염기서열을 아미노산 서열로 변환하는건 아는데 반대는 어떻게 해야하는지 몰라서요ㅜ 혹시 아는분들 답변 부탁드립니다!

어떤 protein의 E3 ligase가 밝혀져 있지 않았을 때 이를 찾아내기 위해 어떤 step을 거쳐서 밝혀낼 수 있을까요?

안녕하세요, 스펀지 형태의 콜라겐을 버퍼나 물에 분산시켜 콜로이드 용액을 제조하고싶습니다. 그런데 계속 용해되고 나서 굳어버리네요,, 콜라겐이 녹지 않고 고르게 분산만 시킬 수 있는 방법이 없을까요? 

안녕하세요. 단백질 정량에 대해 공부를 하고 있었는데 궁금한게 생겨서 질문을 드립니다. bradford assay에 사용되는 G-250 dye에 대해서 궁금한게 생겼습니다.  G250 의 cationic form - red, neutral form - green, anionic form - blue라는데 protein과 G-250 dye의 interaction의 시작은 G-250dye에서 전자를 protein의 polarable group에 제공을 하면서 진행된다고 하더군요.  그럼 더 cation으로 되는게 아닌가 싶은가 생각이 들어서 질문을 드립니다. protein와 G-250의 결합이 van der Waals force이 가장 크게 작용하지만 ionic bond도 어느정도 영향을 주는것으로 생각되는데 protein과의 결합을 통해 free electron의 위치가 바뀌면서 G-250의 흡광도가 바뀌는것으로 유추하면 되는것인지 궁금합니다.  또한 흡광도의 변화가 dye의 conformation까지 변화를 시키는 것인지,, 도 궁금하네요 ㅠ 화학적 지식이 부족해서 질문을 드렸습니다.  감사합니다.

안녕하세요 클로닝을 진행중인 대학원 1기입니다. Glucose-6-Phosphate Isomerase를 codon+에 transformation 후 단백질을 발현하여 정제한 후 효소활성을 측정하려고 하는데 키트를 사라고 나올 뿐 실험 방법을 찾기가 쉽지 않네요. 혹시 활성 측정 방법을 아시는 분 계신가요? 

안녕하세요! 단백질 정제 후 HPLC 분석 과정에서 질문이 있어 글 남기게 되었습니다. 저희는 현재 정제한 protein의 purity를 확인하기 위한  목적으로 SEC를 사용하고 있습니다. 2년정도 사용했다는 Tosoh 사의 TSKgel 3000 SWXL column을 사용하다가 동일 모델을 새로 주문하여 교체 하였으며, 컬럼 교체 후 chromatogram이 기울어지는 형태로 나오는 문제가 생겼습니다.  이전과 동일하게 column 사용 전 mobile phase를  평균 1시간~2시간 정도 흘려주어 안정화 시키고 사용하였지만 초반 4~5개 sample을 분석할때까지도 chromatogram이 눈에 띄게 기울어져서 나타납니다. 새 컬럼을 사용하기 전 DW로만 wash하고 사용하였는데, 제조 과정에서 섞여들어간 불순물이 제대로 wash 되지 않았을 가능성이 있을까요? 추가적으로 column에 대한 QC 방법이  궁금합니다!   제조사에 contact 하여 질문하려고 했는데 Tosoh의 한국지사 홈페이지를 찾지 못해 bric에 질문 남겼습니다. 감사합니다!   

안녕하세요. 제가 지금 연구계획서를 작성하기 전에 이론적인 실험법을 구상하는 중인데요. 생물을 배우기 시작한지 얼마 안된지라 배경지식이 너무 부족해서 가르침을 좀 구하고 싶습니다..ㅜㅜ 일단 연구과제의 전체적인 흐름을 간략히 말씀드리면 1 오염물질 x를 영양원으로 육성가능한 미생물 A주가 어떤 종의 미생물인지 동정 2 미생물A가 물질 x를 어떻게 분해하는지 해명하기 위해, x를 분해하는 데 필요한 단백질 Y를 코드하는 유전자 y를 동정 3 유전자 y로 이루어진 Y를 대장균으로 대량 생산 -> 오염물질 x를 효율적으로 제거 입니다. 지금은 시작 단계라 전체적으로 어떻게 진행할지를 정리하는 중인데요, 찾아보다보면 너무 구식인 방법이라던가 제가 알아내고 싶은 것과 다른 걸 알아내는 방법인게 많더라구요.. 그래서 혹시 이게 알맞은 과정인지 아닌지 확인 좀 부탁드리고 싶습니다ㅜㅜ   일단 1에서는 16s rRNA 시퀀싱을 하려고 합니다.  그 과정으로 16s rRNA를 코드하는 DNA를 추출해서 분리하고, 유니버설 프라이머를 설계해서 PCR로 증폭합니다. 이렇게 얻어낸 dna 단편을 sanger나 NGS로 염기서열을 알아내고, BLAST 같은 데이터베이스에 검색해서 비슷한 배열을 갖는 미생물을 조사해서 종을 특정합니다. ->여기서 궁금한 부분은, 제가 27F와 1492R의 프라이머 세트를 쓰려고 했는데 이 경우 16s rRNA가 너무 길어서 문제가 되나요? 찾아보니까 V3-V4 영역만 따로 잘라내서 증폭한다고 하는데 이 경우에 미생물을 종까지 특정 가능한가요??    2에서는 PMF법을 이용하려고 합니다. 먼저 물질 x가 풍부한 환경에서 미생물 A를 배양해서, 발현한 단백질 혼합물을 추출해서 SDS나 전기영동으로 각각의 단백질을 분리하고, 트립신 등 소화효소로 단백질을 분해해서 그 펩타이드 조각을 질량분석기로 스펙트럼을 분석해서, 단백질 분해 패턴을 테이터베이스랑 비교검색해서 가장 가능성이 높은 단백질을 동정한다.. ->pmf법에 대해서는 이 사이트(bric)의 다른 질문을 참고로 했는데요.. 단백질을 분해해서 어떤 펩타이드로 분해되는지 그 패턴을 질량분석기로 조사하는 건지, 혹은 펩타이드를 질량분석기로 분석해서 프래그먼트 이온의 스펙트럼 데이터를 얻어서 각 펩타이드가 뭔지 조사하고 그걸 다시 합쳐서 전체 단백질의 서열을 알아내는 건지를 모르겠습니다ㅜㅜ 그리고 물질 x가 풍부한 환경에서 미생물 A를 배양해서 생기는 단백질들을 다 조사한다고 해도, 어떻게 X 분해에 관련된 단백질을 알아낼 수 있는지 그 다음 방법이 검색해봐도 잘 나오지를 않아서 그 이상 구상을 못했습니다.. 제가 생각한 건 각 단백질을 일일히 분리해서 대량으로 생산한 다음에 X를 주입해서 분해하는 것들을 찾아낸다.. 인데요. 이게 어느정도 가능성 있는 얘기일까요? 조언 좀 부탁드립니다.ㅜㅜ   3에서는 2에서 알아낸 유전자 y 단편을 발현 벡터에 넣어서 재조합 DNA를 만들고, 이걸 대장균에 넣어서 배양해서 증식시키면 그 산물로 단백질 Y를 얻을 수 있을까 생각했습니다.(subcloning) 그래서 먼저 유전자 y용 프라이머를 설계해서 PCR로 증폭해서 유전자 y 단편을 준비하고(+제한효소 처리), 발현벡터에 ligation해서 재조합DNA를 만듭니다. 그리고 transformation으로 대장균을 배양해서, 크로마토그래피로 발현한 단백질을 정제합니다. ->발현 벡터에 대해 찾아보다 보니 삽입할 유전자의 길이에 따라서 플라스미드 벡터, 파지벡터 등등 여러가지를 사용하던데, 유전자 y의 길이가 어느정도일지 예측하는 것은 어렵겠죠??   여기까지 입니다. 지식이 부족한 채로 긴 글 올려서 죄송합니다.. 길고 귀찮은 글이지만 너무 말이 안된다 싶은 부분이 있으면 꼭 지적 부탁드리고 싶습니다ㅜㅜ             

단백질을 ammonium sulfate로 침전시킨 후에 20mM sodium acetate(pH4.5)인 buffer에 투석중입니다. 그런데 지금 약 22시간이 지났는데 아직도 침전물이 사라지지 않고 꽤 있어요.. 이럴 때 멤브래인을 다시 교체해주는게 좋을까요..? 투석 buffer는 3번 정도 갈아줬습니다.

작년에 했던 hydrangenol의 항염증효과 확인 실험에 궁금증이 몇개 생겼습니다. Western blotting은 전염증성 단백질 iNOS의 발현량이 결과적으로 줄어드는지, 혹은 늘어나는지만을 확인할 수 있는 실험이었던 것으로 이해했습니다. 그래서 hydrangenol이 항염증효과가 있는 것은 밝혀냈지만, hydrangenol이 1)intracellular cascade인 NF-kb pathway의 cytoplasm(세포질)에서 일어나는 과정 중 하나를 억제를 억제하는 것인지 2)transcription 단계가 일어나기 전에 DNA condensation(DNA 응축)을 통해 transcription을 억제하는 것인지 3)transcription factor(NF-kb)의 작용을 억제하는 것인지 4)transcription 이후 translation(번역)을 억제하는 것인지 5)translation 이후 합성된 polypeptide의 입체 구조 형성을 막거나 활성화된 단백질을 분해하는 것인지 에 대해 궁금증을 느껴, 추가 실험을 설계하고 궁금증을 해소하고자 합니다. 1)~3)중 하나인지, 혹은 4)~5)중 하나인지는 RT-PCR을 통해 구분할 수 있을 것 같은데, 그렇게 구분한 후에는 어떤 실험을 해야 hydrangenol이 정확히 어떤 과정에 개입함으로써 iNOS의 발현을 억제하는 것인지 알 수 있을까요..??  고등학생이라, 아직 아는 것도, 배운 것도 적습니다ㅠㅠ 질문이나 알고 있는 개념에 오류가 있다면, 양해 부탁드리고, 무엇을 잘못 알고있는지도 질문에 대한 답변과 함께 설명해주시면 감사하겠습니다!

안녕하세요. pH 안정성 실험을 하려고 universal buffer를 만드려고 하고 있습니다. buffer의 조성은 boric acid, acetic acid, phosphoric acid이고 NaOH로 pH를 적정하면 된다고 합니다. 인터넷을 찾아보았을때 각 용액을 40 mM로 준비하여 동일양을 섞고 0.2 M NaOH로 pH를 맞추면 된다고 나오는데.. 그럼 농도가 변하는거 아닌가요? 전 각 용액을 200 mM로 맞춘 후 40 mM이 되도록 2 ml씩 섞고 (total 10 ml) 나머지를 NaOH와 물로 mess up 하려고 했습니다.. 혹시 어느 방법이 맞는걸까요? 

안녕하세요. 혹시 protein의 amino acid(a.a.) sequence에서 a.a.가 딱 하나만 바뀐다고 할 때, (i) (+) charge를 띠는 side chain을 가진 a.a.가 (-) charge를 띠는 side chain을 가진 a.a.로 바뀌는 경우 (ii) (+) charge를 띠는 side chain을 가진 a.a.가 hydrophobic한 side chain을 가진 a.a.로 바뀌는 경우 중 어떤 경우가 protein function에 더 큰 영향을 줄까요? 상황에 따라 다를 수 있는 걸까요? 답변 부탁드립니다. 감사합니다.

ㅇ 넙치의 LEAP-2 라는 항균펩타이드 시퀀싱을 클로닝 위해 프라이머 디자인을 하고 있는데 뉴클레오타이드 서열에서의 CDS를 단백질 PASTA로 확인해보니 Region 이라는 영역이 있는데 이것이 정확히 무엇을 의미하는 지 잘 모르겠습니다. 갈색으로 색칠된 부분의 앞쪽까지는 signal peptide인것 같은데 뒤쪽에 색칠 안된 부분은 기능을 안하는 불필요한 부분인건가요?

culture media를 농축시킬 때 amicon tube말고 다른방법으로 농축시키는 방법을 찾고있습니다. SpeedVAC Concentrator (Thermo) 라는 기계로 혹시 media도 농축을 시킬 수 있을까요?

안녕하세요, co-IP 실험을 한지 얼마 되지 않은 대학원생입니다. 질문드리려는 내용이 너무 기초적인 내용인 것 같아 스스로도 부끄럽지만 protocol을 봐도 혼란스러워 질문 드립니다... co-IP 시 넣어야 하는 normal IgG의 양과 IP에 사용하는 antibody의 양은 동일해야 하나요, 아니면 protein 양에 대한 비율만 맞으면 되나요? 저는 cell lysate를 600ug으로 잡는데 이를 만약 2:1의 비율로 나누어 400ug에는 IP할 antibody 2ug을, 200ug에는 IgG antibody를 넣고 싶다면 이 때 들어가는 IgG의 양은 1ug이 맞을까요? 그리고 이렇게 2:1로 실험해도... 되나요? 만약 heavy chain이 detection 된다면 두께도 2:1이 되니 이렇게 해서는 안되는 건가요? 그렇다면 cell lysate를 1:1로 나누어 진행하면 될텐데 300ug의 protein에 대해 IP antibody와 IgG antibody에 각각 2ug 정도로 같은 양의 antibody를 넣어야 하나요?   답변 부탁드립니다....

polysome profiling에서 y축에 260nm라고 써있어서 method를 봤더니 50 OD260를 sucrose gradient에 load했다고 써있고 254nm에서 모니터했다고 하는데 254nm에서는 무엇을 측정한건가요?? ribosome을 측정한것으로 봐야될까요  y축에는 260nm로 써있어서 260nm로 측정한 줄 알았는데 method에는 254nm로 측정했다고 써있네요..

  transformation 관련 질문드립니다.   몇일전에 plasmid prep 한 걸로 transformation 을 진행하엿는데..   plasmid prep한 Sample 이  상태가 않조은지   colony수가 너무 적어서 재transformation 진행하려고 합니다.   혹시 전에 transformation후  incubate  후 60% glycerol+stock    -80 도씨 deep freezer 에 보관해둔 걸로 재transformation 진행해도 될까요??  

데이터분석 프로그램 CDNN이나 JASCO에서나온거 쓰는건 아는데 어디서 다운받나요?ㅠㅠ 아무리 찾아봐도 안나와서요ㅠㅠ

안녕하세요 바쁘신데 제 글까지 읽어주셔서 감사합니다   다름이 아니라, 제가 실험하고 있는 주제에서 protein #1,#2가 Binding하는건 확인했는데 cis로 붙는지 trans로 붙는지 확인을 하고싶습니다 혹시 이걸 확인 할 수 있는 실험방법이 있을까요..?

제가 confocal을 찍었는데 HeLa cell 핵을 염색하면 계속 이런식으로 더럽게 나옵니다. 핵은 hoechst 33342로 1:500 in PBS에 희석해서 4도씨 30min incubation 했구요,, 마이코플라즈마 컨탐인가요? 

균을 배양하여 박테리오신을 분리하여 실험을 진행하고 있습니다. 그런데 유산균들이 stock vial을 풀어서 액체배지 4 ml에 접종하였을때는 seed에 활성이 있는데, 고체배지에 streaking 하여 자란 콜로니를 액체배지에 배양한 경우에는 자꾸 활성이 사라집니다.  배지는 모두 MRS를 사용하였고, 혹시 배양 시간이 문제인가 해서 24시간부터 96시간까지 배양해보았는데도 전혀 활성이 나오지 않습니다.  왜 stock vial을 배양하였을 때만 clear zone이 나오는지를 모르겠습니다..ㅠㅠ + stock vial을 사용하여 배양한 것 역시 24시간동안 배양하였습니다. + 배양상등액(stock 사용)에 proteinase K를 처리하였을 때 활성이 사라지는걸로 봐서 단백질성은 맞는 것 같습니다.