안녕하세요 RNA와 protein의 interaction을 보고자 RNA pull down assay 실험중입니다. 현재 RNA와 protein을 서로 reaction 시켜준 다음, non specific protein을 제거시키기위해 wash buffer(100mM KCl,20mM Tris...등등)로 wash를 하고있지만 non specificity가 제거되지 않는 것 같습니다. 이에 대한 트러블슈팅으로 salt의 농도를 다르게해주어서 문제 해결을 하려고하는데 Salt의 농도를 높여줘야할까요? 아니면 낮춰줘야할까요? (RNA-protein interaction은 hydrogen bond로 되어있어 이 결합을 단단하게 해주려면 ionic strength가 필요하다는 것까지 알고있습니다. 그래서 salt의 농도를 낮춰주면 정말 온전한 hydrogen bond를 이루고있는 protein만을 얻을 수 잇다고 생각되어지는데 맞나요?) 답변부탁드립니다 선배님들 ㅠㅠ!!!

안녕하세요, western blot을 갓 시작하여 많은 것에 대해 생소하여 질문드립니다.   사진과 같이 4번째 lane에 특정 부분이 사라져버리는 것은 어떤 단계에서 잘못이 된 걸까요?   첫 번째 실험에 밴드가 사라졌을 땐 transfer 단계에서 제대로 되지 않았다고 생각을 하였는데,   똑같은 sample로 실험을 한 번 더 해보아도 정확히 똑같은 자리가 비어있는 현상이 있습니다.   이러한 경우에는 어떤 점이 문제인지 아시는 분 혹시 계실까요?

전기 영동실험 결과인데,  restriction enzyme digest로 plasmid ligation process를 준비하는실험입니다. 이론상 lane2 3 4(pcr1 2 RE1)에 한개의 band만 생겨야되는데, 500~650 사이 band가 자꾸 생기는데 왜이러는걸까요? 사용한 restriction enzyme은 PCR product1&2에 붙지않는 enzyme인데 결과가 자꾸 이렇게나옵니다.. lane 2 3 4는 각각 PCR product1, PCR product2, PCR product 1&2가 들어있고 같은 restriction enzyme을 사용했습니다. 제생각에는 cDNA가 supercoiled 되는현상때문에 이렇게되는게 아닌가싶은데 원래 이정도로 band가 뚜렷하게 보이나요?

protease zymography를 하고있는 학생입니다.  실험을  끝내고 해석을 하려는데 결과가 이상한건지  제가 해석을 못하는건지 하여 질문을 드립니다. 효소5ul 10ul 15ul 열처리(10ul) 위의 사진이 결과이고 12% gel with 0.05% 카제인 0.75mm 두깨를 사용하여  로딩하였습니다. 개인적으로는  초반에활성을 보이다가 없어지는 것 같은데 일반 SDS-PAGE 상에서 같은 효소 로딩시 17-35kDa 사이에서 밴드가 확인되기에 그렇게 판단을 했습니다. 혹은 농도의 문제일까요?  비슷한 경험이 있으신분들이 있다면 도움을 주시면 감사드리겠습니다.    

보시다시피 ACTIN은 밴드가 이상없이 나왔는데 P-STAT3는 끌림현상이 나타납니다.. 이외에 T-STAT3도 같은 끌림이 나타나요..   둘다 sample 제작시 5X 양 동일했고 동일한 Gel에서 내렸습니다. 염색했을때도 끌림현상은 크게 나타나지않아서 전기영동때 문제는 아닌것 같고 아무래도 항체 교반시 문제가 생겼나 생각은 갖고 있는데 왜그런것일까요 ㅠㅠ??

제가 랩 이동을 하면서, 3주간의 공백이 있었고, 그 이후 cell sampling 부터 웨스턴 ECL 단계까지의 과정에서 뭔가가 치명적으로 잘못된건지 웨스턴이 되지않고있습니다. 처음엔 베타액틴만 나오고, 60kDa 대의 skim milk상에있던 full form 항체만 나오다가, 이젠 베타액틴마저 (pico ecl)50초이상은 지나야 진하게 나오게 됩니다. IP buffer + phosphatase inh + proteas inhi 쓰던걸 -> RIPA + phos inh + proteas inhi 로 바꾸었구요. 두 인히비터는 같은 브랜드이고, 정량시에도 브래드포드 같은 시약 씁니다. SdS 러닝 / 트랜스퍼 버퍼는 이전랩에서는 메뉴얼로 썼는데 지금은 회사꺼 10x쓰고있구요. 스킴밀크는 같은 브랜드 새제품입니다. 1.0mm / 8% gel Pvdf membrane 사용해서 289kDa , 60kda, 70,kda, 42kda(housekeeping) 봐 왔는데 이전엔 10ug 에도 잘 나오던 것이 40ug까지 올려도 안잡히네요.. 트랜스퍼는 이전랩에서 110v 1hr 하기도했고 2탱크시 0.8A 1hr 30min 했었는데 여기서 새로산 파워서플라이로는 0.35 1hr 30min, 100v 50min 하니 베타액틴도 힘겹게 잡히는거 같네요.. 혹시 새거가 파워가 더 센가싶어 넘어가나 보려고 pvdf 두장까지 넣어봤는데, 암페어에선 레더만 희미하게 두번째장에 보이긴하나 퐁슈했을땐 안나옵니다.. 풀폼들는 괜찮은거같은데 이사오면서 항체들이 부분적으로 상하기도 힘들지않나요ㅠㅠ 셀 시그널링입니다. 블로킹 1시간했네요. 두서없었는데 10번째 하고 있으니 멘붕이 와버렸습니다...

안녕하세요. 석사 1학기차 학생입니다. 사람 혈청을 이용하여 elisa를 하려고 하는데 target protein에 대한 민감도가 너무 낮아 한 번 농축을 시킨 후 elisa를 진행하고자 합니다. target protein의 크기는 25kDa입니다. 혈청을 농축시켜보신 분 있으신가요? 있으시다면 어떠한 방식으로 하셨나요? 검색을 하고 있는데 잘 안나오네요 ㅠㅠ

  안녕하세요. Western blot을 위해 protein 정량계산을 다시 확인해보고 있습니다만 이해가 가지 않는 부분이 있어 질문드립니다. 제가 배운 방법으로는 예를들어, RIPA로 lysis한 sample이 50ul가 있는 경우에  50/4(5x sample buffer 를 사용하기 때문에)=12.5ul의 sample buffer를 sample에 넣어주라고 배웠습니다만, 제가 다른 분들의 계산을 찾아본 바에는 이런 계산법이 잘 이해가 가지 않아 질문드립니다. 그러면 총 vol은 50+12.5=62.5ul가 되는데 이게 맞는 방법인가요..?아니면 제가 이해를 잘 못한걸까요....  그리고 BCA정량으로 protein이 3.61ug/ul이 나온 것이 계산되었고, 그래서 총 30ug을 로딩하고 싶기 때문에 30/3.61=8.28ul의 sample을 로딩하는 것이 제가 배운 방법입니다. 이 방법으로 했을때 다른 sample과 베타엑틴의 양이 너무 현저히 차이나서 고민끝에 질문드립니다.........    

안녕하세요. Bradford Assay 단백질 정량 방법이 맞는지 확인좀...   STD는 100 ug/ml stock을 이용하여 Final con. 0, 1 2, 4, 6, 8 ug을 만들어 사용합니다.  예를 들어 1ug의 STD일 경우 10 ul (STD 100 ug/mL)+ DW 790 ul+ Bradford 200 ul = total vol 1000 ul입니다.  이를 Well에 200 ul 로딩 한후  측정을합니다.    Sample의 경우 sample 1 ul+ DW 799 ul+ Bradford 200 ul를 넣은 후  200 ul를 well에 로딩하여 측정을합니다.    STD를 이용하여 수식을 얻은 후 sample의 경우 희석배수를 곱해줘야 하는데 얼마나 곱해줘야 하나요?? 1000을 곱해주는게 맞나요??

미생물에서 나온 조효소를 통해 protease zymography를 진행중인 학생입니다. 다만 활성이 보이지 않아 고민인데요... 프로토콜은 이렇습니다. 1. 12% gel with 0.05% casein 사용 activity staining  2. sample 30uL와 4X sample buffer 10uL 첨가  3. 로딩 (4℃ 냉장고에서 진행) 4. Staking gel에서 100V, separating gel에서 150V 5.증류수로 한번  씻어내고 0.1M Na-P + 1mM EDTA (pH 6.5) with 2% Triton 버퍼에 25분간 4번 slowly shacking (실온)  6.증류수로 씻어냄 7. 0.1M Na-P + 1mM EDTA (pH 6.5) buffer에 담궈서 37도 18h incubation  8. coomassie blue stain 후 destain buffer로 탈색시켰습니다.   조효소 샘플은 농축, 정제 후 사용하였습니다. 질문드리고자 하는 것은 일반 SDS-PAGE 상에서는 나오는 protease 밴드가 zymography를 하면  보이지 않습니다겔은  카제인이 첨가되지 않은 조성으로 진행시 잘 나와서 적어도 gel에는 문제가 없다고 생각이 됩니다.  일반 SDS-PAGE와  zymography 진행시 사용하는 버퍼는 같게 하여 버퍼에도 이상이 없다고 생각되는데.. 혹시 이러한 경험이  있으신 적 있으신가요?? 도움을 바랍니다. 설명:  투명한 부분은 상업용 효소입니다.    

  혹시 아시는분 있으시면 답변 부탁드립니다   구매 할려는데 제품 이름을 몰라서요  ㅠㅠ

안녕하세요 석사 1학기차 대학원생입니다. 웨스턴 관련한 질문입니다. 조직에서 protein을 extraction 하고 정량하고 나서 Extract 한 protein을 아예 샘플링을 한 상태로 끓여 보관하는 것이 좋다고 하여 샘플을 샘플버퍼 넣고 끓여 보관하려고 하는데요, 예를 들어 한개의 샘플 당 20번 로딩할 양을 끓여 보관한다 하면, 20개의 tube에 각각 끓여야 하나요? 아니면 하나에 tube에 전부  끓여놓고 보관해도 상관없을까요? heating block에서 끓일수 있는 tube의 갯수가 한정적이다보니 궁금해서 질문드립니다.    

4-15% gell에 양 쪽 끝(1,10)은 ladder, 2,3,4,5 번은 BSA를 넣었구요 6,7,8,9는 감마 글로빈을 넣었어요.. 200V로 로딩했고, 울상인 입모양으로 휘길래 버퍼 추가해줬더니 그나마 좀 일자로 내려왔더라구요 그런데 왜 갈수로 점점 넓게 퍼지고 가운데로 몰리는 현상이 생기는거죠?

안녕하세요. 웨스턴 블랏을 실험중인 대학원생입니다. 제가 보아야 할 단백질들의 사이즈가 사용하는 항체 회사의 데이터시트랑 다르게 나와서 질문드립니다. 제가 보는 단백질은 Cysteinyl leukotriene receptor 1이고 폴리클로날 안티바디를 사용하고 있으며 데이터시트상에서 사이즈는 38kDa입니다. 그런데 실험을 진행하면 보시다시피 38kDa이 아닌 45kDa 이상에서 밴드들이 나오며 제가 원하는 경향성의 밴드들은 75kDa에서 나왔습니다. 또한 Cysteinyl leukotriene receptor 2 단백질의 경우 동일 샘플을 로딩하였을 때 (같은 회사의 폴리클로날 안티바디를 사용) 데이터시트상의 사이즈인 39kDa에서 나옵니다. receptor1과 receptor2 둘의 사이즈가 차이가 많이 나는것도 이상하고, receptor1의 경우 데이터상에서의 사이즈가 나오지 않는 것이 궁금합니다. 샘플을 95도, 5분 cooking해서 만드는 데 receptor1에서 75kDa으로 나오는것으로 보아 receptor2에 비해 protein이 덜 잘려서 그런 것 아닐까?라는 생각도 듭니다.ㅠㅠ 어떻게 해야 receptor1의 사이즈를 데이터시트상에서 볼 수 있을까요...?

 안녕하세요 초짜 대학원생 입니다. 랩에서 10x TBST를 1X TBST로 dilution 하는데, tween 0.02%를 함유시켜 만들어 놓으라고 했습니다. 그런데 현재 랩에 있는 tween은 20%짜리인데 어떻게 계산해서 1X TBST 0.02% tween 을 만들 수 있는지 알려주세요.ㅠㅠ   total volume은 1L로 하려고 합니다.

cell에 lactogenic hormone을 induction하여 media에서 protein발현을 확인하는 실험을 할 예정입니다.   media를 회수해서 elisa실험을 먼저 진행하고 동일한 media에서 protein을 추출해 western을 진행할 예정인데요! elisa진행할 동안 media를 -80도나 -20도에 얼려놨다가 녹여서 protein추출후에 western해도 되나요?   media 얼리고 해동후에 실험해본적이 없어서 protein에 영향을 줄까봐 걱정입니다..!