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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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Q. protein purification 중 binding 문제
안녕하세요, protein purification 실험 진행하는데 막히는 부분이 있어 여기에 여쭤봅니다.  단백질 실험은 처음 해보는지라 모르는 점이 많음을 양해 부탁드립니다.    target 하는 단백질 size 는 대략적으로 28kDa(his tag size 포함) 이고, Ni-NTA resin 을 이용하는 Affinity chromatography 를 통해 정제하려고 하였습니다. 사용한 Tag은 His-tag이며, N-term과 C-term 양쪽에 모두 6x His를 가지고 있습니다 (N-term이 stable 하다는 얘기를 듣긴 했지만, 양쪽에 his tag를 가지고 있으면 binding 이 더 잘될 것이라는 생각이 들어 N/C -term 모두에 his-tag를 달았습니다.) 실험 방법은 다음과 같습니다.  1. 25ml 의 cell culture를 centrifuge하여 pellet 을 수득한 후, lysis buffer 5ml 로 resuspension 한 다음 세포파쇄 (via sonicator: 50%, 5'' on/ 5'' off)하였습니다. sonication 이후 centrifuge 하여 supernatant를 lysate로 사용하였습니다. (soluble fraction)  2. 사용할 column (10ml의 컬럼)을 1CV 만큼 equilibration 해주었습니다.  3. Ni-NTA agarose resin 을 column에 1ml 충진 후, binding buffer 3CV flow through.  4. Sample 을 column에 load 한 후, 4℃ 에서 rotation 준 상태로 O/N 5. 이후, Sample을 flow through 하였습니다. (이 때 binding 을 좀더 시키기 위하여 flow through한 sample을 약 3회 정도 re-load하여 최종 Sample flow through 를 확보하였습니다.  6. (+10mM imH)로 3CV 만큼 washing  7. 1CV의 50mM~500mM imH로 각각 elution  8. SDS-PAGE 로 gel 확인 (Gel 사진은 하기 그림과 같습니다/ 하기 문제점에 기재하였듯, Elution 된 양이 적어 50mM 이상 elution 하였던 lane은 그림에서 뺐습니다.)  문제점과 질문사항은 다음과 같습니다.  Issue 1. Sonication 시, 많은 양의 cell 이 깨지지 않음이 확인됩니다. 우선적으로 사용한 sonication의 조건은 general 하게 사용하는 condition 으로 수행하였습니다. 질문) sonication 시 cell 이 잘 안깨지는 이유가 무엇인지 여쭤보고자 합니다. (많은 양의 cell 이 깨지지 않았더라도, 현재 gel 상 Soluble faction 에서는 충분한 target protein이 확보되었기 때문에, 큰 문제는 되지 않겠지만.. 그래도 일반적인 lysate와는 turbidity 가 많이 차이나서 여쭤봅니다.) Issue 2. Soluble fraction 과 Sample flow through 에서 target 단백질의 size 가 거의 비슷합니다. -> Ni-NTA Binding의 문제라고 생각됩니다. binding 효율을 늘리고자 4도에서 rotation 주며 o/n 하였으나 실질적으로 target 단백질이 이 과정에서 많이 손실되는 것으로 보입니다. 따라서, elution 시에도 당연히 target 단백질이 적게 수득됩니다. (  질문) binding 이 잘안되는 경우, binding 효율을 늘리기 위하여 어떤 방법들을 사용하시는지 여쭤보고 싶습니다. 또한, gel 사진을 해석하기에 또 다른 문제점들이 있는지를 알고 싶습니다.  ** binding이 안되는 경우, 보통 3차 구조로 his tag이 숨어버리는 경우를 의심하는 것으로 알고 있습니다. 이런 숨는 케이스를 확인하고자 하면, 어떤 방식으로 확인해야 하는지도 여쭙고 싶습니다.   감사합니다. 
회원작성글 ATTENSION  |  02.04
Q. 단백질 정제 관련
안녕하세요  단백질 정제 관련 업무도 추가적으로 연구하고 있는 대학원생입니당  단백질에 대해 정확히 배워보질 않아, 연구에 어려움이 있어서 찾아오게 됫습니당.(멍청해보이더라두,, 알려주시면 감사하겠습니다.)   1. Salt in / out 이란? - 용해도 측면에서  2. 레진 buffer 만들때, 전도도는 어떤 개념인지? 확인용?  (질문 의도, 단백질은 pH/PI 기준으로 걸러질텐데, 전도도의 중요성을 잘 모르겟어서요.. ) 3. pI를 등전점을 사용하는 방법과, 용해도(Salt In, out)를 사용하는 단백질 정제 방법은 아예 차이가 있는건지? 4. IEX가 CEX,AEX로 구분되는것으로 알고있엇는데, IEX가 자체적으로 존재하면 어떤 이온을 거르는지?  5. 이 단백질들을 공부하기 위해선 어떤 기초 공부를하면 좋을지...    조금 알려주시면 정말 감사드리겠습니다.   읽어주셔서 정말 감사합니다. 
회원작성글 아무거토몰라여  |  01.20
Q. GST purification 과정 중 ethanol 이 첨가될 시의 문제점
GST-tag protein purification 과정 중, 실수로 그만 GST sepharose bead 를 washing 하지 않고 그대로 cell lysate 와 혼합해버렸습니다. 해당 bead 는 100% ethanol 1:1 slurry 상태로 보존된 것이라, 아마 제 lysate 20ml 에 대략 500ul 정도의 ethanol 이 첨가되었다고 추측됩니다. 이 경우 purification 과정, 혹은 purification 된 protein 의 activity 등에 문제가 생길지 궁금합니다. 열심히 E.coli 키워서 가장 마지막 bead binding 단계에서 이러니 너무 허탈하네요...
회원작성글 움가  |  01.18
Q. ELISA 초보(응애) 질문드립니다. Standard의 흔들림 & 특정 sample의 이상한 OD
ELISA 초보(응애) 선배님들께 질문드립니다ㅠㅠ   3차에 걸쳐서 ELISA kit를 구매하여 진행하고 있는데 이상한 부분이 있어서 질문드려봅니다.   1. Standard의 흔들림 - 1,2차에서는 반응 기질을 2시간전에 꺼내서 진행하였고, 3차에서는 1시간전에 꺼내놓았었습니다. 이러한 시간의 차이가 반응에 영향을 줄까요? - 온도 : 프로토콜에 room temperature로 반응하라고 해서 실험실은 천장형 히터 24도로 계속 돌아가고 있고, 오후 2시쯤부터 실험을 진행하였습니다. 금요일 월요일 화요일 날씨는 6도 9도 9도 였습니다. 이게 영향이 있었을까요?   2. Sample 2차 실험에서 각 sample을 1000배 희석하여서 사용하고 있습니다. RNA level에서는 A sample이 B sample 보다 발현량이 많아서 ELISA에서도 B에서 protein의 발현량이 적을 거라고 기대하고 실험을 진행하였는데 A는 2차에서 정상적으로 나오고 B는 saturation 되었는지 3~4 정도의 OD가 나오는 현상이 반복되었습니다. 희석배수를 다시 잡아야 할까 싶어서 3차 실험에서 각 sample을 1000, 1300, 1500, 2000배로 희석해서 진행했는데 A는 희석배수에 따라서 OD 값이 줄어드는 경향을 보이는데... B는 똑같이 OD가 2 이상을 나타내고 있고, 기질을 well에 넣을때부터 바로 푸른 색이 나타나고 있었습니다. 둘 다 같은 기관에 의뢰하여서 받은 sample인데 농도가 크게 다를거 같지도 않고 더군다나 RNA level로 오히려 적게 나와야 하는 상황인데 계속해서 OD값이 높게 나오면 B sample에 문제가 있는 것이 아닐까요?
회원작성글 진시엔  |  01.11
Q. 형질전환 후 스탁제조
안녕하세요. BL21 Cell에 transformation한 후에 콜로니를 따서 배양 후 그 배양액을 스탁으로 제조하는 과정에서, 원래에는 글라이세롤 스탁으로 제조하여 보관을 해두었는데, 동결건조 후 균을 보관을해도 잘 보존이 되는지 궁금하더라구요. 혹시 해보신분이 있으시다면 답변 부탁드리겠습니다 :) 
회원작성글 나밍  |  01.10
Q. Gene expression level 확인할 수 있는 곳이 있을까요?
안녕하세요.   혹시 human 혹은 immortalized cell line에서 유전자의 발현 정도를 list up 해놓은 곳이 있을까요? 특정 organ마다의 발현이 나와도 좋고 general한 정도가 나와도 좋은데 왠지 NCBI에 있을 것 같은데 제가 봤을 때는 못 찾겠더라고요... 혹시 도움 주실 수 있으면 정말 감사하겠습니다. 감사합니다.
회원작성글 ade95a  |  01.09
Q. 단백질 정량
단백질 정량 후 단위를 바꾸면서 혼동이 와서 여쭤봅니다. 아래와 같이 standard curve를 구하여 미지샘플 OD(1.683)을 Y에 대입하여 단백질양 (1683 ug/mL)을 구했습니다. 저는 이때 1000으로 나누어 1.7ug/ul으로 생각하여 1.7 ug * 30ul =  51 ug/ml 생각하여 진행했는데 아무 생각해도 잘못된 것 같아서요. 알려주시면 감사하겠습니다. 논문에 들어갈 데이터인데 헷갈리다니..ㅠ
회원작성글 구릅  |  01.06
Q. secretase로 잘리는 단백질 정제
안녕하세요, 현재 secretase로 잘리는 단백질을 정제하려고 합니다. 단백질 C term에 EGFP와 his tag이 달려있으며 PEI로 transfection 후 형광 현미경으로 확인해보니, 다른 단백질에 비해 형광 강도도 떨어지며 (잘린 후 degradation 되는 형태입니다.) WB로 확인하니 다 processing 되어 온전한 full length band는 매우 약한 상태입니다.. 그래서 secretase inhibitor를 넣고 정제를 하려고 하는데 확인 부탁드립니다..! 1) 약물의 IC 50을 기준으로 다양한 농도로 test     (약물 처리 전날, transfection 하던 것처럼 cell seeding) 2) 위에서 약물 조건이 정해지면, PEI로 target plasmid transfection 3) 24hr media change, 48 hr 후 cell harvest 및 단백질 정제
회원작성글 냥뮹  |  01.06
Q. 분자량이 300kDa인 5% 단백질 1mL가 있는데 이때 밀도를 어떻게 구해야 할까요?
분자량이 300kDa인 5% 단백질 1mL가 있는데 이때 밀도를 어떻게 구해야 할까요? 부탁드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 출산육아경력단절  |  01.05
Q. unit/ml 계산
dns방법으로 키티나제 효소활성 실험중입니다.cell free 배양액 500ul 키틴 500ul  버퍼 500ul 넣어주고 반응시켜 흡광도를 얻었습니다. 스탠다드 커브는 umol로  표현 되었습니다. sample의 측정값, umol단위에서 unit/ml 단위로 변환해 주고 싶습니다. 찾아보니 umol(분해된 기질의 양)*(넣어준 효소의 양)mg/ min로 계산되는것 같은데 넣어준 효소의 양은 cell free 배양액을 정량해야 알수 있는데 제가 정량은 할수 없을것 같습니다. (cell free 배양액에는 키티나제말고 여러 효소가 있기 떄문에 정제과정 복잡해서...) 그래서 ml로 표현해 주고자 하는데 어떻게 계산 해야될까요??
회원작성글 김소현이다  |  01.05
Q. Fplc column 선택
Column선택에 있어서 헷갈리는 점이 있어서 질문 드립니다. 타겟 단백질 사이즈는 37kDa이고, pi는 5.0정도 되는데 buffer pH=7.5라고 가정했을때 Q와 SP column중 어느 것을 사용해야하나요??
회원작성글 m_all100  |  01.03
Q. phage display
phage display를 할 때 저희가 NEB M13 phage를 사용하게 되었는데요 처음 접하게 된 기법이라 이게 도무지 뭔지 잘 몰라서 공부중에 있습니다. 제품 설명을 보면 12mer라고 적혀있는데 12mer의 peptide가 항체처럼 친화성 결합을 유도하는건가요? 파지 라이브러리가 항체처럼 역할을 해서 타겟 안티젠에 붙는 형식이라고 알고있는데 12mer peptide가 혹시 항체처럼 역할을 하는걸까요? 또한 12mer peptide를 통해 antigen에 결합했을 때 antigen peptide중 어딘가에 붙게될텐데 peptide specific하게 알고 싶다면 추후 시퀀싱을 통해서 정확히 어떤 peptide에 붙었는지 알수 있는건가요? 알 수 없다면 이걸 아는 방법은 없나요?
회원작성글 별헤는밥  |  2022.12.30
Q. recombinant factor xa
recombinant factor xa를 사용하시는 분 계신가요? e.coli를 host cell로하여 recombinant factor xa를 cloning하고 정제하여 사용해보려하는데 이렇게 사용하시는 분들께 여쭤보고 싶은게 있어 질문 남겼습니다.
회원작성글 aassbbddr  |  2022.12.27
Q. 효소 정제에 사용한 reducing agent 제거 가능할까요?
안녕하세요. 매번 도움만 받고 있는 대학원생입니다. 현재 protein purification 후 dialysis 과정에서 beta-mercaptoethanol을 넣어주면 침전이 덜 일어나서 넣어서 dialysis 하고 농축 후 디프리져에 보관합니다. 그런데 이 효소를 이용하여 하고자 하는 실험이 NADH+CU+발색용액 + enzyme --> NAD+CU-발색 complex가 만들어져 흡광도를 측정하고자 하는 실험입니다. 문제는 BME가 들어있는 효소와 cu-발색용액을 섞으면 발색이 되어 버려 BME를 제거하고자 하고 있습니다. 그래서 검색해본 결과 dialysis 아니면 desalting column으로 제거할 수 있다는 글을 보았고 aliquot 해놓은 효소 양이 적기 때문에 desalting column을 이용하여 제거하고자 하였습니다. 사용한 desalting column은 PD10이었고, 단백질과 BME 크기 차이가 많이 나기 때문에 쉽게 제거가 될 것이라고 생각하였는데 분리가 잘 되지 않고 제거가 되었는지 확인하기가 쉽지 않았습니다. 혹시 이러한 상황에서 BME을 제거할 수 있는 다른 방법이 있을까요? 동일한 경험 해보신 분 계시면 공유해주시면 정말 감사하겠습니다.
회원작성글 기적  |  2022.12.26
Q. 단백질 정제 LMW, shoulder peak 제거
안녕하세요, 선배님들 의약품 연구개발 회사에 종사하고 있는 연구원입니다.   정제공정개발 중 물질의 LMW와 shoulder peak를 제거하기 위한 최적조건을 찾아야 해서 질문 드립니다.   Protein A, AEX, HIC, UF/DF 등의 공정을 진행하지만 각 공정중에 어떤 최적조건을 맞춰야 lmw, shoulder peak를 제거할 수 있을지 조언을 구하고자 합니다.   감사합니다.
회원작성글 췟딧쓰아웃  |  2022.12.16
Q. transfection시 fugene 역할
Bacmid miniprep후 농도측정시 0.1ug/ul. Bacmid10ul + fugene 3ul +midia100ul 를 6well에 sf9 cell과 transfection해두었습니다. 그런데 bacmid 농도 재 측정시 2ug/ul입니다.ㅠ 백미드 10ul 사용했으니 Fugene양이너무 적은걸까요? 다시 transfection 하는게 좋은지요? 이것 5일후 infection 할 수 있는걸까요? Fugene의 역할이 뭔지 궁금합니다. 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  2022.12.14
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