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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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회원작성글 빵빵  |  06.18
Q. Bacteria cell culture Inoculation ampicillin 재질문
Protein overexpression을 목적으로 cell culture를 하던 도중에 inoculation 과정에서 ampicilin을 넣는 걸 깜빡했습니다. 질문 내용이 좀 더 구체적이어야할 것 같아서 다시 올립니다. Transformation 후 single colony를 20ul ampi와 함께 20ml LB에 넣고 O/N culture하였습니다. 다음날 1L 수준으로 scale up할 때 ampi를 추가로 1ml 넣어주는데 1ml 넣는 것을 깜빡했습니다. O.d 측정하고 IPTG 넣고 2시간 후에 기억이 나서 Ampicillin을 추가했습니다. 아주 큰 문제가 될까요. 제가 bacteria cell culture관련 경험이 부족해서 질문남깁니다.
회원작성글 맬  |  06.08
Q. Bacteria cell culture Inoculation ampicillin 질문
Protein overexpression을 목적으로 cell culture를 하던 도중에 inoculation 과정에서 ampicilin을 넣는 걸 깜빡했습니다. O.d 측정하고 IPTG 넣고 2시간 후에 기억이 나서 Ampicillin을 추가했습니다. 아주 큰 문제가 될까요. 제가 bacteria cell culture관련 경험이 부족해서 질문남깁니다.
회원작성글 맬  |  06.08
Q. Buffer 조건을 바꿔서 단백질 Solubility를 낮추는 방법?
안녕하세요, 저는 단백질 정제 관련 분야 대학원생입니다. 특히, 정제 후 크리스탈을 만드는 실험을 주로 진행하고 있는데요.   제가 정제하는 단백질이 너무 soluble하여 침전이 잘 안되는 상황이라, 정제 마지막 단계에서의 final buffer 조성에 변화를 주어 solubility를 낮추려고 합니다.   제가 찾아본 결과, 거의 다 solubility를 높이는 방향으로 고민을 하고 계셨고, 또 다른 protein과 함께 complex 구조로 크리스탈을 얻는 등 buffer 조건을 이용하여 too soluble한 단백질의 solublility를 낮춘 정보는 없는 것 같았습니다..ㅜㅜ   현재 사용 중인 final buffer 조성은  100 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0.2 mM TCEP, pH 7.4 입니다.   제가 생각한 방안은 Buffer의 charge를 낮추기 위해 NaCl을 제외하고, pH 조건을 protein pI와 최대한 동일하게 맞추는 방법인데, 이 외에도 또 다른 방법이 있을 지 여쭤봅니다.   감사합니다.
회원작성글 성공을목표로  |  06.07
Q. SDS-PAGE gel 염색
SDS-PAGE gel을 염색할 때 coomassie blue staining을 이용해서 염색을 했는데 염색할 때 전자제인지에 30초가 가열을 해주었습니다. 왜 전자레인지로 gel과 염색약을 가열해주는 과정이 필요한 것인가요?
회원작성글 바이오팜  |  05.28
Q. protein 합성 방법들 대략적 난이도
protein expression-purification을 거쳐 in vitro에서 binding affinity를 보고자 하는 실험을 계획하고 있습니다. 그러나 protein work를 해 본적 없어 어떤 시스템이 적절할지 고민중입니다. protein expression system은 E. coli, yeast, insect cell, plant, mammalian cell 등 다양한 시스템에서 발현및 추출하는 시스템이 있는 것으로 알고 있는데, 이들의(특히 E. coli와 insect cell system) 상대적인 난이도 및 culture에 걸리는 시간, 얻어지는 단백질의 양 등을 가늠하고 싶습니다. 현재로선 추출하고자 하는 protein이 insect viral protein이라 bac-to-bac 등 insect cell과 baculovirus vector를 이용한 방법을 유력한 후보로 보고 있지만, 가장 쉽고 빠를 것으로 보이는 E. coli system에 비해 어떤 점들을 신경써야 하고 어떤 부분이 까다로운지 의견주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 화찌  |  05.28
Q. 재조합 단백질 정제분리에 대하여..
안녕하세요 혹시 재조합단백질 정제분리를 할때 SDS-PAGE를 한 다음 HIS-TAG 분리를 해도 될까요? 아님 둘중에 하나만 해야하나요?
회원작성글 알토  |  05.26
Q. pYES2/CT VECTOR에 대한 추가질문
답변 감사드립니다 방금찾아보니 pYES2벡터는 pUC1 ori가 맞더라고요 그런데 저는 pYES2/CT벡터를 이용해서 발현을 하고 싶은데 이것도 셔틀벡터가 맞나요?
회원작성글 알토  |  05.25
Q. pYES2ct벡터에 대한 추가질문드립니다.
우선 앞선 답변 감사합니다. 혹시 pYES2ct가 pBR322origin이 있기때문에 셔틀벡터가 가능한건가요? 그리고 그러면 pBR322를 이용하여 대장균군주에 넣고 클로닝한걸 pYES2CT에 넣어 효모에서 발현하면 되나요? 그리고 여기서 그냥 갈락토스로 induce하면 단백질이 발현되나요?
회원작성글 알토  |  05.25
Q. pYES24벡터와 효모 균주를 이용한 클로닝에 대한 질문드립니다.
안녕하세요 효모균주를 이용하여 재조합단백질을 만들려고하는데요, 발현벡터를 이용하려고하는데 혹시 PCR로 원하는유전자+클로닝벡터를 사용하여 유전자를 증폭한다음 이 재조합DNA를 같은 발현벡터에 다시넣고 단백질을 발현을 시켜도 되는건가요? 아니면 다른 클로닝벡터와 균주를 쓰고 이를 클로닝벡터와는 다른  발현벡터에 넣어 단백질을 발현해야하는건가요? 제가 생각하는 방법은 대장균에 넣어서 클로닝한다음 셔틀벡터를 이용해 효모로 옮겨서 발현하는방법을 생각했는데, 셔틀벡터 찾기가 쉽지않더라고요. 그리고 혹시 질문이있는데 목표유전자를 처음부터 pcr로 증폭해서 클로닝벡터에 넣고 재조합dna를 대량생산하는건가요 아니면 재조합dna를 pcr로 증폭해서 대량생산하는건가요?
회원작성글 알토  |  05.25
Q. Horseradish Peroxidase 활성 test
Horseradish Peroxidase 용액의 효소 활성을 확인하고싶습니다. 혹시 Bradford protein assay를 사용해도 괜찮을까요?    
회원작성글 qlzj  |  05.23
Q. pGEM-T Easy Vector로 expression가능 할까요?
안녕하세요!   원래는 pET22에 insert를 집어넣고 BL21(DE3)에 TF하여 발현시켰는데   물론 T-vector 가 클로닝 벡터라는것을 알고있지만 T-vector로 BL21(DE3)에 TF하여 발현시키고 싶습니다   제가 T-vector에 넣은 insert 방향은 T7 promotor와 맞지 않지만 반대의 Lac promotor와는 일치합니다   그래서 T7이 아니여도 IPTG로 충분히 발현이 가능할 것 같은데 제가 생각하고있는 이론이 맞는지 알고싶습니다 또한 이렇게 했을시에 큰 문제점도 알고싶습니다   아니면 T-Vector에 좋은 host가 있을까요?   감사합니다  
회원작성글 Razer  |  05.22
Q. quagen ni-nta 의 원리를 모르겠습니다.
안녕하세요. quagen ni-nta 실험을 하고 있는 대학원생입니다. 다름이 아니라 ni-nta 원리에 대해 공부를 하고 있는데요. 중요한건 제가 검색을 해봐도 이 그림에 대한 자세한 설명을 못찾았다는 것입니다. 혹시 선배님들 중에 이 회사의 이 그림을 완벽히 이해하고 계신 분이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 bio1296  |  05.22
Q. Luciferase assay 해석 부탁드립니다 첨부파일
Cellular IFN response mediated by SARS-CoV-2 proteins in HeLa cells. Cells were co-transfected with pIFN-β-Luc (0.5 μg) (A), or pISRE-Luc (0.5 μg) (B), along with pRL-TK (0.05 μg) and each (0.5 μg) of indicated SARS-CoV-2 genes. At 24 h post-transfection, the cells were transfected again with 0.5 μg of poly(I:C) for stimulation for 16 h (A), or incubated with IFN-β (1000 UI/ml) for 6 h (B). Cell lysates were then prepared for luciferase assays using the Dual Luciferase assay system according to the manufacture’s instruction (Promega). Relative luciferase activities were obtained by normalizing the firefly luciferase to Renilla luciferase activities. Values of the relative luciferase activity in the pXJ41 control group were set as 1, and the values for individual viral proteins were normalized using that of the pXJ41 control. HeLa cells were co-transfected with the ORF3a, M, ORF7a, or N genes and the pIFN-β-luc reporter, followed by luciferase determinations. Luciferase assay원리 보면 target gene promoter에 luciferase 유전자를 재조합한 플라스미드를 이용하는건데 여기에서는 IFN베타를 타겟으로 하는 플라스미드를 사용한 것 같구요 Pxj41 벡터에 해당 유전자들을 각각 세포에 형질전환시켰다고 했고 그럼 그 각각의 플라스미드는 pIFN-β-Luc 와 별개로 존재하고 그 존재에 따라 IFN베타의 전사활성을 본건가요?? 해석 부탁드립니다ㅠㅠㅠ
회원작성글 낑깡말랭이  |  05.21
Q. Vivaspin 6 PES , 1,000,000 MWCO
안녕하세요, 서울시립대학원 석사과정 3학기 대학원생입니다.   제가 lipid based formulations의 emulsifier surface laode를 Vivaspin 6 PES , 1,000,000 MWCO 을 이용하여 측정하려고합니다. 시약상에 여쭤보았는데 국내 재고가 없다고하여 구할 수가 없습니다. 혹시 가지고 계신 선배님이나 실험실이 있다면 제게 판매하거나 보내주실 수 있으십니까? gktlskdh@naver.com으로 연락 부탁드립니다. 감사합니다. 
회원작성글 doxxx  |  05.20
Q. AKTA His buffer 관련 문의
안녕하세요. AKTA를 이용하여 단백질을 정제하였는데 Elution이 이상하여 글을 올리게 되었습니다.   HisTrap HP column을 이용하였고, buffer 조성은 아래와 같습니다. -Binding buffer : 20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl -20mM Wash buffer : 20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole -Elution buffer : 20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, 0.5M Imidazole   위 그래프와 같이 sample을 injection 유무와 상관없이 동일하게 peak값이 나타납니다.   어떤 이유로 sample injection 하지 않았는데도 불구하고 Elution 시 peak가 나타나는 이유가 궁금합니다. 많은 답변 부탁드립니다.
회원작성글 kim7113z  |  05.13
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