안녕하세요.    웨스턴 블럿을 하고 있는데,   당일 만든 샘플을 가지고 당일에 내리는데,   왜 젤 마다 경향이 다를까요...   이게 그 말로만 듣던 똥손인가요...ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ   미쳐버리겠습니다..

100~130kDa 사이즈 단백질 transfer하려고 합니다. 8%gel에 내렸습니다. 실온에서 메탄올 20% 트랜스퍼버퍼에 100v , 0.6A, 1시간 30분에 해도 될까요? 안에 아이스팩 넣고 30분마다 바꿔줄려고 합니다. 어떤분이 단백질사이즈가 크면 트랜스퍼버퍼에 메탄올을 안넣어야 잘된다고 하는게 그게 맞나요? 알려주세요!!!

transfer 끝나고 nitrocellulose membrance에 Ponceau solution으로 염색하면 marker는 선명하게 나오는데 band는 깨끗하게 안 나옵니다.   카세트 삽입할 때 "검은판(음극)-스폰지-3M paper-gel-membrane-3M paper-스폰지-빨간판(양극)" 이렇게 올리고 꾹꾹 누르고 90V, 0.04A, 1 hour transfer 진행하는데요.   transfer는 딱 1번 성공했습니다.    transfer가 끝나고 나면, gel에 아무것도 안 남아있어야 하나요? 그리고 gel에 Ponceau 염색해서 단백질이 남아있는지 판별해도 된다는 글도 있던데요. 그렇다면 transfer 끝나고 gel에 Ponceau 염색 후, 단백질이 gel에 있으면 다시 카세트 샌드위치 만들어서 transfer 진행해도 되는 것인가요?   웨스턴블롯 초보자는 이렇게 속으로 웁니다ㅠㅠ   

지금까지 50kDa 이하의 안티만 붙여서 거의 성공하였는데 이번에 60~70kDa대와 80~130kDa대 안티를 붙이게 되었습니다. 80~130kDa 안티를 붙일려고 gel 조성은 8%로 하였고 단백질 크기가 너무 크면 트랜스퍼가 잘 되지 않는다고 하여서 콜드룸에서 O/N해야한다고 하여서 냉장고에서 30v 0.15A로 16시간 트랜스퍼하였습니다. 겔에 염색을 해보니 단백질 거의 남아있지 않아서 트랜스퍼가 잘 된줄 알았는데 멤브레인에 워싱 10분씩 3번하고 1차안티 18시간 붙이고 워싱3번하고 2차안티 1시간 붙이고 워싱 3번하고 형광물질 붙이고 이미지를 찍고 확인해봤는데 밴드가 전혀 1도 안보입니다ㅜㅜ 트랜스퍼를 너무 오래해서 멤브레인을 넘어간 걸까요? 머가 문제인지 잘 모르겠습니다.ㅜㅜ 그리고 80~130kDa처럼 단백질크기가 커도 꼭 트랜스퍼 O/N안해도 되나요? 원래 평소에 50kDa 이하단백질을 보려고 할때 12%gel에 트랜스퍼할때 실온헤서 스티로폼 박스에 트랜스퍼통 넣고 주변을 얼음으로 감싸고 통 안에 아이스팩넣고 100v 0.4A 1시간30분을 하였습니다. 30분마다 아이스팩도 갈아주었고요. 근데 트랜스퍼끝나고 멤브레인 꺼낼때 보면 버퍼가 조금 따뜻합니다. 온도에 많은 영향을 받는걸로 아는데 아이스팩 교체 시간을 짧게 해야할지 어떻게 해야될지 모르겠습니다.ㅜㅜ도와주세요.  

현재 웨스턴을 엄청 많이 하는중인데 gel만들때 40% acrylamide solution 19:1를 사용하는데 거의 다 사용하였는데 아직 배송이 안왔습니다. 근데 실험실에  40% acrylamide solution가 유통기한이 2020년 3월까진 것이 있는데 거의 새거더라구요. 2년이나 지났는데 사용해도 될까요?ㅜㅜ  

위에 더블밴드 뜨는건 맞는데 밴드 모양이 이상해요... 교수님께 여쭤 봤더니 젤을 좀더 신경써서 만드는게 좋겠다는 말만 들어서요.... 젤은 13.5%sds page gel 만들어서 씁니다. 아래 밴드는 GAPDH구요.  위 밴드는 14, 16kDa입니다. 당연히 같은 gel에 로딩한것입니다. 젤은 전날에 만들어둔거 썻습니다. 안티바디는 얼려놨던걸 재사용 했어요. 이부분도 문제가 생길까요..? 젤 말고 다른 원인은 없을까요?

웨스턴하려는 프로테인이 좀 커서 트랜스퍼를 냉장고에서 O/N을 하려고 하는데요. 원래 작은 사이즈를 할때는 실온에서 스티로폼 박스에 트랜스퍼 통을 넣고 주변을 얼음으로 채우고 안에 아이스팩을 넣어주고 트랜스퍼를 하였습니다. 근데 냉장고에서 O/N을 하려는데 실온과 같이 스티로폼에 얼음채우고 해야하나요? 어차피 얼음은 녹을테니 그냥 트랜스퍼 통에 아이스팩만 넣고 냉장고에서 트랜스퍼 해도 될까요?

lab실 마다 정량 방법이 달라서... Bradford로 어떻게 정량해야하질 모르겠어요. 아직 아무도없어서 포로토콜 잡아가는단계되요.. 어떻게 하면  std와 sample을 어떻게 처리해야할지알려주세요. 너무 답답해요... 이해도 잘안되고요 

안녕하세요 zymography를 처음 해보는 석사생입니다ㅠㅠ 도움 받을 분이 없어서 혼자 진행해봤는데요,, Gelatin zymography를 통해서 MMP-9의 활성을 보려고 했는데 밴드가 아에 뜨지를 안습니다,, Sample을 prep은 먼저 6웰 플레이트에 A549 cell을 깔고 부착후 starvation하였고 후에 cell을 자극하고 시료를 처리하여 conditioned media를 모았습니다(starvation부터 모든 media는 SF media를 사용했구요) 이 샘플로 MCP-1 등의 ELISA 측정을 하였고 최종적으로 zymography를 수행했습니다,,!ㅠㅠ Zymography의 모든 젤과 시약은 invitrogen novex제품을 사용했는데요, Conditioned media를 LDS sample buffer(4x)로 4배 희석시켜준 후에 로딩하여 90V로 3-40분 정도 전기영동하였고 후에 renaturing buffer(1x)에 30분, developing buffer(1x)에 30분 상온에 둔 후 새로운 developing buffer로 교체하여 37도에서 overnight 했습니다. 후에 wash 3회 진행하였고 simplyblue safestain으로 1시간 gel 염색 후 d.w로 1시간 탈색하였습니다. 근데 아에 밴드가 뜨질 않아요,, 염색 후에도 밴드가 안보였으나 그대로 진행해봤는데,, 왜 안뜨는걸까요?,,, 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

트랜스퍼를 하는데 37kDa짜리는 혹시 100V, 2시간을 하면 다 넘어가 버리나요? 오늘 두개의 멤브레인을 디텍 했는데 샘플이 만약 6개라고 하면 loading control이라서 6개가 다 나와야 정상인데 일부만 디텍 된다거나 아예 나오지가 않습니다 ㅜㅜ 혹시 37kDa 크기는 보통 어느정도 진행해야 하나요? 그리고 130kDa정도의 protein도 저정도면 너무 오버 된 걸까요? 130kDa도 안 나와서요ㅜㅜ(130kDa은 background는 뜨는데 밴드가 안 떠요) Target protein이 250kDa이라서 100V 2시간 해주고 37,100(130보려고 100에서 잘라줘요)부분만 잘라서 붙여주는데 일부만 보이거나 아예 안 보여요ㅠㅠ (Target protein은 그래도 보이긴 보임) 젤은 10% 사용하고 있습니다! 바뀐점은 로딩 양이 20에서 절반으로 줄은 점 밖에 없는데 이게 요인이 될 수 있나요? 만약 transfer 볼트와 시간이 문제라면 어느정도가 적당 할까요? 단백질 로딩 양도 20으로 해야 할까요? -제가 웨스턴 한 지 별로 안 돼서 정말 혹시나 두 멤브레인을 바꿔서 ab를 붙였나 생각도 해봤는데요. 트랜스퍼 후 membrane에 윗 부분(여유가 있는 부분)쪽부터 크기가 커짐->작아짐 아닌가요?

제가 붙이려는 antibody가 ser/thr이 있는데 이게 무엇인지를 알겠는데 어떠한 것을 보고 선택하는지 모르겠습니다. 아무리 찾아봐도 ㅜㅜ 모르겠어서 질문합니다.ㅜㅜ 제가 셀에 처리한 시약의 data sheet를 보니 source에 ser21-lys166이라고 있는데 그럼 이 셀의 protein을 웨스턴하고 anti를 붙일때는 phospho-ser를 붙이는게 맞나요? 위 내용이 맞다면 다른 시약은 아무리 찾아도 ser/thr에 대한 내용은 없고  The human EG-VEGF gene codes for a 105 amino acid polypeptide containing an N-terminal signal sequence of 19 amino acids. Recombinant Human EG-VEGF is a 9.6 kDa protein consisting of 86 amino acid residues, including ten cysteine residues that potentially form five pairs of intra-molecular disulfide bonds. 이렇게 적혔있는데 어떻게 해야될지 모르겠습니다. 제발 도와주세요!!!!    

막 대학원을 시작하는 학생입니다.. 1mg/ml BSA STOCK 을 표처럼 시약을 넣어서 표준곡선을 그린후 BSA (ug/ml) 0 2 4 6 8 10 12 14 D.W(ul) 800 798 796 794 792 790 788 786 Reagent(ul) 200 200 200 200 200 200 200 200 Total(mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 sample은 넣어 sample  5ul D.W(ul) 795ul Reagent(ul) 200ul Total(mL) 1 96well에 595nm로 흡광도를 측정하여 y = 0.0555x + 0.2786이 나왔는데  sapmle x 값이 6.94가 나왔습니다.  근데왜 6.94x2를 해서 13.88로해서 해야하는건지 이해가 안되서요..   5x sample buffer  D.W   total 13.88 4 2.12   20ul   13.88로해서 왜 western loading 해야하나요..? 정말 답을 모르겠어요

웨스턴할때 phospho antibody가 세린과 티로신 두가지가 존재하더라구요. 두 개는 각각 어떨때 사용해야나요? 현재 돼지자궁세포에 ifn-g와 prok1 처리를 하고 ARK, GSK, STAT1, JAK1의 antibody를 붙일려고 하고 있습니다.  

보통 한 membrane을 stripping 하는 최대의 횟수는 어느 정도 인가요? 지금까진 한번씩 해왔었는데 혹시 두세번까지도 가능 한가요?

지금까지 70kDa이하의 단백질들만 웨스턴을 하였는데 이번에 처음으로 80~90대와 130kDa 사이즈의 단백질들을 웨스턴 하게 되었습니다. 교수님께서 separating gel 조성도 8%정도 해야하며 트랜스퍼도 4도에서 overnight해야 트랜스퍼 된다고 하시는데 저희 실험실에서 보통 트랜스퍼할때 통외부를 얼음으로 감싸고 20%메탄올첨가된 트랜스퍼버퍼를 붓고 안에 아이스팩도 넣고 실온에서 100v, 0.4A , 1시간 30분을 해주고 있습니다. 트랜스퍼를 4도에서 O/N을하게되면 전압과 전류는 어느정도로 해야하며 O/N을 16시간으로 생각하면될까요?  그리고 4도에서 하면 통안에 아이스팩 넣지않아도 되나요? 알려주세요ㅜㅜ 부탁드립니다.

휘발성 물질을 Ethylacetate로 추출 하고 탈착용매를 methanol로 사용을 할건데 internal standard 도 같이 넣고 싶습니다  E.A에다  istd 넣고 추출을 한다음에  Methanol 를 넣는건지 E.A를 추출한 다음에 Methanol과 istd를 넣고 분석을 하는건지 몰라서 질문합니다. 감사합니다!