질문에 앞서 실험보다 문헌에 관련된 내용인 점 사과드립니다. translated RNA가 아미노산을 구성하기때문에 코돈표를 보면 일부를 제외하고 RNA 기준 (T->U)으로 3 letter를 표기하는 것을 일반적으로 봐왔는데요 첨부된 표는 제2의문자 중 G에 해당하는 열만 U로 표기하지 않고 T로 표기한 것을 볼 수 있었습니다. (ex. 시스테인, UGU -> TGT) 또한 제 3의문자 행도 U가 아닌 T로 적혀있었는데요 검색하였을때도 이런 표는 찾지 못하였습니다. 단순 실수일수도 있지만 제가 모르는 이유가 있어서 이렇게 표기했을 수도 있다는 생각이 들기도 합니다 (식물육종관련서적). 이학관련 질의 커뮤니티 아는곳이 없어 bric에 질의 올립니다...

안녕하세요, 논문을 읽다 질문이 생겨 문의 드립니다. WB 시 protein 양을 모든 well에 같은 양 걸어주어야 특정 protein의 발현 변화 정도를 비교할 수 있잖아요, 만약 제가 여러 protein을 확인할 때에도 반드시 매번 같은 양을 걸어야 할까요? 제 말은, blot 내에서 아시다시피 b-actin은 10ug만 걸어도 잘 나오지만 어떤 protein은, 특히 phospho form은 10ug로는 잘 안 나오는 경우가 있습니다. 이럴 때 b-actin은 그대로 두고 phospho form의 양을 조금 늘려서 loading하는 것이 가능할까요?   그리고 어떤 논문의 경우 20ug 걸었다, 어떤 논문은 18~22ug의 양을 걸었다라고 쓰기도 하던데 뭔가 통상적인 protein loading 양의 허용범위? 같은 것이 있는지도 궁금합니다.   감사합니다.

여러 sample(Cultrure media/Urine/Serum/Plasma...)에서 exosome을 다양한 방법(Ultracentrifuge, PEG kit, filtration 등등)으로 isolation 후 각 방법별로 효율을 비교하고자합니다. 이때, protein 정량 후 protein의 양을 맞추고 loading하는 것이 맞을까요? 아님 yeild의 개념으로 같은양을 loading하는 것이 맞을까요? ex] 만약 모든 방법을 동일하게 sample 1ml으로 start하여 마지막 elution을 50ul으로 한다면  a) 50ul를 정량 후 20ug씩 loading  b)추출 효율 비교니까 모두 동일하게 20ul씩 loading 사실 두방법 모두 실험 해봤지만 그렇게 큰 차이가 나지는 않습니다.  논문이나 각 commercial kit을 flyer를 찾아보면 western blot후 확인하던데 method을 봐도 그런거까지는 말해주지 않으니까요...  Exosome을 주로 실험하시는 분들은 어떻게 western을 하시는지 궁금합니다! Exosome을 연구하시는게 아니더라도 다양한 분들의 의견이 궁금합니다. 다양한 의견 부탁드립니다!

HEK293 cell에서 hypoxia 상태를 유도하려고 cocl2를 처리하려고 합니다. 참고로 한 논문들 에서는 cocl2 (sigma aldrich) 를 사용했다고 나와있습니다. (catalog 안적혀있음)  실제 검색결과 cocl2, cocl2 hexahydrate  두가지 제품군이 나오는데 hypoxia 실험을 할 때 둘 중 무엇을 사용하는지 궁금합니다. *(cocl2 hexahydrate를 사용하였다면 논문에서 material 기재 시 cocl2가 아닌 cocl2 hexahydrate라고 적어놨을까요?)

안녕하세요, western blot에 어려움을 겪고있는 대학원생입니다. western blot 관련해서 궁금한게 있어 글을 적게 되었습니다.   현재 western blot을 여러번 진행하고 있는데, background가 있어서 BSA 농도를 올려서 blocking 과정을 진행해보았습니다. 그런데도 불구하고 계속 lane에 따라 backgound가 있으며, marker를 분주한 lane에도 background가 보이는데, 혹시 어떻게 하면 backgound 없이 밴드를 확인할 수 있는지 알려주시면 감사하겠습니다.

제목 그대로 transfer후 폰슈를 묻혀 젤에서 잘 넘어왔는지 확인하는데요.. 멤브레인에 일정하게 동그랗게 구멍이 난 것 처럼 폰슈가 안묻힌 상태로 육안으로 확인이 됩니다. 무슨 구멍인지 대조해보았는데, 멤브레인과 젤 그리고 3m paper을 잡아주는 카세트의 구멍과 일치하는 간격과 크기였습니다. 카세트 구멍대로 폰슈가 안묻혀지며, detection과정에서 구멍이 나있던 부분의 밴드가 매우 희미하게 detection됩니다.. 신생연구실도 아니고, Western blot anlaysis가 메인인 연구실이라, Western Blot analysis과정 조건의 문제는 아니라고 확신할 수 있습니다.. 해당 증상을 겪으셨던 분들이나, 고견이 있으시면 공유부탁드립니다. 감사합니다.

안녕하세요.  현재 streptavidin conjugate 실험을 하고 있습니다. streptavidin 1g 이상 한번에 구매를 하고 싶은데요. 혹시 국내 제조업체가 있을까요? 문의 드립니다. 

안녕하세요, protein purification 실험 진행하는데 막히는 부분이 있어 여기에 여쭤봅니다.  단백질 실험은 처음 해보는지라 모르는 점이 많음을 양해 부탁드립니다.    target 하는 단백질 size 는 대략적으로 28kDa(his tag size 포함) 이고, Ni-NTA resin 을 이용하는 Affinity chromatography 를 통해 정제하려고 하였습니다. 사용한 Tag은 His-tag이며, N-term과 C-term 양쪽에 모두 6x His를 가지고 있습니다 (N-term이 stable 하다는 얘기를 듣긴 했지만, 양쪽에 his tag를 가지고 있으면 binding 이 더 잘될 것이라는 생각이 들어 N/C -term 모두에 his-tag를 달았습니다.) 실험 방법은 다음과 같습니다.  1. 25ml 의 cell culture를 centrifuge하여 pellet 을 수득한 후, lysis buffer 5ml 로 resuspension 한 다음 세포파쇄 (via sonicator: 50%, 5'' on/ 5'' off)하였습니다. sonication 이후 centrifuge 하여 supernatant를 lysate로 사용하였습니다. (soluble fraction)  2. 사용할 column (10ml의 컬럼)을 1CV 만큼 equilibration 해주었습니다.  3. Ni-NTA agarose resin 을 column에 1ml 충진 후, binding buffer 3CV flow through.  4. Sample 을 column에 load 한 후, 4℃ 에서 rotation 준 상태로 O/N 5. 이후, Sample을 flow through 하였습니다. (이 때 binding 을 좀더 시키기 위하여 flow through한 sample을 약 3회 정도 re-load하여 최종 Sample flow through 를 확보하였습니다.  6. (+10mM imH)로 3CV 만큼 washing  7. 1CV의 50mM~500mM imH로 각각 elution  8. SDS-PAGE 로 gel 확인 (Gel 사진은 하기 그림과 같습니다/ 하기 문제점에 기재하였듯, Elution 된 양이 적어 50mM 이상 elution 하였던 lane은 그림에서 뺐습니다.)  문제점과 질문사항은 다음과 같습니다.  Issue 1. Sonication 시, 많은 양의 cell 이 깨지지 않음이 확인됩니다. 우선적으로 사용한 sonication의 조건은 general 하게 사용하는 condition 으로 수행하였습니다. 질문) sonication 시 cell 이 잘 안깨지는 이유가 무엇인지 여쭤보고자 합니다. (많은 양의 cell 이 깨지지 않았더라도, 현재 gel 상 Soluble faction 에서는 충분한 target protein이 확보되었기 때문에, 큰 문제는 되지 않겠지만.. 그래도 일반적인 lysate와는 turbidity 가 많이 차이나서 여쭤봅니다.) Issue 2. Soluble fraction 과 Sample flow through 에서 target 단백질의 size 가 거의 비슷합니다. -> Ni-NTA Binding의 문제라고 생각됩니다. binding 효율을 늘리고자 4도에서 rotation 주며 o/n 하였으나 실질적으로 target 단백질이 이 과정에서 많이 손실되는 것으로 보입니다. 따라서, elution 시에도 당연히 target 단백질이 적게 수득됩니다. (  질문) binding 이 잘안되는 경우, binding 효율을 늘리기 위하여 어떤 방법들을 사용하시는지 여쭤보고 싶습니다. 또한, gel 사진을 해석하기에 또 다른 문제점들이 있는지를 알고 싶습니다.  ** binding이 안되는 경우, 보통 3차 구조로 his tag이 숨어버리는 경우를 의심하는 것으로 알고 있습니다. 이런 숨는 케이스를 확인하고자 하면, 어떤 방식으로 확인해야 하는지도 여쭙고 싶습니다.   감사합니다. 

논문을 보던 중 Western blot 결과 해석이 어려워서 질문드립니다ㅠㅠ... 질문은 크게 두가지입니다.   예를 들어, A단백질은 B, C, D와 complex를 형성한다고 했을 때, [질문1] Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 A 단백질을 Immunoprecipitation 후, B,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 컨드롤(scrambled control)에 비해 B의 증가량이 C, D의 증가량에 비해 매우 크다는 것은 무엇을 의미하나요? [질문2] 위 질문의 연장선으로,, Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 B 단백질을 Immunoprecipitation 후, A,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 위의 질문결과와 다르게, A,C,D의 증가량이 유사했다는 것은 무엇을 의미하나요?

western blot을 진행하고 있는데 아래사진처럼 dot 처럼 나오는 문제의 원인을 파악하지 못해서 이렇게 질문드립니다.... 단백질 사이즈 ; 14,16kDa 15% SDS-PAGE, Bio-rad 사용 Running ; 100volt, 2h 30min   Transfer ; 100volt, 1h 일단 이런식으로 dot으로 나오는 게 아래의 작은 size 단백질만 그렇고 GAPDH나 다른 사이즈 단백질은 크게 문제 없이 나옵니다.... 작은 사이즈의 단백질에 대해서 해당문제를 해결하려면 어떻게 해야하는지 도움부탁드립니다..

안녕하세요. 공부 중에 궁금하여 질문드립니다.. 웨스턴 블롯이 타겟 단백질이 있는지 없는지 유무를 확인하는 방법이라고 이해를 하였는데요   혹시 RNA 발현량 알아보는 qPCR 실험 같이 타겟단백질의 발현량(?)을 확인하는 정량 실험은 어떤 방법이 사용되나요? 어떤 실험법으로 찾아야 공부할 수 있는지 몰라서 질문드립니다 ㅠㅠ  

안녕하세요. 저희 랩이 조마간 이사를 가게되면서 실험 장비들을 새로 셋팅을 하게 됐는데요. chemi doc이 너무 고가라 여건이 안되서 이사 전 입주해있던 곳의 장비를 사용해야 될 것 같습니다. 그런데 거리가 1시간 거리이기도 하고 거기에 연구공간도 없고 보관 장소도 없으니 필요한 물품은 직접 들고가서 장비만 후딱 쓰고 다시 복귀해야될 것 같은데,    1. blocking 단계에서 shaking 후 blocking buffer에 담가놓고 1차 항체 들고 1시간 이동. 냉장 창고에서 o/n 진행시키고 다음 날 2차 항체 들고 다시 현장으로 이동. 2차 반응/세척 후 ECL 반응시켜 chemi doc 과정 진행. (이동 중 항체에 문제가 생기지 않을지 걱정...) 2. 2차 항체 붙이고 반응 완료후 TBST에 담가놓고 이동. 현장에서 washing 마무리 하고 ECL 처리해서 chemi doc 진행 (1시간 이동하는 과정 중에 2차 항체가 씻겨나진 않을까 걱정...)    중에 어떤 방법이 더 좋을 지 알 수가 없어서 물어봅니다. 이 외에 더 좋은 방법이 있을까요??

요즘 western blot을 자주하는데 methanol이 든 transfer buffer 내에서 작업하는 과정에서 nitrile glove가 과연 100% 화학물질을 차단해주는가라는 걱정이 됩니다..! 기분탓인진 몰라도 장갑을 껴도 100% 방수가 되는 느낌이 아니라서요..ㅠ nitrile 장갑만 끼고 transfer buffer에 손을 넣고 실험을 해도 안전할까요..?

안녕하세요 여러 연구원분 열심히 연구를 배우고 있는 대학원생입니다. 다름이 아니라 요즘 SDS-PAGE 실험을 하고있는데 staining 이후 destaining시 아래쪽은 색이 다 빠지는데 위쪽은 아무리 오래 빼줘도 안빠지더라구요 ㅠㅠ 무엇이 문제이고 해결방법이 있을지 조언 부탁드립니다~!!!~!~

이번 방학에 연구실에서 western blotting 하고 있는 학부생입니다.  transfection된 cell에서 protein을 추출한 뒤 WB할 때 타겟Ab말고 beta actin을 같이 하는 것은 이유가 무엇인가요? 그냥 actin이 가장 진하게 나와서 잘 됐는지 확인하는 용도인가요? 수준 낮은 질문 답해주셔서 감사합니다.

안녕하세요    WB 할떄 1차 , 2차 안티바디 구분하는 법이 어렵습니다. ㅜㅜ   항체, 항원에 대한 개념과 1차 2차에 대한 개념이 있다고 하기엔 부족하고 없다고 하기엔 있는거 같습니다. 1차 항체 : A라는 동물에 target 단백질을 주사해서 만든 Ab   - 2차 항체 : B라는 동물에 A라는 동물의 IgG를 주사해서 만든 IgG       어떤 원리로 어떤 방법으로 1차 2차를 붙히는지는 알겠지만  예를 들어 actin을 확인하고자 하면 1차 안티를 anti- actin antibody in Rabbit 이라고 하면 2차 항체로 Rabbit lgG (HRB) 를 쓰는데  그러면 1차에 Rabbit를 쓰고 2차를 goat를 쓰면 안되는건가요??   1차를 rabbit을 쓰면 2차도 rabbit을 써야하는지 아니면 goat를써도 되는건지에 대한 개념을 못잡겠어요 ㅜㅜ  매번 누구한테 이렇게 쓰면 되냐고 물어볼수도 없고 공부할수 있는 좋은 방법이 없을까요?