galectin-1이라는 단백질을 transfection 시킨 후, single cell cloning을 거쳐 여러개의 clone을 얻어 gal-1 발현률을 비교해보고 있는데 house keeping 단백질이 계속 흔들립니다.   b-actin도 써보고 a-tublin도 써보는데,  둘다, gal-1이 많이 높게 발현되는 clone에서 그 발현양이 매우 낮습니다.   일단, QPCR로 확인을 하긴 할건데 이 clone들이 다른 유전자가 KO 된 것에 OE를 시킨 것이라 두 유전자의 영향이 있을 수는 있을 것 같긴한데 GAPDH를 써서 한 번 더 해봐야하나  고민 중입니다   comment를 부탁드립니다.

RAW 264.7 cell에 단백질로 p-p65등을 western blot으로 보려고 합니다. 근데 화면 지지직 거리는 그런 화면같이 나오거나 crop 밴드 형태만 나오고 band가 안나옵니다. 뭐가 문제인지 모르겠어요. 캐미닥을 쓰고 있고 blocking solution은 Ez blockchmi 쓰고 있고 transfer도 blocking과 같은 브랜드 제품 쓰고 있습니다 고수님들 도와주세요ㅠ 오늘안으로 알아야 되서요ㅠㅠ 급합니다

SDS-PAGE gel 만들때 뒤의 short plate는 철로 된것이고, 앞은 유리로 된거 사용하는데 강하게 나사로 고정하면 유리가 깨지고 약하게 고정하면 젤이 굳기전에 흘러서 만들기가 참 어렵네요. 유리판을 써야하는 이유가 있나요? 플라스틱판이나 아크릴판을 적정크기로 잘라서 유리판대신 사용해서 젤 런하면 안되나요? 플라스틱판은 원래 없는건가요? 감사합니다.

첨부한 사진처럼 b-actin은 그래도 membrane이 괜찮은데 나머지 ab들은 모두 il-10처럼 membrane이 어둡습니다. 1차 ab는 4도씨 12hr 이상 붙였고 그 후에 워싱 10분x3회 2nd ab 1hr 30min 워싱 10분x3회 그 후에 las 촬영했습니다. 대학원생때 이렇게 줄곧 해온 방법이라 왜 이러는지 모르겠습니다. 지금은 las 촬영때문에 ECL 처리 했던 것을 TBST에 넣어두고 있는데 워싱을 좀 더 하면 될까요? ㅠㅠ

Bio-rad 제품 semi-dry transfer 기계를 사용하는데, 저는 여기서 0.45 uM의 PVDF를 씁니다. 혹시 mini와 midi의 차이점이 정확히 뭔지 궁금합니다 ㅜㅜ  저는 midi로 걸었는데 아무 이상 없이 잘 사용해왔는데 mini로 transfer을 하는것이랑 차이점이 정확히 무엇인지 궁금합니다 

우선 gel은 4개 만들어놓으려고 하는데 러닝 기계는 한번에 4개가 돼서 가능하면 러닝 4개 하고  트랜스퍼를 2개씩 나눠서 하는 방법은 없을까요?  

1차 항체를 샀는데 reactivity가 human입니다. 그럼 mouse protein에는 아예 붙지 않는건가요?

안녕하세요 4학년 학부생입니다.. Western blot 실험 중인데 트랜스퍼 완료 후 워시까지 진행하였습니다.. 그런데..!!!! Skinmilk로 블락킹을 안하고 바로 1차 안티바디를 붙여서 상온에서 2시간 진행중에 있습니다… 그대로 진행해도 괜찮을까요..? 아니면 wash 하고 다시 블락킹 먼저 할까요..? ㅠㅠ

SDS-PAGE gel을 만들어 굳었는데 앞유리판 한쪽 모서리에 세로로 금이 갔습니다 샘플 로딩하는 well부분은 괜찮고 well옆 세로방향으로모서리에 금이 가버렸네요. 이 젤 샘플로딩해서  달려도 괜찮아요?

GST에서는 band가 검출되지 않고 actin에서만 band가 검출되었습니다. 아마 gst가 제대로 붙지 않았거나 단백질의 양이 많아서 그런거같은데 여기서 GST 쪽의 결과가 왜저렇게 어두운건가요? 또한 제가 생각한 이유 외에 GST가 검출되지 않은 이유가 있을까요?   시간내주셔서 감사합니다

제가 아직 공부 중인 편입생이라 너무 헷갈려서 질문 남겨봅니다.. 학교에서 western blot 실험을 진행했습니다. 근데 나온 결과를 보니 beta-actin band는 잘 나왔는데, GST band는 나오지 않았습니다. 제가 생각하기론 단백질과 bead가 binding이 되지 않았거나 2차 항체가 붙지 않아서 보이지 않는 걸까요..? GST band가 계속 나오지 않네요ㅠㅠ GST band가 나오게 하기 위해서는 어떻게 해야하는지 궁금합니다...실험 처음 과정에서 부터 문제가 있었던 것일까요?

WB sample 만드는 과정에서 cell을 harvest 하기 전 pbs 워싱 단계에서 질문 있습니다. lysis 하기 전에 한번 정도 워싱을 하는데, 이때 샘플마다 pbs를 1ml, 2ml 정도 다르게 넣고 워싱을 했는데 정량에 문제가 있을까요 ㅜ

안녕하세요. western blot을 배우기 시작한 대학원생 입니다. 이번에 western을 했는데, target protein과 너무 다른 size에서 밴드가 떠서 질문을 드리게 되었습니다. target protein의 분자량은 약 30kDa이고, primary antibody의 data sheet에도 32kDa라고 나와있습니다.  근데 western 결과를 확인해보니 약 70-80kDa 정도에서 밴드가 떴습니다. sample을 약 20개 정도 찍어봤는데 전부 해당 size에서 밴드가 확인됐습니다.  혹시 왜 이렇게 나오는지 설명해주실 수 있으실까요? 찾아보고 있고, 계속 찾아볼 예정이지만 혹시 도움을 받을 수 있을까 해서 여쭤봅니다.  감사합니다!

monoclonal 항체를 이용하여 cell(skeletal muscle cell), tissue(skeletal muscle) lysate를 이용해 웨스턴을 했는데, cell에서는 원래 사이즈가 맞게 나왔는데 tissue에서는 사이즈가 다르게 나오더라고요 이럴 수 있나요? whole membrane에 항체를 붙였고, 원래 사이즈가 150인데 tissue에서는 60 언저리 정도로 나왔습니다..

안녕하세요 선배님들ㅠㅠ western blot transfer 할 때 gel이 찢어졌는데 최대한 티 안나게 다시 붙여서 우선 transfer은 진행하였습니다ㅠ 이런 경우에 찢어진 부분이 티가 많이 날까요... 저와 같은 경험이 있으신 분들은 알려주세요..ㅠㅠ!

안녕하세요  단백질 전기영동 실험을 진행하고 있는데,  계속 밴드 끌림 현상이 생기고 있고 ㅠㅠ 여러 troubleshooting을 진행해보았으나 소용이 없어서 western blot 고수님들의 조언을 구하고자 합니다.    실험 조건은 다음과 같습니다.  1. C57BL/6 마우스 대장 조직 homogenate(상등액) 2. lane당 단백질 20 ug  3. Homogenate 샘플을 SDS loading buffer와 섞은 후 100도에서 15분 가열  4. lane당 샘플 10 ul씩 로딩  5. 전기영동 조건 200 V, 35분  6. Gel: bio-rad  Mini-PROTEAN TGX gels (10%)    Running buffer도 늘 새로 만들어서 충분한 양을 넣어서 실험하고 있고,  Gel 밑의 테이프도 잘 떼어서 사용하고 있습니다.    사진도 첨부하였으니  조건과 결과에서 제가 혹시 놓치고 있는 부분이 있는지 코멘트해주시면 정말 감사하겠습니다!! 

초보 실험실생입니다. 이번 WB 실험을 하면서 p65 항체를 phospholylation/total을 봐야해서 항체를 알아보고 있는데, polyclonal로 찾고 있습니다. sample은 mouse입니다 인산화 부위가 다른게 많던데 어떤 항체를 봐야하는지와 이유까지 알려주시면 감사하겠습니다.

Lysis buffer로 cell을 lysis 한 후 4도씨 냉장고에 10-30분 정도 둔 다음,  13000rpm, 10분에서 centrifuge를 한 후 sup만 따서 새로운 e-tube에 놔둡니다. 실험이 추후에 진행할 시 냉동고에 얼린 후  다시 녹여서 vortex를 진행하는데, vortex 한 후 spin down을 해도 거품은 사라지지 않았습니다.  혹시 거품을 최소화하고 정확하게 정량 하는 방법이 있을까요 ㅜ 

tnf-a를 보고있고 데이터 시트가 항체를 5% bsa에 희석하여 사용하길 권장하여 1:1000으로 사용 중에있습니다. 회사는 셀시그널링입니다!   항체를 skim에 사용했더니 시그널이 아예 뜨지 않아 bsa를 사용하고있고 그러니 잘 뜨긴했습니다.(왼쪽이 현재 상황, 오른쪽이 잘뜨던 날,,입니다.)   그런데,, 딱 한번만 잘뜨고 그 이후로는 밴드가 저렇게 백그라운드를 미친듯이 타면서 밴드는 연하게 뜹니다. 디벨롭을 조금만하면 아예 저것 조차 뜨질 않구요. 아주 강하게 하면 멤브레인을 태우면서 겨우 저정도 밴드가 보입니다..   블락킹은  프로토콜대로 스킴밀크에서 2시간 수행했고, 안티바디 1차는 bsa 1:1000 오버나잇 2차는 bsa로 1:4000을 붙이고 워시를 10분간 5번 수행했습니다.. 대체 뭐가 문젤까요,, ㅜㅜ 갑자기 왜 저렇게 백그라운드를 타면서 밴드는 연하게 나오는 걸까요,, 3일쨉니다. 같은 문제가,, 현재 스트리핑 중에있습니다. 새로 붙여보려구요,,   

안녕하세요   엑소좀 관련 연구를 준비하고 있는 석사 2학기생 입니다!!   슬슬 졸업 논문이 될 동물실험을 계획하고 있습니다. 이제 본 실험을 들어가면 웨스턴을 통해 exosome marker 확인도 해야하고, 또한 특정 조직 유래 exosome 마커를 활용한 2 step Exosome isolation 을 진행중인 만큼 해당 마커도 확인하기 위해 웨스턴을 필수적으로 연마해야 합니다. 하지만 현재 웨스턴 블롯이 아주 미숙한 상태라 많은 연습이 필요합니다. 2step exosome isolation 프로토콜 확인 및 웨스턴 연습을 위해 cell culture를 통해서 exosome을 취득하고 있는데, 문득 너무 비효율적이라는 생각이 들었습니다. 특히 오늘 ,, protein 정량을 위해 BCA assay를 진행했는데,,, 어디선가 날려먹었는지 cell culture 부터, 처음부터 다시 해야할 수도 있다는 생각에 이런 생각이 더욱 강렬하게 들더라구요,,,, cell culture medium을 통해 exosome을 취득하려면 그 양 자체가 적어서 많은 양을 키웁니다.(150mm x10, 이렇게 나온 exosome을 다 합쳐야 웨스턴 할만한 양이 나오더라구요 ,,) 또한 조직별로 구분하는 만큼, 조직의 수 만큼 더 많아지구요,,, 2~3조직으로 하면 150mm 30판,, 연구실이 작고 다들 바빠서 혼자 합니다 물론 혼자 하는게 당연한거긴 한데,, 그래서 그냥 제 소변을 이용하면 어떨까라는 생각이 문득 들었습니다.. exosome isolation 키트, 안티바디 모두 호환이 되서 당장 실현은 가능합니다만 너무 미친사람이 되어가는게 아닌가 우려가 되어서,, 혹시 저같이 본인의 혈액, 소변 등을 이용해서 파일럿 혹은 연습 실험하는 사람이 있는지 궁금해서 글 올리게 되었습니다... 아 물론 제 몸에 케미컬 인젝션은 안합니다,,,