PI3K의 downstream에 있는 PIP2, PIP3를 western blot으로 검출하고 싶습니다. lipid 계열이라 항체가 있을지 모르겠는데.. 검색해보면 나오긴 하는데.. 온통 human 용으로만 나오고, mouse는 없네요ㅜㅜ 혹시 마우스 샘플에서 PIP3를 웨스턴 블랏으로 검출으로 검출할 수 있는 항체를 아시는 분 계신다면, 알려주시면 감사드리겠습니다.

  위 논문에서 사용한 binding buffer의 조성은 methods에 나와있지 않아서 여쭤 봅니다   비슷한 실험을 진행하실 때  어떤 binding buffer를 사용 하시나요?

HaCaT Cell에서 c-Jun 발현 양상을 살펴본 웨스턴 결과입니다. 이렇게 주변부분이 다 한줄처럼 보이는 양상으로 나옵니다. 이런 현상이 전기영동시 갤이 터져서 단백질이 새어나오는 것이 원인일 수 있다는 글을 봤는데, 이 멤브레인을 스트리핑 해서 다른 팩터를 찍으면 또 잘 분리돼서 정상적으로 나옵니다. 1차 항체를 새로 희석해서 써봤는데도 이렇게만 나오면 1차항체 제품이 오래되거나 상태가 이상해진게 맞는걸까요? 항체가 워낙 비싸다보니 이거 하나 다시 찍자고 다시 사기도 참 애매하구 ㅎㅎ... 혹시 제가 잘못한 부분이 있다면 원인이나 점검해야할 점을 아시는 분 계실까요?

안녕하세요! 요새 웨스턴 연습 하고 있는 대학원생입니다.   바로 본론으로 들어가겠습니다. 저희 실험실은 웨스턴 전기영동 내릴 때 protein marker를 따로 만들어서 사용하는데 어떻게 만드는 지 잘 모르겠습니다 ㅜㅜ 혹시 다른 분들은 어떻게 사용 하시나요?!    4x랑 1x 중에 뭐로 희석을 해야하는지 잘 모르겠습니다.. 친절히 알려주시면 감사하겠습니다 ㅜㅜ

안녕하세요 실험실에서 웨스턴 블랏 실험을 처음 셋팅하여 실험을 진행하고 있습니다. 근육 조직(qudriceps)을 이용하여 웨스턴 실험을 하고 있는데 밴드가 뜨지 않아서 조언을 구하고자 글을 올려봅니다. 근육 조직 100 mg + Ripa 1ml을 첨가하여 homogenizer로 파쇄한 뒤 15초간 3회 sonication 이후 4도씨 1시간동안 shaker에 incubation을 진행하였습니다. 그 이후에 centrifuge 12000 rpm에 15분하여 상등액을 취한 뒤, 상등액을 단백질 정량하여 5x dye solution을 첨가하여 5분간 끓인 후 10분간 ice에 보관하여 sampling을 진행하였습니다. 웨스턴은 일반적으로 진행하는 데로 진행하였는데 단백질양은 50ug에 맞추어 로딩하였고 70v 5분, 80v로 진행했습니다. transfer는 100v 120분으로 진행했습니다. 웨스턴 실험의 문제는 아니라고 판단되는게 GAPDH는 잘 잡힙니다. 그런데 PGC 1a와 SIRT1 등과 같은 하위 단계의 marker들이 나오지 않습니다. antibody에 맞는 위치(파란색칸)에서 나오는게 아니라 다른 위치에서 나옵니다. 웨스턴 고수님들의 조언이 필요합니다. 제발 도와주세요ㅠㅠ

논문을 서치하다가 궁금한 점이 생겨 질문을 올립니다 ㅜㅜ    논문에서 쓰여졌던 특정 항체의 data sheet에 들어가보니  predicted size : 22 kda  observed size : 22, 50 kda 라고 쓰여져 있었습니다.    그런데, 논문에서는 그 항체의 siRNA를 처리하여 발현을 보았을 때 22 kda의 band만 실려져 있었습니다.  22 kda 사이즈에서만 knock down이 되어도 되는 것인가요?   

다른 %의 Gel을 하나의 transfer 기계를 써서 하면 안 되는 이유가 따로 있을까요?? Gel 두께가 1mm, 0.75mm로 달라도 같은 %이면 같은 transfer 기계를 사용하는데, 오히려 두께가 다를 때 다른 transfer 기계를 사용해야하는 게 아닌가요? Transfer는 semi-dry 방식으로 하고 있습니다. 이유가 궁금합니다!

안녕하세요.  western 때문에 머리가 아픈 석사생입니다..   제가 western transfer가 계속 잘못되어서(우글우글하게 밴드가 나타남) 열 발생 문제로 생각해서 semi dry transfer로 진행했습니다. 이번에 semi dry transfer로 1hr, 15V로 진행했는데 다름이 아니라 3m paper에 ladder가 전달되어있네요. 3M paper에 ladder가 다 옮겨진 상태라고 해야하나요? membrane에도 ladder가 있긴합니다. 140kDa이라서 좀 길게 transfer를 했는데요, 짧게 진행해도 될까요? western transfer 고수님들 조언 부탁드립니다.!! 1) tank transfer할 때 나타나는 우글우글한 밴드는.. 도대체 왜그럴까요? 2개 샌드위치를 같이 진행해도 어떤건 잘 나오고 어떤건 우글우글합니다. 온도때문인가 싶어서 온도 조절도 탱크 안에도 콜드탱크 하나넣고, 탱크 바깥으로도 아이스를 덮어놓습니다..ㅠ_ㅠ 도대체 무엇이 문제일까요? 2) semi dry transfer를 할 시에는 몇 볼트조건으로 얼마나 진행하시는지 궁금합니다 !!   감사합니다!

갑자기 의문점이 생겨 질문을 드립니다 ㅠㅠ SDS page에서 단백질을 전기영동하는데 붉은색은 붉은색에, 검은색은 검은색에 꽂는 것을 반대로 하게 되면 로딩 시, 샘플이 위로 올라갈까요? 

담배에 아그로박테이리아를 이용해 co-IP를 진행할려고 합니다.   우선 protein이 제대로 웨스턴이 되는지 확인하기 위해서 예비 웨스턴을 해봤는데   저희가 사용하는 tag는 YFP와 FLAG입니다.   궁금한것은 3가지 조합으로 해봐는데  YFP Ab에서는 1, 2번만 검출되고 반대로 FLAG Ab에서는 3번만 검출된다는 것입니다.   혹시 이런 경우 어떻게 해야 해결할 수 있을까요?   1. YFP 2. YFP + GENE-FLAG 3. GENE-YFP +GENE-FLAG

안녕하세요.   천연물을 이용하여 실험을 하고있는 대학원생입니다.   기존에 사용하던 항체를 다 소비하여 동일한 항체를 구매하였습니다.   항체 정보는 AB5832이고, 1mg/mL, 100ug으로 표기되어있습니다. https://www.merckmillipore.com/KR/ko/product/Anti-BACE-Antibody,MM_NF-AB5832 위의 사이트에 자세하게 나와있습니다.   제가 사용하는 프로토콜은 1000:1로 희석하여 사용하고 있으며 PBS 10mL + 항체 10 uL 로 사용하고 있습니다.   제가 궁금한 것은 100ug이면 100uL가 들어있어서 적어도 9~10번을 사용할수 있어야 하는데 2~3번 사용하면 없는것처럼 보입니다.    이런경우에는 어떻게 생각하면 좋을까요?   감사합니다.

안녕하세요, cell supernatant에 분비되는 단백질을 western blot으로 보려고 합니다. 농축한 후 보려고 하고있지만, 그 전에 우선 cell supernatant를 조금 취하여 gel에 내려보려고 합니다.   아래대로 진행하면 될까요?   1. cell supernatant를 취한 후 centrifuge를 돌린 후 상층액을 취한다. (debris, 죽은 cell 제거) 2. heat-denaturation한다.(95'C, 5분) 3. supernatant와 6x loading dye를 섞은 후 gel에 loading한다.   더 필요한 step이나 수정해야할 부분이 있으면 알려주시면 감사하겠습니다!

안녕하세요 웨스턴블롯 실험 진행중에 데이터가 이해가 안되서 질문드립니다! 현재 저는 B16F10 셀을 이용하여 미백관련 protein의 발현을 확인하고 있습니다. 대략적인 조건은 셀 시딩 후 24 시간 뒤에 배지교체후 샘플 처리를 해줍니다. 그런데 이때 Control을 제외한 나머지 셀의 배지에는 a-MSH를 추가해줘서 흑화를 유도해줍니다. 그리고 48시간 뒤에 라이시스 하여 단백질의 발현을 확인하였습니다. 셀 라이시스하였을 때는 control과 a-msh첨가 배지를 넣은 셀이 저렇게 색 차이가 확연했는데, 웨스턴을 찍었을 땐 맨왼쪽과 그 바로 오른쪽 라인간에 차이가 나타나지 않습니다. 논문을 찾아보니 굳이 a-msh처리 안하고 실험에 들어가있는 논문도 있던데 a-msh 처리한게 문제가 된것일까요?  혹시 비슷한 사례가 있었던 분들은 해결을 어떻게 하셨는지요? 조언 부탁드립니다!!    

보통 6 well에 seeding 한 cell에 drug를 24시간 treat하고 난 뒤, western blot sample을 준비합니다.  (1). 죽은 cell까지 harvest하기 위해, media를 suction하지 않고 media는 걷어서 1.5 ml tube에 모읍니다. (2). 10000 rpm에서 30 sec - 1 min 동안 centrifuge를 하여 pellet이 만들어 지도록 합니다.   (3). media를 suction한 후, cell pellet을 ice에 박아둔 뒤  (4). 6 well에 부착되어 있는 cell에 lysis buffer을 넣어서 lysis 되도록 놔둔 후, 스크래퍼로 cell을 긁습니다. 그리고 (3)번 cell pellet에 함께 넣어 cell이 잘 lysis 되도록 피펫팅을 여러번 합니다.  (5). 4도씨 냉장고에 10분간 넣어두거나 ice에 박아둔 상태로 30분간 놔둡니다. (6). 12000 rpm ( 또는 13000 rpm )에서 10분 또는 15분 동안 centrifuge를 한 후 pellet이 생기도록 합니다.  (7). pellet은 건드리지 않고 최대한 상층액을 따서 새로운 e-tube에 모아둔다.  (8). 오늘 단백질 정량을 할 예정이면 냉장고에 두고 나중에 할 예정이면 -80도에 보관해둡니다.    혹시 여기서 보완해야 할 점이 있을까요? 

NSCLC에 chemical을 처리하여 WB으로 signal을 보는 실험을 하고 있습니다. chemical 처리할 때 srum free media로 바꿔주는게 일반적인가요? 

western blot으로 p16을 확인하려고 했으나 밴드가 아예 뜨지 않았습니다. bv-2 cell 에서 처리를 하여 cell lysate를 얻었고 이걸로 western blot을 진행하였습니다.  제가 항체를 cell signaling의 p16 INK4A (D3W8G) Rabbit mAb #92803 를 사용하였는데요   1 antibody를 mouse로 사용하지 않고 rabbit 으로 사용한 것이 영향을 미칠 수 있나요?  2 bv 2 cell 에서 p 16을 확인한 논문이 있어서 발현이 되는게 맞는데 무엇이 문제일까요  3 밴드가 아예 뜨지 않고 하얀색입니다.. beta actin 은 뜨는데 왜그럴까요 ? ㅠㅠ