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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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Q. Gelatin zymography 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ band가 아에 없어요,,,
안녕하세요 zymography를 처음 해보는 석사생입니다ㅠㅠ 도움 받을 분이 없어서 혼자 진행해봤는데요,, Gelatin zymography를 통해서 MMP-9의 활성을 보려고 했는데 밴드가 아에 뜨지를 안습니다,, Sample을 prep은 먼저 6웰 플레이트에 A549 cell을 깔고 부착후 starvation하였고 후에 cell을 자극하고 시료를 처리하여 conditioned media를 모았습니다(starvation부터 모든 media는 SF media를 사용했구요) 이 샘플로 MCP-1 등의 ELISA 측정을 하였고 최종적으로 zymography를 수행했습니다,,!ㅠㅠ Zymography의 모든 젤과 시약은 invitrogen novex제품을 사용했는데요, Conditioned media를 LDS sample buffer(4x)로 4배 희석시켜준 후에 로딩하여 90V로 3-40분 정도 전기영동하였고 후에 renaturing buffer(1x)에 30분, developing buffer(1x)에 30분 상온에 둔 후 새로운 developing buffer로 교체하여 37도에서 overnight 했습니다. 후에 wash 3회 진행하였고 simplyblue safestain으로 1시간 gel 염색 후 d.w로 1시간 탈색하였습니다. 근데 아에 밴드가 뜨질 않아요,, 염색 후에도 밴드가 안보였으나 그대로 진행해봤는데,, 왜 안뜨는걸까요?,,, 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 sjsj3636  |  08.13
Q. Ni-NTA regeneration시 침전물의 정체가 뭘까요?
안녕하세요, 단백질 정제를 주로하는 대학원생입니다.   여느때와 마찬가지로 LC와 Ni column을 이용해 단백질 정제 중이었습니다만, Striping 및 Ni charging 이후 시간이 촉박하여 곧바로 Column equilibration을 진행하였습니다.   그런데 곧바로 A Buffer가 Injection되는 관을 따라서 침전물이 보였습니다.   Ni Solution과 A buffer가 혼합되며 침전물이 생성되는 것처럼 보였는데, 침전반응이 생길만한 것이 떠오르지 않습니다.   사용하는 buffer로는 Ni chargeing - 100mM NiCl2 Equilibration - 50mM potassioum phosphate, 100mM NaCl, 60mM Imidazole  pH7.5 사용합니다.   위 buffer들로 인하여 침전물이 생길 수 있습니까?   P.S. 100mM NiCl2를 Phosphate/NaCl 또는 Imidazole과 혼합시에는 별다른 침전물이 보이지 않습니다만, Phosphate/NaCl,/Imidazole buffer와 혼합시에는 침전물이 보이는군요.   실험이야 완충만 잘 해주면 상관없지만 침전물의 정체가 궁금하여 질문드립니다, 감사합니다.
회원작성글 Tedi  |  08.02
Q. Human protein atlas에는 안된다고 하지만 되는 경우도 있나요?
human protein atlas가 굉장히 세계적인 database?라고 알고있습니다. 제가 원하는 부위에서 해당 단백질의 발현을 연구하고자 하였는데 human protein atlas에서 IHC하였을 때 detect가 되지 않기 때문에 RNA level에서는 발현이 되지만 protein level에서는 발현되지 않는다고 나와있습니다. 하지만 최근 교수님께 문의드리니 같은 부위의 같은 protein에 대해 IHC하여 발현된 결과를 보여주셨는데 어디서 자료를 가져오신건지 모르겠지만 human protein atlas가 틀리기도 하나요?
회원작성글 별헤는밥  |  07.28
Q. His-tag / Ni-nta에서 EDTA 사용
어떤 protein의 ubiquitination을 확인하기 위한 실험을 진행중입니다. His-tagged된 ubiquitin을 transfection하고 배양 후 MG132 6시간 처리하고 lysis 하였습니다. 이후 Ni-nta 로 정제 후 western blot을 진행하는 방식입니다. 궁금한점이 제가 사용하는 lysis buffer 조성중 2mM의 EDTA가 들어가는데, chelate로 세포막을 약화시켜 lysis를 돕는다고 알고 있습니다. 그런데 EDTA가 Ni-nta 에서 ni 이온을 chelating하여 elution 시킨다고 하는데, 그렇게 되면 His-tag가 못붙을 것 같은데... 2mM의 EDTA가 정제에 큰 영향을 미칠수 있는건지 궁금합니다. 
회원작성글 Dozmal  |  07.26
Q. 혹시 정상세포 중에서 PDL1과 CD47을 모두 발현하는 세포가 있나요?
  안녕하세요, 항암제 공부하고 있습니다! 제 전공이 항암쪽이 아니지만 이쪽으로 진로를 정하고 싶어서 빡세게 공부하고 있습니다. pdl1 과 cd47이 암세포에서 많이 발현된다고 알고 있는데요, 혹시 정상 세포 중에서 두가지를 모두 발현하는 경우는 없나요? 관련 논문을 찾고 있는데 검색해도 잘 나오지 않고, 논문에서 언급되지 않아서 여쭤봅니다.    
회원작성글 짱쭁  |  07.24
Q. IHC 결과데이터에 negative marker 쓰는 이유
논문에 mouse brain에 IHC한 결과를 보는데요 DCX+GFAP+ 이렇게 보여주는건 알겠는데 KI67+NEUN- 이렇게 negative 발현을 표시해서 보여주는 이유가 뭘까요? 사진보면 NEUN 마커발현은 감소하고 이에대한 정량 그래프로는 KI67이 증가하는걸로 보이더라구요 궁금합니다.
회원작성글 him  |  07.21
Q. 단백질
요검사지에서 단백질을 검출 할 때   지시약이 단백질 아미노기 부분에서 수소이온을 잃고 색이 변화하는 원리를 이용한다고 하는데..  단백질 아미노기 부분에서 수소이온을 잃으면 왜 색이 변화하는지 궁금합니다.   또 적혈구를 검출 할 때에는  혈색소 가성 과산화효소 활성도를 활용하여 시험지 과산화수소수를 분해해 발생하는 산소로 색이 변화하는 원리를 이용한다는데   혈색소 가성 과산화효소가 무엇인지 그리고 과산화수소수를 분해해 발생하는 산소의 어떠한 특성 때문에 색을 변화시킬 수 있는지 궁금합니다.      
회원작성글 메디스은  |  07.16
Q. enzyme
요검사지의 포도당 검출원리에 대해 알아보고 있는데요   포도당 산화효소(Glucose oxidase)에 의해 포도당 산화→과산화 수소(H2O2) 발생→검사지에 있는 효소인 퍼옥시데이스(peroxidase)와 반응→발색제와 반응하여 초록색을 띰.   딱 이렇게 밖에 안나오는데.. 더 구체적으로 Glucose oxidase가 포도당을 산화시키는 과정? 원리나 퍼옥시데이스가 뭔지 그 반응식을 알고싶습니다.   
회원작성글 메디스은  |  07.16
Q. Trypsin 제거의 문제
안녕하세요,   우리 단백질이 트립신 처리 후    제거하는 공정에서 제대로 제거되지 않고,   일부가 단백질과 interaction을 하여 같이 용출되는 것 같습니다.   고수님들 중에, 이런 상황일 때,   트립신을 제거할 수 있는 효과적인 방법이 있을까요?   답변 부탁드립니다.
회원작성글 흑야화  |  07.15
Q. 1차 IEX capture 정제 질문입니다.
말그대로 1차로 capture의 목적으로 정제를 진행하는데,   1. isocratic (step) elution   2. gradient elution   고민입니다.   둘다 장 단점이 있으나, 여러분들이라면 1차엔 어떤 방법이 나을거라 생각하실까요?   1번을 택하면 amount는 높겠지만, impurity가 많을거고, 시간도 단축되고, 버퍼도 아낄테고...   2번은 resolution은 좋아져서 impurity가 1번에 비해 적을테지만, volume이 늘어나고, 시간이 길어지고, 버퍼 사용량이 많아서..   뭘해도 상관없는 시료입니다. 안정한 편이구요..   여러분들이라면, 몇 번을 선택하시고, 그 이유가 뭘까요!?   궁금합니다 
회원작성글 흑야화  |  07.14
Q. HisPur Ni-NTA Purification시 Elution result check 시 multi band
       1:Ladder 2:supernatant of cell lysate before induced 3: supernatant of cell lysate after induced  4~6: purified protein Elution  7: 알고있는 protein 8:Ladder 안녕하세요, 현재 저는 pet28a(+)를 backbone으로 recombinant protein을 발현 중에 있습니다. 4~6번까지 sample은 300mM imidazole condition으로 His tag정제를 한 결과물입니다. 여쭤보고 싶은 것은 제가 예상한 protein의 분자량이 약 60kDa에서 보여야 하는데 4번 lane에서 여러 밴드가 뜨는 것을 확인하였습니다.   imidazole의 concentration이 적은 것은 아닌 것 같은데 여러 밴드가 뜨는 이유가 궁금합니다. 또한, 기본 pet 28a(+)에서 thrombin cut을 하지 않고 His-tag purification만 해도 되는 지도 궁금합니다. 감사합니다. 
회원작성글 agaz  |  07.11
Q. protein purification 관련
안녕하세요 현재 6x his-tagged fusion protein extraction 및 purification 진행 중인 대학원생입니다.   ni-nta 사용하여 purification 후 SDS-PAGE로 elution fraction들 확인한 후, 그 fraction 중 골라서 dialysis 진행하려고 합니다. (이 step에서 각각의 fraction들을 loading하여 gel에서 제가 원하는 사이즈의 band만 많이 뜬 fraction을 골라서 dialysis 진행하려고 하는데 이게 맞는지 헷갈립니다... 제가 생각한 대로 하는 것이 맞는지도 알려주시면 감사하겠습니다...)  islouble한 protein이 urea buffer에 있는 상태인데 이런 경우 혹시 SDS-PAGE 진행 후 coomassie staining 확인해서 fraction 고르는 동안 protein을 4°c에 보관해도 괜찮을까요? 오래는 아니고 overnight 정도 생각하고 있습니다. 도움 주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 부레옥잠  |  07.08
Q. HEK293 Membrane protein purification (his tag)
안녕하세요, 현재 HEK 293에 C-term his tagtransmembrane protein을 transfection 시킨 후 단백질 정제를 시도하는 중에 막혀 질문 남깁니다.    문제는 비드에 타겟단백질보다 다른 non-specific 단백질이 더 강하게 바인딩한다는 것입니다. (cell lysate에서는 발현 확인)   먼저 protocol에 대해 간략하게 설명드리자면 buffer - 50 mM sodium phosphate buffer (pH8.0) - 150 mM NaCl - 0.005% Tween 20 - 1 mM TCEP - 20 mM Imidazole (binding/washing) - 50~200 mM Imidazole (elution) - protease inhibitor * Tween 20은 0.05, 0.1%까지 사용해보았으며 tris buffer pH7, pH8 모두 사용해보았고, NaCl도 300 mm 까지 사용해보았으며 200 mM 이후 bead에서도 non-specific band만 있고 target은 없는 것을 확인하였습니다. 1. Cell을 scraper로 뗀 후 centrifuge (4000~10000g 3 min) 2. Binding buffer로 pellet을 풀어준 후 sonication 1분 진행 (1sec on/ 1sec off) 3. 평형시켜놓은 Ni-NTA bead 와 1시간 binding (4도) 4. washing 및 elution 이것저것 조사중에 membrane protein extraction 과정이 있던데, 대부분 bacteria에서 진행하거나 이를 통해 WB를 확인하는 용도더라구요. 대부분 centri를 통해 membrane fraction pellet을 얻던데, extraction 후 똑같이 풀어주어서 his tag purification 을 진행해도 되나요? 아니면 다른 방법이 있을까요..? mammalian cell 에 대해서는 잘 안나와있어서 혹시 참고할 만한 문헌을 알려주시면 감사하겠습니다ㅠ ㅠ
회원작성글 냥뮹  |  07.07
Q. urea buffer에 있는 protein 보관 어떻게 하나요?
안녕하세요  사수도 없는 랩에서 고군분투 중인 대학원생입니다...   지금 항체 제작을 위한 his tag이 달린 fusion protein을 e.coli expression 시켜서 extraction 및 purification 진행 중입니다.. 하지만 사수도 없고 해서 제가 혼자 찾아가며 하다가 모르겠는 부분이 있어 질문 합니다.. 먼저 현재  insoluble로 expression 되는 것은 sds-page 진행하여 확인한 후 urea buffer로 lysis하여 extraction 하려고 합니다. 원래는 잠시 4°c 에 두었다가 sds-page 후 dialysis 진행하려고 했으나 그러지 못하게 되어 4일 정도 두어야 할 것 같습니다. 이때 urea buffer에 있는 protein은 어떻게 보관하는 것이 좋을까요? 그리고 혹시 dialysis protocol을 알려 주실 수 있을까요..? 찾아보니 desalting tube나 dialysis membrane등을 이용하는 것 같은데 현재 저희 lab에 그런 것들이 없는데다 어차피 한번에 성공하지 못할 것이라고 생각해서 빨리 한번 실험 해보려는 중이라 어떻게 dialysis를 하면 좋을 지 고민 중입니다. 혹시 이런 경우 아시는 protocol이 있으시면 알려주시면 감사하겠습니다..
회원작성글 부레옥잠  |  07.07
Q. column 정제
column으로 정제하는 실험 처음 진행하는데 조언 부탁드려요..! 컬럼이 대량으로만 파는데 저는 5개 정도만 필요해서  sephadex g10 레진만 구매해서 컬럼을 만들려고 합니다. 샘플이 10 uL 정도의 소량인데 이 정도도 정제를 할 수 있을까요?  
회원작성글 0876  |  07.05
Q. .
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회원작성글 빵빵  |  06.18
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