western blot을 하고있는데 target protein antibody를 처리하는데 자꾸 albumin자리의 밴드가 나오고 있습니다. 제가 사용한 anti는 CD9, CD63입니다. 혹시 제 anti가 albumin에도 반응하는것인지 찾아보았지만 찾을 수 없어 이렇게 질문올립니다. 실험고수님들 도와주세요 ㅠ

PI3K의 downstream에 있는 PIP2, PIP3를 western blot으로 검출하고 싶습니다. lipid 계열이라 항체가 있을지 모르겠는데.. 검색해보면 나오긴 하는데.. 온통 human 용으로만 나오고, mouse는 없네요ㅜㅜ 혹시 마우스 샘플에서 PIP3를 웨스턴 블랏으로 검출으로 검출할 수 있는 항체를 아시는 분 계신다면, 알려주시면 감사드리겠습니다.

  transformation 관련 질문드립니다.   몇일전에 plasmid prep 한 걸로 transformation 을 진행하엿는데..   plasmid prep한 Sample 이  상태가 않조은지   colony수가 너무 적어서 재transformation 진행하려고 합니다.   혹시 전에 transformation후  incubate  후 60% glycerol+stock    -80 도씨 deep freezer 에 보관해둔 걸로 재transformation 진행해도 될까요??  

  위 논문에서 사용한 binding buffer의 조성은 methods에 나와있지 않아서 여쭤 봅니다   비슷한 실험을 진행하실 때  어떤 binding buffer를 사용 하시나요?

HaCaT Cell에서 c-Jun 발현 양상을 살펴본 웨스턴 결과입니다. 이렇게 주변부분이 다 한줄처럼 보이는 양상으로 나옵니다. 이런 현상이 전기영동시 갤이 터져서 단백질이 새어나오는 것이 원인일 수 있다는 글을 봤는데, 이 멤브레인을 스트리핑 해서 다른 팩터를 찍으면 또 잘 분리돼서 정상적으로 나옵니다. 1차 항체를 새로 희석해서 써봤는데도 이렇게만 나오면 1차항체 제품이 오래되거나 상태가 이상해진게 맞는걸까요? 항체가 워낙 비싸다보니 이거 하나 다시 찍자고 다시 사기도 참 애매하구 ㅎㅎ... 혹시 제가 잘못한 부분이 있다면 원인이나 점검해야할 점을 아시는 분 계실까요?

데이터분석 프로그램 CDNN이나 JASCO에서나온거 쓰는건 아는데 어디서 다운받나요?ㅠㅠ 아무리 찾아봐도 안나와서요ㅠㅠ

안녕하세요! 요새 웨스턴 연습 하고 있는 대학원생입니다.   바로 본론으로 들어가겠습니다. 저희 실험실은 웨스턴 전기영동 내릴 때 protein marker를 따로 만들어서 사용하는데 어떻게 만드는 지 잘 모르겠습니다 ㅜㅜ 혹시 다른 분들은 어떻게 사용 하시나요?!    4x랑 1x 중에 뭐로 희석을 해야하는지 잘 모르겠습니다.. 친절히 알려주시면 감사하겠습니다 ㅜㅜ

안녕하세요, 약물전달시스템을 연구하고 있는 대학원생입니다. solid lipid nanoparticle에 로딩된 커큐민(노란색) 물질의 양을 측정하기 위하여, sucrose gradient density centrifugation 방법을 사용하고 있습니다. 원심분리를 통해 로딩되지 않은 커큐민이 마이크로 튜브 아래로 가라앉히는데는 성공하였습니다. 로딩되지 않은 커큐민만을 정량해야해서, 셈플이 펠렛에 직접 닿지 않아야하는데 펠렛을 회수할 적절한 방법이 떠오르지 않습니다. 파이펫으로 위에 떠있는 셈플을 깔끔하게 딸 수도 없고, 아래의 펠렛만 회수하자니 파이펫에 셈플이 묻어나와 오차가 너무 클 것 같습니다.... 이런 경우에는 어떤 식으로 셈플을 회수해야하는지 조언 부탁드립니다.  

살려주세요... 몇날며칠 방법을 찾고있지만 도무지 답을 찾을 수 없어서 글 올립니다... 신생 랩실이라 여쭤볼 곳이 어디에도 없어요ㅠㅠ   RT-PCR로 발현을 확인하고자 하는 펩타이드 서열이 있어요. (Exendin-4) 39개 아미노산으로 이루어져 있는데요.. A,T,G,C로 이루어진 염기서열에 대한 정보도 갖고 있습니다   NCBI primer design tool에서 염기서열 입력하면 primer 몇 개가 뜨는데요, 문제는 이렇게 얻어진 primer들을 NCBI primer design tool에서 forward, reverse primer 입력하는 칸에 넣으면 Exendin-4라고 맞추지를 못해요...   다른 단백질의 프라이머를 똑같이 입력했을 때는 바로 그 단백질 이름을 맞추는데 Exendin-4는 그렇지 못하네요.. 도와주실 분 있으신가요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 해결해주시면 금전적으로 보상해드리고 싶을만큼 간절합니다.. 심지어 논문들도 다 뒤져보았는데 안 나와요ㅠㅠ  

GST를 붙이지 않은 단백질이 70kDa이고 GST를 붙였을때 96kDa라 한다면 GST-fusion protein을 SDS PAGE를 했을때 96kDa가 나오는게 맞는건가요?  GEL에는 96kDa가 아닌 70kDa가 나와서 헷갈리네요.. SDS PAGE를 하면서 GST tag가 떨어져 나올 수가 있나요? 아니면 다른 이유가 있을까요?  

안녕하세요 실험실에서 웨스턴 블랏 실험을 처음 셋팅하여 실험을 진행하고 있습니다. 근육 조직(qudriceps)을 이용하여 웨스턴 실험을 하고 있는데 밴드가 뜨지 않아서 조언을 구하고자 글을 올려봅니다. 근육 조직 100 mg + Ripa 1ml을 첨가하여 homogenizer로 파쇄한 뒤 15초간 3회 sonication 이후 4도씨 1시간동안 shaker에 incubation을 진행하였습니다. 그 이후에 centrifuge 12000 rpm에 15분하여 상등액을 취한 뒤, 상등액을 단백질 정량하여 5x dye solution을 첨가하여 5분간 끓인 후 10분간 ice에 보관하여 sampling을 진행하였습니다. 웨스턴은 일반적으로 진행하는 데로 진행하였는데 단백질양은 50ug에 맞추어 로딩하였고 70v 5분, 80v로 진행했습니다. transfer는 100v 120분으로 진행했습니다. 웨스턴 실험의 문제는 아니라고 판단되는게 GAPDH는 잘 잡힙니다. 그런데 PGC 1a와 SIRT1 등과 같은 하위 단계의 marker들이 나오지 않습니다. antibody에 맞는 위치(파란색칸)에서 나오는게 아니라 다른 위치에서 나옵니다. 웨스턴 고수님들의 조언이 필요합니다. 제발 도와주세요ㅠㅠ

안녕하세요 제가 이번에 학부 실험으로 단백질과의 결합을 실험하기 위해 GST-Pulldown assay를하고 SDS-PAGE를 했는데 결과 분석을 하는데에 있어서 헷갈리는게 있어서 질문 드립니다.  45kDa의 단백질1과 96kDa의 단백질2가 결합을 했다면, gel에 나오는 밴드는 두 단백질의 mass를 합한 141이 되어야하는건가요?  그게 아니라면 두 단백질이 결합을 했다는 사실은 어떻게 알 수 있는건가요?

논문을 서치하다가 궁금한 점이 생겨 질문을 올립니다 ㅜㅜ    논문에서 쓰여졌던 특정 항체의 data sheet에 들어가보니  predicted size : 22 kda  observed size : 22, 50 kda 라고 쓰여져 있었습니다.    그런데, 논문에서는 그 항체의 siRNA를 처리하여 발현을 보았을 때 22 kda의 band만 실려져 있었습니다.  22 kda 사이즈에서만 knock down이 되어도 되는 것인가요?   

다른 %의 Gel을 하나의 transfer 기계를 써서 하면 안 되는 이유가 따로 있을까요?? Gel 두께가 1mm, 0.75mm로 달라도 같은 %이면 같은 transfer 기계를 사용하는데, 오히려 두께가 다를 때 다른 transfer 기계를 사용해야하는 게 아닌가요? Transfer는 semi-dry 방식으로 하고 있습니다. 이유가 궁금합니다!

안녕하세요.  western 때문에 머리가 아픈 석사생입니다..   제가 western transfer가 계속 잘못되어서(우글우글하게 밴드가 나타남) 열 발생 문제로 생각해서 semi dry transfer로 진행했습니다. 이번에 semi dry transfer로 1hr, 15V로 진행했는데 다름이 아니라 3m paper에 ladder가 전달되어있네요. 3M paper에 ladder가 다 옮겨진 상태라고 해야하나요? membrane에도 ladder가 있긴합니다. 140kDa이라서 좀 길게 transfer를 했는데요, 짧게 진행해도 될까요? western transfer 고수님들 조언 부탁드립니다.!! 1) tank transfer할 때 나타나는 우글우글한 밴드는.. 도대체 왜그럴까요? 2개 샌드위치를 같이 진행해도 어떤건 잘 나오고 어떤건 우글우글합니다. 온도때문인가 싶어서 온도 조절도 탱크 안에도 콜드탱크 하나넣고, 탱크 바깥으로도 아이스를 덮어놓습니다..ㅠ_ㅠ 도대체 무엇이 문제일까요? 2) semi dry transfer를 할 시에는 몇 볼트조건으로 얼마나 진행하시는지 궁금합니다 !!   감사합니다!

안녕하세요 바쁘신데 제 글까지 읽어주셔서 감사합니다   다름이 아니라, 제가 실험하고 있는 주제에서 protein #1,#2가 Binding하는건 확인했는데 cis로 붙는지 trans로 붙는지 확인을 하고싶습니다 혹시 이걸 확인 할 수 있는 실험방법이 있을까요..?