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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
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Q. HPLC retention time 및 wavelength 관련 질문
HPLC 관련 실험을 진행하고 있는 연구원 입니다. 관련 공부를 할려고 논문을 보다보니 식물 추출물 관련해서 두가지 다른 물질이 같은 retention time 을 가지고 다른 wavelength를 가집니다. 논문에서는 retention time과 wavelength를 기반으로 분류하였다고 되어 있는데 같은 부서의 연구원 분이 이 부분이 이상하다고 합니다. wavelength의 차이는 피크의 크기 차이만 생길 뿐이지 wavelength차이로는 다른 물질의 구분이 안되고 다른 물질의 구분은 retention time 만으로 한다고 합니다.  그리고 연구원 분의 말씀이 맞다면 retention time이 같은데 어떻게 다른 물질로 판단하는 기준이 뭔지 궁금합니다.  앞선 실험을 하셨던 여러 선배님들의 조언을 구합니다. 
회원작성글 막5  |  08.08
Q. GST-fusion protein에 관한 질문입니다.
GST를 붙이지 않은 단백질이 70kDa이고 GST를 붙였을때 96kDa라 한다면 GST-fusion protein을 SDS PAGE를 했을때 96kDa가 나오는게 맞는건가요?  GEL에는 96kDa가 아닌 70kDa가 나와서 헷갈리네요.. SDS PAGE를 하면서 GST tag가 떨어져 나올 수가 있나요? 아니면 다른 이유가 있을까요?  
회원작성글 바켐  |  06.17
Q. GST-pulldown 결과 질문입니다
안녕하세요 제가 이번에 학부 실험으로 단백질과의 결합을 실험하기 위해 GST-Pulldown assay를하고 SDS-PAGE를 했는데 결과 분석을 하는데에 있어서 헷갈리는게 있어서 질문 드립니다.  45kDa의 단백질1과 96kDa의 단백질2가 결합을 했다면, gel에 나오는 밴드는 두 단백질의 mass를 합한 141이 되어야하는건가요?  그게 아니라면 두 단백질이 결합을 했다는 사실은 어떻게 알 수 있는건가요?
회원작성글 바켐  |  06.17
Q. MG132 희석할때 결정생기는 현상
안녕하세요 RIPA Lysis buffer를 만들때 저희 랩에 aliqout되어있는 MG132 50mM를 10mM로 희석해서 사용하고 있습니다. 희석할때 열이 발생하면서 흰 결정이 많이 생기는데 결정이 생긴채로  Lysis buffer를 만들어도 되는지 궁금합니다.   아니면 lysis buffer를 만들기 전날정도에 미리 희석해서 두면 결정이 좀 녹을까요..?
회원작성글 뭉치쭈꾸  |  06.09
Q. IP 할 때 A/G BEAD 섞어서 쓰시나요 밑에 가라앉은 거만 쓰시나요?
냉장고에 보관해놓으면 두 층으로 분리되던데 섞어서 쓰시나요 밑에 가라앉은 거만 쓰시나요?  
회원작성글 리처드빱킨스  |  06.03
Q. in vitro pull-down assay 시 preclearing 필요성
purified protein 을 이용하여 IP 를 통한 in vitro pull-down assay 를 진행하고 있습니다. 여기서 cell lysate 를 이용한 IP 실험의 경우 preclearing 단계를 거쳐 non-specific binding protein 을 걸러내는 과정이 필요함은 알고 있는데요,   purified protein 을 사용하는 in vitro IP 를 진행할 때에도 prey protein 을 preclearing 후 이용해야하는지 궁금합니다.
회원작성글 움가  |  06.02
Q. bradford 단백질농도 ppm 질문드립니다.
이번에 bradford 실험을 했는데 흡광도는 562 / y= 0.503x + 0.115  BSA STD(mg/ml) 샘플은 희석하지 않고 10ul 넣었습니다  OD 0 = 0.1006667 0.25 = 0.2396667 0.5 = 0.386 1 =0.6256667 2= 1.1156667 샘플의 OD는 0.3027이 나왔습니다.  단백질 농도 ppm을 구하라고 하는데 어떻게 계산하는지 잘 모르겠네요.
회원작성글 1234578791..  |  06.01
Q. Western blot and IP
brain의 약물 효과를 보기 위해서 brain slice culture를 진행후 western blot을 진행중입니다. western blot으로 T-trkB IP로는 p-trkB를 보는데 결과가 잘 나오지 않아서요.. 혹시 다른분들은 어떻게 진행하시는지 알려주시면 감사하겠습니다.   
회원작성글 soosie  |  05.26
Q. E3 ubiquitin ligase에 의한 단백질 사이즈?
제목처럼 E3 ubiquitin ligase에 의해 단백질의 ubiquitination이 일어나면 size 변화가 어떤지요? Target 단백질로 IP 후 ubiquitin으로 western blot을 했을 때, E3 ubiquitination 된 정확한 사이즈를 어떻게 확인하는 지  알 수 있을까요? ubiquitination된 양에 따라 protein size가 달라진다고 봤는데, 그 중 E3 ligase에 의한 ubiquitination을 정확히 구분할 수 있나요?     
회원작성글 rkaehddldi  |  03.29
Q. silver staining 관련 질문 첨부파일
안녕하세요 silver staining 관련하여 질문 드립니다. SDS-PAGE한 gel을 coomassie blue staining, 탈색 후 DW로 wash하고 silver staining을 진행하는데 염색이 부분적으로 됩니다. 다시 silver staining buffer도 새로만들고 buffer양도 충분히 부어도 계속 한쪽만 염색됩니다.  buffer가 문제인지 제 실험방법이 문제인지 모르겠습니다. ㅠㅠ  답변부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 한자7080  |  02.21
Q. GST tag 활성에 관해
  안녕하세요, 단백질을 정제할 때 GST tag가 적절할지 고민중인 학생입니다. GST는 서로 붙는 성질이 있고 원래 dimer로 효소 활성을 나타낸다는 말을 언뜻 들은 것 같은데, 그렇다면 GST-protein인 fusion protein monomer 상태에서는 아예 GSH에 결합하지 않게 될까요? 읽어주셔서 감사합니다!
회원작성글 미틈틈  |  01.27
Q. bacterial cell lysis 후 IP 실험 방법
  현재 ha tag 와 GST tag 가 각각 달린 2가지 protein (ex, A protein - his tag ,, B protein - GST tag) 의 interaction 을 확인하기 위해서 ip 실험을 계획하고 있습니다. 그래서 bacteria cell 에서 각 단백질을 키운 후 cell 수확을 하고, lysis 를 진행하면 각 단백질이 발현되어 있는 2가지 lysis sample을 획득 하게 됩니다. 그런데 ip 실험을 찾아보니, 이미 protein 들이 binding 되어 있는 lysis 를 이용해서 antibody를 처리하고, bead를 처리하는 것 같던데, 그럼 그냥 각 각 protein lysis 를 섞어서 해주면 되는 걸까요? 혹시 mammalian cell 에서는 다들 어떻게 진행했는지 궁금합니다. 또한 발현이 잘 되었는지 확인하기 위해 input 도 wb할 때 내리라고 하셨는데, cell lysis 한걸 그냥 wb 하면되는건가요?  
회원작성글 실험실학생  |  01.05
Q. Omni-probe antibody는 어떤 항체 인가요?
논문을 읽다가 실험적인 부분에 궁금한점이 생겨서 여쭤봅니다. 한 세포에 세가지 유전자를 co-transfection하기 위해 각각 Flag, Ha 및 His로 tagging한 후, immuniprecipitation을 통해 anti-HA와 Omni antibody 등으로 여러 imunoprecipitate를 얻었습니다. 이후에 웨스턴 블랏을 통해 이미지화해서 확인하였는데요. 여기서 Omni antibody의 역할이 His-tagged protein을 검출하기 위한 항체인지 궁금합니다. 논문 맥락상 이게 맞는것 같은데, 구글링을 해봐도 명확히 안나오네요ㅠ 이 항체에 대해 아시는분 계시면 알려주실 간곡히 부탁드립니다!
회원작성글 대학원생인가노예인가  |  2021.12.21
Q. DNA의 seq만 알때 DNA와 binding하는 protein을 찾는 실험이 있나요?
ChIP assay로 protein과 붙은 DNA를 찾을때는 protein의 Antibody가 필요한데, 반대로 DNA sequence를 알때 여기에 binding하는 protein을 알아내는 실험은 뭐가 있나요? 예를 들어 promoter로 예상되는 부분이 있고 어떤 모르는 Transcription factor가 붙었을때 이 protein이 뭔지 어떻게 알 수 있나요?
회원작성글 범범범  |  2021.12.01
Q. DNase 활성 및 이용가능 buffer 문의
안녕하세요. 이번에 biotinyltaed DNA (vector/ pcr product)를 이용해 biotinylated DNA를 streptavidin으로 pull-down 후 해당 dna에 binding한 protein을 Western blot으로 검증하는 실험을 수행중에 있습니다. https://academic.oup.com/nar/article/47/19/10235/5565289 위 링크 논문의 method를 참고하여 진행하고 있는데 sample boiling 직전에 DNase를 처리하는 step이 존재합니다.   그런데 DNase를 어떤 buffer 조성에서 처리를 하여야할지 모르겠어서 질문을 드립니다.   NP40또는 RIPA 등의 elution buffer에서 DNase 이용이 가능한지 혹은 DW나 다른 버퍼에서 dnase 처리 후 sample buffer로 boiling해야할지 의견이 궁금합니다.   감사합니다.
회원작성글 돈먹는꼬마  |  2021.11.13
Q. native-PAGE 밴드 중앙이 끌려 내려와요. 피드백 부탁드려요
"잠시 내 이야기 좀 들어보게나!" 이 대학원생은 지금 도움이 필요해요! n-PAGE 중인데 밴드 모양이 자꾸 일그러져 내려옵니다. 샘플 조건은 Rice soluble total protein이고 phosphate buffer로 액체질소를 사용해 막자사발로 균질화 한 뒤 12,000 g 10 min centrifuge 했습니다. 4% for stacking(10 ~13 mm), 7%, 10% acrylamid gel을 사용했으며 tris-glycine 버퍼를 사용했습니다. 따로 pH는 조정하지 않았습니다. well당 40 ug 의 단백질 양을 사용했으며 샘플 양은 16 ul, 1/4 sample dye를 섞었습니다. 탱크 2개에 젤 4개를 넣어 30 mA로 20 min, 60 mA로 55 min을 돌렸습니다. 나온 젤로  CAT, POD, SOD 확인 실험을 했습니다. 어느날은 밴드가 고르게 직선으로 나오는데 자주 밴드가 아래로 갈 수록 줄어들거나 가운데가 끌려서 내려옵니다. 솔직히 SDS-PAGE에는 이런 적이 없고 native-PAGE에만 이렇게 나오니 어디가 잘못되었는지 의심가는 곳을 잘 모르겠습니다.
회원작성글 M0T1V3  |  2021.11.12
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