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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. western blot SDS gel
안녕하세요. western blot을 하는 석사생입니다. gel을 만들어서 사용하고 있는데 running gel과 stacking gel 사이에서 버블이 만들어집니다.  comb를 뽑으면서 젤 사이가 벌어지곤 하는데 왜이런 현상이 나타나는건지 알 수 있을까요? 두 젤은 충분히 굳고나서 사용하며, running젤 먼저 분주 후 isopropanol로 수평을 맞추고 난 뒤에 gel이 굳으면 isopropanol을 제거합니다. 그 뒤에 증류수로 한번 더 wash하구요,,   비슷한 경험 있으신분이 계시다면 조언 부탁드립니다.
회원작성글 rlaeheod  |  08.10
Q. WB 관련
안녕하세요 WB 고수님들께 의견을 묻고자 남깁니다. 최근 gel을 내리는 과정에서 가운데 있는 Marker가  보이는 것 (1번) 처럼 쓸려(? 이 표현이 맞는지...) 내려가는 듯하게 눈으로 보이고 그렇다 보니 transfer 해도 그대로 옮겨지고  실제 detection 을 해보면 2번 그림처럼 되더라구요. 왜 그러는지 혹시 아시는 고수님님 알려주세요. 그렇게다 모든 가운데 marker가 다 그런거 또 아니더라구요. 같은날 내린 gel 에서 다른 gel은 그렇게 안 되기도 해서... 1. 2. 
회원작성글 학생  |  08.10
Q. western blot 을 stripping buffer 마커사라짐
westen blot 실험 진행중인데 항체를떼어내려고 stripping 버퍼에 워시를 진행했는데 스트리핑 처리를 길게 했더니 마커와 단백질이 날아가서 사라져서요ㅠㅠㅠ 스트리핑버퍼가 조성이 너무쎈 경우 이런현상이 나타나기도 하나요?
회원작성글 리코  |  08.10
Q. Western Bolt 항체 희석
Western Bolt 실험 하는데 1차 항체랑 2차 항체 희석해야하는데, 1차 항체는 베타액틴으로 1:1000 2차 항체는 1:5000 으로 희석하라는데 몇으로 넣고 희석해야하는지 계산법 과 같이 알려주세용 ... 몇대 몇으로 희석하라는 방법만 봐도 머리가 너무 복잡해요  ㅠ ㅠ
회원작성글 와라랄랄  |  08.09
Q. western blot 1차 antibody incubation 시간
웨스턴할때 1차 안티를 저희 실험실은 4도에서 16시간을 인큐베이션합니다. 만약 20시간을 인큐베이션을 하게 되면 어떻게되나요? 결과에 많은 영향을 주게되나요? 
회원작성글 oneday  |  08.09
Q. 같은 membrane으로 다른 antibody 붙일때 washing 시간
선배님께서 웨스턴을 두번 돌리기 싫을때 먼저 phospho-p70 antibody를 붙이고 결과를 본뒤 phospho-p70 antibody 붙인 membrane에 milk로 blocking하고 total-erk1/2 antibody를 붙이면 된다고 하시는데 아무래도 detection을 위해서 sustrate를 분주하다보니 washing을 잘해야될거 같은데 저희는 보통 washing할때 10분씩 3반복을 해주는데 이렇게만 해도 sustrate가 완전히 washing이 될까요? 1시간은 해주어야되나요?  
회원작성글 oneday  |  08.05
Q. 웨스턴 결과가 none이 이상합니다. 첨부파일
웨스턴을 하였는데  1. a+b처리 2. a라는 처리 3. b라는 처리 4. none 순서대로 하였습니다. phospho-s6 antibody를 붙였는데 none은 당연히 처리가 안되있어서 연해야하는데 제일 진하게 나왔습니다. 제 기억으로는 위에 언급한 순서대로 하였는데 1번과 4번이 바뀐걸까요? 결과만 보면 4번이 none인데.... 처음에 protein 뽑을때 제가 tube를 바꿔 담은건지 ㅜㅜ  현재 다시 protein을 뽑는게 가장 베스트이지만 시간도 없고 treatment가 부족해서 다시할 여건이 되지 않습니다. 저의 실수이지만 도와주세요.ㅜㅜ
회원작성글 oneday  |  08.05
Q. 웨스턴 결과 질문이요
웨스턴 결과를 오늘 찍었는데 결과 사진이 밴드가 아예 안 나오고 그냥 검은색으로만 나오는데 이건 뭐 때문에 그런건가요ㅜㅜ    제가 2차를 붙이고 워싱을 원래 10분 3회 하는데 이번엔 까먹고 워싱을 shaker위에 두시간 가량 냅두고 책상 위에 한시간 가량 냅둔 후에 사진을 찍었는데요! 혹시 워싱이 잘 안되면 밴드가 아예 안 보이기도 하나요? 아니면 그 전 과정들이 문제 인가요ㅜㅜ?    진짜 말 그대로 그냥 까매요 아무것도 안 보여요ㅜㅜ gapdh도, target protein도 ,,, 한 membrane에서 잘라서 두개로 나눠서 보는데 안 나와서 당황스러워요.. 웨스턴 하고 transfer 할 땐 마커가 다 넘어가서 transfer까진 문제가 없는 거 같은데ㅜㅜ
회원작성글 열두시삼십분  |  08.05
Q. 웨스턴에서 p-AKT와 AKT 안티바디 찍어보신분 (같은 size에서 뜨는 band detection하는법)
제목 그대로, p-AKT와 AKT를 디텍션하려고 하는데, 둘 다 60 kDa에서 뜨는 안티바디라서요. 첨엔 두 gel을 만들어서 각각 찍고 정량을 해봤는데 같은 샘플이어도 gel마다 크리티컬하진 않아도 좀 차이가 있길래 혹 같은 gel에서 찍어야 할까요? 하나 먼저 찍고 washing 후 같은 membrane으로 다음 안티바디 붙여서 찍는걸 추천하시나여? 아님 그냥 각각 다른 gel에서 찍고 정량해도 큰 문제 없을까요? (+)덧붙여, 각각 다른 gel에서 찍었을경우 p-AKT, AKT를 각각의 gel에서 뜬 b-actin으로 정량한 후 그 값을 p-AKT/AKT로 계산하나요, 아니면 p-AKT, AKT 각각의 밴드만 image J로 정량한 후 그 값을 바로 p-AKT/AKT ratio 값으로 계산하시나요?
회원작성글 experiment  |  08.05
Q. beta actin band로 정량해서 protein 용량을 늘려서 western blot 하는 방법도 있나요?
제목 그대로 membrane에 뜬 beta actin band를 image J 같은걸로 정량해서 다시 western blot용 protein sample 제조 할때 protein 갚을 늘리는 방법이 있을까요? rat brain을 일부 잘라서 protein을 추출하여 standard curve로 protein 정량 했었는데 beta actin band의 크기가 일정하지 않더라구요. 교수님께서 샘플의 크기가 일정하게 똑같지 않아서 이런 결과가 나온거 같다며 beta actin band로 정량해서 protein 용량을 늘려보라는데 제가 이렇게 해본적이 없어서 문의 합니다... 방법 아시는 분 답변 부탁드려요!!
회원작성글 스텔라  |  08.05
Q. Westernblot band 안뜸과 non specific.. 첨부파일
안녕하세요. Westernblot 은 많이 해뵜다고 자신하던 연구자인데... 또 이렇게 벽에 부딫히네요 ㅠㅠ Tubulin 은 너무 선명하게 잘 뜨구요. Ponseau S 시 확인했을때 transfer 나 running 도 문제없다고 생각합니다. 그런데 target 항체에서 band 가 너무 지저분하게 잡히네요.... 5% BSA blocking 1hr RT 진행했고, Ab 도 같은 solution으로 진행했습니다. 2차는 3% BSA 로 1:3000 진행했는데... 2차가 너무 쎗을까요? 다른 연구원이 skimmilk 로 굉장히 데이터가 잘 나왔다고 해서 skim 을 썻는데 오히려 더 지저분 하네요 ㅠㅠ 더 바꿔볼 컨디션이 있을까요? 2차를 약하게 붙히면 깨끗해 질지.... 도와주세요 고수님들 ....😭 그냥 안티바디가 거지같은걸까요....?
회원작성글 써니22  |  08.04
Q. transfer가 일부가 잘 되지 않습니다.
western blot 과정중 항상 transfer한 후 겔을 coomassie에 넣어 transfer이 잘 되었는지 확인을 하는데요. transfer는 transfer buffer을 가득넣어주고 100V, 0.4A, 1시간30분동안 하면서 통주변에 얼음으로 감싸고 20~30분마다 ice pack도 갈아주고 최대한 안따뜻해지게 해주면서 하는데요.   transfer후에 겔을 확인하면 55kDa 정도 위로는 단백질이 남아있습니다. 다행이 저희가 확인하고자하는 단백질은 30~40kDa이지만 완벽하게 transfer가 되지 않는것에 의문이 되는데요. 매번할때마다 이러니 답답합니다. 최대한 nitro cellulose 덮고 whitepaper두장덮고 기포를 빼주기위해서 스크래퍼로 살살 누르고 최대한 밀착되게 마지막에 black, clear plastic으로 꽉 잡아서 transfer을 해줍니다. 머가 문제일까요?ㅜㅜ 도와주세요.
회원작성글 oneday  |  08.03
Q. [westernblot] Cleaved caspase-3 안티바디 디텍션 안되는 이유
안녕하세요. Western blot 실험에서 apoptosis 억제 관련 인자인 caspase를 확인하려고 하는데 35kDa에서 full length caspase-3는 잘 확인이 되는데 17kDa에서 cleaved caspase-3가 안뜹니다. 혹 이유를 아시는 분들 계실까요? 해당 antibody로 실험을 해보셨거나 하고 계신 분들 있으시면 조언 부탁드립니다. 일단 저는 cell signalling(#9662) 이 제품을 사용하고 있고, western 실험 조건은 10% gel에서 일반적인 로딩, wet 트렌스퍼 조건 따르고 있습니다.   +) 덧붙여, 혹 cleaved 형태는 발현되지 않고 caspase-3만 발현되면 apotosis를 억제한다고 보기는 힘든거겠죠? cleaved된 형태 없이 caspase-3 단독으로만 결과를 제시한 논문은 못본듯하여 질문드립니다. 
회원작성글 experiment  |  08.03
Q. westernblot 결과가 계속 달라집니다
웨스턴블롯을 하는데 베타액틴은 비슷하게 나와도 나머지 단백질들이 할때마다 양상이 조금씩 다르게 나옵니다. 이런경우는 해결할 방법이 있을까요?
회원작성글 AGCT  |  08.02
Q. western blot image J 정량
안녕하세요. Western blot을 통해서 MAPK(ERK1/2, P38, JNK1/2)를 보고 있습니다. 다름이 아니라 ERK1/2나 JNK1/2같은 경우 2개의 밴드로 나오는 Antibody를 가지고 실험을 하고 있는데에 있어서, Image J로 정량을 하는데에 고민이 있습니다. 2가지 밴드를 한꺼번에 잡아서 정량을 해야하는 것인지, 아니면 1개의 밴드(EX  : JNK1, JNK2 따로 ERK1, ERK2 따로) 잡고 값을 더한 후(JNK1+JNK2, ERK1+ERK2) 정량해야 하는 것인지 궁금합니다.. 특히 JNK 같은 경우는 잡밴드가 심해서(JNK2와 JNK1 사이에 밴드가 나옵니다) 어떻게 정량을 해야할지 잘 모르겠습니다.. 도와주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 HT22  |  08.02
Q. Western Blot 시 Ponceat Staining 정량
안녕하세요! Western Blot 실험중인 대학원생입니다. 이번에 처음으로 Ponceau Staining  정량을 하게되었는데 어려워서 질문 올려요!  저희가 지금 하고있는 방법은 프린터 스캔과 휴대폰 촬영 후 Image J 프로그램을 이용해서 정량하는데 손을 많이 타는 것 같고 정량값이 일정하지가 않는 문제가 있습니다. 정확한 다른 방법 있으시면 알려주세요,,,!!부탁드립니다!    
회원작성글 으논  |  08.02
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