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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > etc.
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Q. 단백질정량
안녕하세요 궁금한 사항이 있어 질문 남깁니다. 이번에 NO production을 찍는데 protein 별 정확한 NO production을 확인하기 위해 24 well에 seeding을 진행한 뒤 상등액으로 NO를 찍고 아래 남아있는 cell의 protein 수득을 통해 protein 별 발생한 NO 값을 측정하고자 합니다. 우선 protien lysis는 100ul로 진행하였고, 정량을 통해 y=A+Bx의 값을 얻었습니다. standard인 BSA의 단위가 mg/ml여서 얻은 x의 값에 100ul를 곱해 100ul의 용액 속 protein이 x*100의 양이 들어있다고 계산을 하였고, 이에 따른NO production을 비례식을 세워 구하려 하는데 측정된 NO 값에서 비례식을 어떤식으로 세워야 하는지 감이 잡히지 않습니다ㅜㅜ 얻은 상등액은 800ul인데 이것을 이용해서 비례식을 세워야 하는 걸까요..? 아시는 선생님 계시면 설명 부탁드리겠습니다..ㅜㅜ
회원작성글 swy959  |  10.01
Q. DLS size 분석
DLS 장비로 입자의 size를 분석했는데, 프로그램에서 그려주는 그래프가 맘에 안들어 prism으로 그리려고 합니다 data중에.. 총 50번을 측정해서 평균을 내는 건데 Accumulation Times Diameter(realtime) (nm) Mean Diameter (nm) 1 355.23 355.23 2 461.8952 410.8671 3 433.983 418.5612 4 395.8475 412.1303 5 399.6825 408.3363 6 442.3278 414.1017 7 419.1974 414.2894 8 361.1713 408.6859 9 399.517 407.3861 10 437.4266 410.397   여기서 mean diameter가 의미하는 바를 모르겠습니다 10번까지 평균을 구해보면 410.6278 인데.. 410.397은 어떻게 나온 수치일까요?
회원작성글 모자  |  09.30
Q. 단백질band 질문있습니다.
위아래로 잡band 생기는 이유가 궁금합니다 ㅠㅠ!!   
회원작성글 choheec  |  09.29
Q. IP시 sup 제거 방법
안녕하세요, 몇 달 째 IP로 헤매고 있는 대학원생입니다.   실험 테크닉?에 관한 질문입니다만, 혹시 IP할 때 bead 추가 -> rotation -> washing하고 난 후 마지막 washing이 끝나고 sup을 최대한 제거하여 bead의 target protein만 eluting하게 되는데 이 때 sup 최대한 제거할 때 어떤 방법으로 하시나요?   저는 현재 200ul pipette tip을 최대한 e-tube 벽에 밀착시켜 sup만 suction 되게끔하고 있는데 혹시 다른 좋은 방법이 있는지 궁금합니다.   감사합니다.
회원작성글 릴미  |  09.26
Q. Native gel 양쪽으로만 세게 염색되는 현상 첨부파일
기존 bio-rad precast gel 4-15%을 사용하여 Native gel 단백질을 분석하는데 실험 비용을 줄이고자 동일한 스펙에 다른 회사 Precast gels을 사용했는데 밴드가 예쁘게 나오지 않고 저렇게 양쪽으로만 세게 염색이 됩니다. 혹시 무엇 때문인지 알 수 있을까요? 참고로 Marker는 동일하게 잘 내려갑니다.
회원작성글 외계인눈깔아왱  |  09.26
Q. PD-10을 이용한 buffer exchange 관련 첨부파일
안녕하세요. PD-10을 이용한 buffer exchange 관련해서 질문이 있습니다. 제가 protein을 주로 다루지 않고 화학분야라 처음해봐서 어려움이 많네요 ㅠㅠ 제가 할 것은 His tag protein의 조성이 실험에 영향을 주어 Buffer exchange를 하려고 합니다. 이때, PD-10 column이 제 실험에 적합할 것 같아 사용하려고 합니다. - Storage condition : 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 125 Mm imidazole, 50% Glycerol (v/v) - Exchange 후 condition : PBS   질문 : 1) Glycerol 50% (v/v)이 viscosity하여 column하는데에 영향을 줄 것 같아 dilutio해서 진행하려고 하는데 어느 정도 %로 할지 궁금합니다. 서치해보니 5~10% glycerol 정도는 PD-10 으로 가능할 것 같은데 기준 같은 것이 있을까요? 잘 분리되는지 여부는 small scale로 test를 해봐야 아는 걸까요?   2) Gravity protocol 에서 elution 단계에서 3.5 mL를 받는다고 적혀있는데 보통 하나의 test tube에 전부 받는지, 아니면 조금씩 (약 0.5 mL) 씩 나눠 받는지 궁금합니다. 또한, 3.5 mL 를 받고 나서 추가적으로 더 elution buffer를 넣어서 collection하진 않을까요? Protein이 다 나오지 않았을 수 도 있으니까요.   프로토콜 첨부하겠습니다. 도움주시면 감사하겠습니다. ㅠㅠ
회원작성글 감자랑나랑  |  09.21
Q. MS를 이용한 항체 epitope mapping 서비스 제공하는 국내 회사 추전 부탁드립니다.
국내사 중에 HDX-MS 혹은 XL-MS를 통한 epitope mapping 하는 곳들이 있을 까요? 전문적으로 하는 곳 추천 받고 싶습니다.
회원작성글 shkim20  |  09.20
Q. cy5.5 염색
대장균에서 발현/분리/정제한 단백질에 cy5.5 dye를 염색하는 것이 실험실에서 간단히 되는 일인가요?  지식도, 경험도 부족하고, 주변에서 본 것도 없어서 ㅜ.ㅠ 단백질에 염색한 후 마우스에 주입해서, 이 단백질이 어디로 가는지 보는 실험을 하려고 합니다. 일단 염색이 석사생 손에서 수월하게 뚝딱 되는 것인지가 궁금하고요, 또 염색이 잘 되면, 마우스에 들어가서도 하루-이틀 안깨지고(?) 잘 버티는지가 궁금합니다. 이건 케바케일 것 같아 꼭 답 안해주셔도 됩니다!
회원작성글 색연필  |  09.20
Q. ELISA 진행할 때 같은 샘플에서도 다른 결과가 나오네요;;
안녕하세요.  저는 최근에 Extracellular vesicle 연구를 시작한 대학원생입니다.  EV의 isolation이후 ELISA로 CD63 단백질 발현을 확인하며 EV의 양을 가늠해 보고 있는데요.  문제는 ELISA 결과를 보면 같은 샘플에 대해서도 어떤 well은 반응이 뜨고 어떤 well은 뜨지 않으면서 편차가 굉장히 크다는 것입니다.  물론 손으로 실험 하다보면 당연히 편차는 생기는 것이겠지만 그 정도가 OD 기준으로 10배 가까이 발생하기도 합니다.  혹시 이런 경우 실험의 숙련도와 상관 없이 고려해봐야 하는 이슈가 뭐가 있는지 경험 많으신 분들께 여쭙니다.  감사합니다. 
회원작성글 대학원생327  |  09.20
Q. phosphomimetic mutant에 관해서 질문이 있습니다.
안녕하세요, 논문을 읽으면서 공부하고있는 대학생입니다. 다름이 아니라 논문을 읽으며 phosphomimetic mutant, phosphoinhibitory mutant 같은 용어가 많이 쓰이는것을보게 되었습니다. 그런데 논문을 읽으며 보니phosphomimetic 돌연변이가 있으면 인산화가 잘일어나지 않는다고 하는 것을 보게 되었는데요, 실험에서는 이 돌연변이가 이미 인산화되어있는 상태처럼?기능을 하는 것 같아서요ㅠㅠ 대체 이 두가지 돌연변이가 정확히 무엇인지 알 수 있을까요?
회원작성글 lkdjf  |  09.18
Q. ATP가 없을 때 protein의 phospholylation이 풀릴까요?
안녕하세요, kinase를 넣어 target 단백질의 phospholylation을 진행하려고 합니다.   간단한 기작은 이렇습니다. 두 개의 단백질의 complex를 조성하고 싶은데, 그 중 하나의 단백질에서 phospholyaltion이 일어나면 안정한 complex를 이룹니다. 이 과정에서 kinase와 ATP를 넣어주어 phospholylation을 시켜주는데 후에 complex만을 얻기 위해 kinase를 제거해줍니다.   이때, buffer에서 ATP가 없어지면 complex안의 phospholylation이 풀릴까요? Kinase는 RSK2라는 단백질을 사용합니다. 도움 부탁드립니다ㅠㅠ
회원작성글 코코팜500배  |  09.08
Q. Amicon filter에서 filtration이 잘 되지 않았던 분 계신가요??
안녕하세요, 제가 단백질에 DNA를 붙이는 bioconjugation 실험을 하고나서 단백질에 붙지 않은 DNA를 Amicon filter를 통해 제거하려고 했는데, 이상하게도 DNA들이 제거가 되지 않더군요.   혹시 Amicon filter 사용해보신 선생님들은 저와 같은 경험이 있으신지 궁금합니다. 제 실험 과정에 대해 짧게 요약해드리면, 일단 DNA는 single stranded DNA(5'Cy5 dye modified)로 Mw:17000정도 됩니다. 단백질-DNA conjugates은 Mw: 55000정도이구요. Amicon filter는 30K로 사용했고, filter후에도 육안으로 Cy5 dye DNA(푸른빛)가 걸러지지 않아서 50K로 Amicon filter를 해주었습니다. 50K filter도 해줬는데도 전기영동(SDS-Page gel)후 17000정도에서 강한 signal의 DNA band가 확인되었습니다. Amicon filtration 과정에서 Centrifuge는 3번(14000g 10min)/ reverse spin(1000g 5min) 1번 해주었는데 과정상에 문제가 있는지 혹은 제가 뭔가를 놓치고 있는게 있을까요? 혹시라도 선생님들께서 저와 비슷한 경험을 하셨으면 어떻게 극복하셨는지 궁금합니다. 감사합니다. 
회원작성글 공부하자공부  |  09.01
Q. IP할 때 antibody 종류가 IgG가 아닌 IgA인데요,
안녕하세요, 제가 정말 많이 연구되지 않은 단백질 A에 대해 co-IP 실험을 하려 하는데, 이 A에 대한 IP 가능한 antibody가 시중에 한 종류 뿐입니다. 우선 이 antibody의 datasheet를 보고 IP 조건을 잡으려 하는데, 이 antibody가 일반적인 IgG가 아닌 IgA type인 것 같더라고요. Host는 mouse이고, 아래가 datasheet 일부 발췌한 것입니다. 그리고 recommended support reagent로 IP 시 듣도보도 못한... A/G가 아닌 protein L agarose를 쓰라고 하더라고요.   Agarose야 datasheet 추천대로 구입하면 되지만 문제는 control Ig입니다. 이 antibody에 대한 negative control는 normal mouse IgA가 되는 것이 맞나요?   IgA antibody가 희귀한 것인지 IgA가 control로 쓰인 논문이 없는 것 같아서 제가 맞게 생각한 것인지 걱정스럽습니다.   IP 많이 해보신 분들이나 아시는 분 도움 부탁드립니다ㅜㅜ
회원작성글 릴미  |  08.30
Q. Detergent insoluble fraction의 IP 실험 질문
안녕하세요,    관심있는 단백질의 protein-protein interaction을 확인하고자 immunoprecipitation 실험을 진행중에 있습니다. 확인하려는 단백질이 detergent insoluble fraction으로 aggregation되면서 IP하는데 문제를 겪고 있어 해결 방법이 있을지 질문드리고자 글 작성합니다.    기존에 일반적인 방법으로 soluble fraction IP를 진행할때는 0.5% NP-40 detergent가 포함된 lysis buffer를 사용했습니다. Protein-protein interaction을 깨지 않으면서 Insoluble fraction도 녹여낼수 있고, IP 실험도 진행 가능한 detergent나 buffer 조건이 있을까요?   Reference를 보고 6M urea로 lysis 후 투석하여 기존의 buffer 조건으로 되돌리는 실험을 진행한 경험이 있으나, 투석 시 Urea가 빠지면서 insoluble fraction이 다시 aggregation 되는 것을 확인하였습니다.    관련하여 조언해주시면 감사드리겠습니다. 
회원작성글 파란돼지  |  08.29
Q. 효소 unit 단위 계산
lipase를 4-nitrophenyl butyrate를 기질로 사용하여 활성 측정 후 그 흡광도 수치를 unit/ml의 단위로 환산하고 싶습니다. lipase는 1min당 1umol소모한 것이 1unit으로 알고 있는데 1min당 1umol이 소모된것을 어떻게 아는지 모르겠습니다. 예를 들어 1% lipase 100uL와 아세토나이트릴에 녹인 50mM 4-nitrophenyl butyrate를 50ul 그리고 25mM sodium phosphate 2.5mL를 넣고 10분 반응해서 흡광도가 348nm에서 0.454가 나왔다면 이것을 unit/ml 단위로 환산이 가능한가요? 아니면 standard를 그려야하나요? 그려야한다면 방법을 말씀해주실 수 있나요?
회원작성글 gythakssmd..  |  08.27
Q. 농도 관련 질문드립니다.
산넘어 산이네요 ㅠㅠ  실험은 안되고 뭐가 문제인지 ㅠㅠ  이번에 생산한 단백질 농도 희석 질문 드립니다.  일단 실험하는 단백질의 mw은 9.97kg/L  로 알고 있습니다.   이번에 생산한 단백질의 농도는 0.611 mg/ml이고 생산량은 5.5ml로  총 3.359mg/ml 이되는데    이번에 6uM, 0.2uM 로 희석을 해야하는데 계산한게 맞는지 확인 부탁드립니다.  6uM 제조  3.359*1000/59.82(9.97*6)=56.15 배 1Mol/56.15=0.0178 1ml 기준 단백질 17.8ul    0.2uM 제조  3.359*1000/1.9994(9.97*2)=1680.0 배 1Mol/1680.0=0.00059 1ml 기준 단백질 0.5ul -6uM 로 제작한 단백질에서 33ul+ 1ml buffer    이게 맞는지 확인 부탁드립니다.   
회원작성글 mito59  |  08.25
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