25ml 의 cell culture를 centrifuge하여 pellet 을 수득한 후, lysis buffer 5ml 로 resuspension 한 다음 세포파쇄 (via sonicator: 50%, 5'' on/ 5'' off)하였습니다. sonication 이후 centrifuge 하여 supernatant를 lysate로 사용하였습니다. (soluble fraction)  2. 사용할 column (10ml의 컬럼)을 1CV 만큼 equilibration 해주었습니다.  3. Ni-NTA agarose resin 을 column에 1ml 충진 후, binding buffer 3CV flow through.  4. Sample 을 column에 load 한 후, 4℃ 에서 rotation 준 상태로 O/N 5. 이후, Sample을 flow through 하였습니다. (이 때 binding 을 좀더 시키기 위하여 flow through한 sample을 약 3회 정도 re-load하여 최종 Sample flow through 를 확보하였습니다.  6. (+10mM imH)로 3CV 만큼 washing  7. 1CV의 50mM~500mM imH로 각각 elution  8. SDS-PAGE 로 gel 확인 (Gel 사진은 하기 그림과 같습니다/ 하기 문제점에 기재하였듯, Elution 된 양이 적어 50mM 이상 elution 하였던 lane은 그림에서 뺐습니다.)  문제점과 질문사항은 다음과 같습니다.  Issue 1. Sonication 시, 많은 양의 cell 이 깨지지 않음이 확인됩니다. 우선적으로 사용한 sonication의 조건은 general 하게 사용하는 condition 으로 수행하였습니다. 질문) sonication 시 cell 이 잘 안깨지는 이유가 무엇인지 여쭤보고자 합니다. (많은 양의 cell 이 깨지지 않았더라도, 현재 gel 상 Soluble faction 에서는 충분한 target protein이 확보되었기 때문에, 큰 문제는 되지 않겠지만.. 그래도 일반적인 lysate와는 turbidity 가 많이 차이나서 여쭤봅니다.) Issue 2. Soluble fraction 과 Sample flow through 에서 target 단백질의 size 가 거의 비슷합니다. -> Ni-NTA Binding의 문제라고 생각됩니다. binding 효율을 늘리고자 4도에서 rotation 주며 o/n 하였으나 실질적으로 target 단백질이 이 과정에서 많이 손실되는 것으로 보입니다. 따라서, elution 시에도 당연히 target 단백질이 적게 수득됩니다. (  질문) binding 이 잘안되는 경우, binding 효율을 늘리기 위하여 어떤 방법들을 사용하시는지 여쭤보고 싶습니다. 또한, gel 사진을 해석하기에 또 다른 문제점들이 있는지를 알고 싶습니다.  ** binding이 안되는 경우, 보통 3차 구조로 his tag이 숨어버리는 경우를 의심하는 것으로 알고 있습니다. 이런 숨는 케이스를 확인하고자 하면, 어떤 방식으로 확인해야 하는지도 여쭙고 싶습니다.   감사합니다. 
회원작성글 ATTENSION  |  02.04
Q. Immunoprecipitation 후 immunoblot 결과 해석
논문을 보던 중 Western blot 결과 해석이 어려워서 질문드립니다ㅠㅠ... 질문은 크게 두가지입니다.   예를 들어, A단백질은 B, C, D와 complex를 형성한다고 했을 때, [질문1] Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 A 단백질을 Immunoprecipitation 후, B,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 컨드롤(scrambled control)에 비해 B의 증가량이 C, D의 증가량에 비해 매우 크다는 것은 무엇을 의미하나요? [질문2] 위 질문의 연장선으로,, Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 B 단백질을 Immunoprecipitation 후, A,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 위의 질문결과와 다르게, A,C,D의 증가량이 유사했다는 것은 무엇을 의미하나요?
회원작성글 옹듸  |  02.04
Q. western blot band 개선 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ
western blot을 진행하고 있는데 아래사진처럼 dot 처럼 나오는 문제의 원인을 파악하지 못해서 이렇게 질문드립니다.... 단백질 사이즈 ; 14,16kDa 15% SDS-PAGE, Bio-rad 사용 Running ; 100volt, 2h 30min   Transfer ; 100volt, 1h 일단 이런식으로 dot으로 나오는 게 아래의 작은 size 단백질만 그렇고 GAPDH나 다른 사이즈 단백질은 크게 문제 없이 나옵니다.... 작은 사이즈의 단백질에 대해서 해당문제를 해결하려면 어떻게 해야하는지 도움부탁드립니다..
회원작성글 뚜둥  |  02.04
Q. Western blot 발현량 측정 방법 질문드립니다.
안녕하세요. 공부 중에 궁금하여 질문드립니다.. 웨스턴 블롯이 타겟 단백질이 있는지 없는지 유무를 확인하는 방법이라고 이해를 하였는데요   혹시 RNA 발현량 알아보는 qPCR 실험 같이 타겟단백질의 발현량(?)을 확인하는 정량 실험은 어떤 방법이 사용되나요? 어떤 실험법으로 찾아야 공부할 수 있는지 몰라서 질문드립니다 ㅠㅠ  
회원작성글 흰털누누  |  02.03
Q. western blot 시 중단할 수 있는 단계는??
안녕하세요. 저희 랩이 조마간 이사를 가게되면서 실험 장비들을 새로 셋팅을 하게 됐는데요. chemi doc이 너무 고가라 여건이 안되서 이사 전 입주해있던 곳의 장비를 사용해야 될 것 같습니다. 그런데 거리가 1시간 거리이기도 하고 거기에 연구공간도 없고 보관 장소도 없으니 필요한 물품은 직접 들고가서 장비만 후딱 쓰고 다시 복귀해야될 것 같은데,    1. blocking 단계에서 shaking 후 blocking buffer에 담가놓고 1차 항체 들고 1시간 이동. 냉장 창고에서 o/n 진행시키고 다음 날 2차 항체 들고 다시 현장으로 이동. 2차 반응/세척 후 ECL 반응시켜 chemi doc 과정 진행. (이동 중 항체에 문제가 생기지 않을지 걱정...) 2. 2차 항체 붙이고 반응 완료후 TBST에 담가놓고 이동. 현장에서 washing 마무리 하고 ECL 처리해서 chemi doc 진행 (1시간 이동하는 과정 중에 2차 항체가 씻겨나진 않을까 걱정...)    중에 어떤 방법이 더 좋을 지 알 수가 없어서 물어봅니다. 이 외에 더 좋은 방법이 있을까요??
회원작성글 민드  |  02.03
Q. nitrile glove 투과도
요즘 western blot을 자주하는데 methanol이 든 transfer buffer 내에서 작업하는 과정에서 nitrile glove가 과연 100% 화학물질을 차단해주는가라는 걱정이 됩니다..! 기분탓인진 몰라도 장갑을 껴도 100% 방수가 되는 느낌이 아니라서요..ㅠ nitrile 장갑만 끼고 transfer buffer에 손을 넣고 실험을 해도 안전할까요..?
회원작성글 Labtor  |  02.02
Q. SDS-PAGE destaining시 색덜빠짐 문제 첨부파일
안녕하세요 여러 연구원분 열심히 연구를 배우고 있는 대학원생입니다. 다름이 아니라 요즘 SDS-PAGE 실험을 하고있는데 staining 이후 destaining시 아래쪽은 색이 다 빠지는데 위쪽은 아무리 오래 빼줘도 안빠지더라구요 ㅠㅠ 무엇이 문제이고 해결방법이 있을지 조언 부탁드립니다~!!!~!~
회원작성글 돌굴러가유  |  02.02
Q. WB시 beta-actin을 껴서 하는 이유
이번 방학에 연구실에서 western blotting 하고 있는 학부생입니다.  transfection된 cell에서 protein을 추출한 뒤 WB할 때 타겟Ab말고 beta actin을 같이 하는 것은 이유가 무엇인가요? 그냥 actin이 가장 진하게 나와서 잘 됐는지 확인하는 용도인가요? 수준 낮은 질문 답해주셔서 감사합니다.
회원작성글 앞구르기  |  02.02
Q. western antibody
안녕하세요    WB 할떄 1차 , 2차 안티바디 구분하는 법이 어렵습니다. ㅜㅜ   항체, 항원에 대한 개념과 1차 2차에 대한 개념이 있다고 하기엔 부족하고 없다고 하기엔 있는거 같습니다. 1차 항체 : A라는 동물에 target 단백질을 주사해서 만든 Ab   - 2차 항체 : B라는 동물에 A라는 동물의 IgG를 주사해서 만든 IgG       어떤 원리로 어떤 방법으로 1차 2차를 붙히는지는 알겠지만  예를 들어 actin을 확인하고자 하면 1차 안티를 anti- actin antibody in Rabbit 이라고 하면 2차 항체로 Rabbit lgG (HRB) 를 쓰는데  그러면 1차에 Rabbit를 쓰고 2차를 goat를 쓰면 안되는건가요??   1차를 rabbit을 쓰면 2차도 rabbit을 써야하는지 아니면 goat를써도 되는건지에 대한 개념을 못잡겠어요 ㅜㅜ  매번 누구한테 이렇게 쓰면 되냐고 물어볼수도 없고 공부할수 있는 좋은 방법이 없을까요?
회원작성글 AD석사생  |  02.01
Q. 면역염색이나 wb 실험시 2차 antibody관련 질문
필요한 1차 항체를 몇가지 찾다가   source에 rabbit과 rabbit IgG 가 구분되어서 적혀 있던데,   둘 다 2차 antibody를 rabbit으로 사용하면 되는건가요?   아니면 rabbit IgG에 맞는 2차 antibody가 있는건가요? 구분해서 붙여야 하나요?
회원작성글 용구리  |  02.01
Q. dilution refolding 테크닉
protein folding에서 dilution refolding 방법을 사용하려고 하는데요. 그 중에서도 pulsed dilution으로 20-fold refolding buffer에 denatured protein sample을 일정량 피펫으로 넣고, stirring 하면서 일정시간후에 다시 넣는 방법을 채택하고 있습니다. 그런데 protocol을 검색해 봐도 예시로 100ul 넣고 1min 기다리는 식으로 넣는다, 이런 식으로는 나와있지 않더라고요. 이미 졸업한 선배가 진행한 실험을 재진행하는 중이라 조언을 구할 선배가 없습니다ㅠ 1) denature protein sample을 refolding buffer에 넣는 양과 기다리는 시간은 어떻게 정하나요? 2) 피펫으로 protein sample을 넣을 때 팁을 refolding buffer 안에 넣은 후 조금씩 돌리면서 분사한다거나, 아니면 그냥 한번에 분사하거나, 위에서 방울방울 떨어뜨리거나 방법의 차이에 따라 유의미한 차이가 있을까요?
회원작성글 미틈틈  |  01.30
Q. phspho protein 웨스턴 블럿 잡band
phosphorylated protein 웨스턴 블럿시 nonspecific band가 찾고자하는 band를 구분할 수 없을만큼 많이 생기면 어떻게 해결해야하나요..? phospho protein이라 skim milk를 사용할 수 없어서 5% BSA로 blocking, 항체처리를 하고 있는데 blocking 시간을 늘려보기도 하고 항체 농도를 바꿔봐도 진전이 없습니다ㅠ
회원작성글 Labtor  |  01.27
Q. JNK 질문이요
안녕하세요   p-JNK를 보고 JNK를 확인하려니 JNK1 안티바디와 JNK2 안티바디가 각각 있네요  이럴땐 어떤걸로 토탈을 확인해야할까요?    고맙습니다
회원작성글 졸려요  |  01.27
Q. WB(Western Blot) 시 a-tubulin이 일정하지 않게 나오고 피펫팅에 관한 질문
안녕하세요. 실험실 초보 석사 1학기 대학원생입니다.  현재 실험실에서 western blot실험을 할 때 a-tubulin을 housekeeping으로 사용하고 있는데 일정하게 나오지 않고 있습니다.  모든 protocol을 익숙히 하고 실험을 진행하고 있는데도 불과하고 일정하게 나오지 않는데 아무래도 피펫팅이 큰 문제로 되고 있는것 같습니다. 일정하게 나오지 않게 되는 문제초래점 몇가지 제시해 주시길 바랍니다.   Ps. BCA assay로 protein정량을 진행하고 있는데 R^2=0.98~0.99로 나오고 있습니다. 실험을 오래 해오신 선배님들의 조언을 바랍니다~~^^
회원작성글 Lanna  |  01.25
Q. western blot : transfer 질문입니다
안녕하세요?? western blot에 어려움을 겪고 있는 석사생입니다~ 저는 melan A cell protein  30 μg 사용합니다.  SDS gel을 runnning 하고 membrane에 transfer를 하는데요~ transfer하고 난 뒤 폰슈 염색을 하면 (사진처럼) 자꾸만 깨끗하게 transfer 되지가 않아서요ㅠㅠ transfer는 2.5 A 25V에서 30 분정도 실시하구요.  처음 해봤는데 뭐가 문제인지 모르겠습니다. ㅠㅠ
회원작성글 karan  |  01.25
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