안녕하세요  western blot을 진행했는데 detect 후에 band를 보니 band가 가운데가 비어 두겹처럼 나와있더라구요 ㅜㅠㅜㅠ   loading할때 intensity가 너무 높아서 빨리내리다보니 band 가운데가 비어있게 된걸까요 ? protei은 30ug, gel은 fastcast kit 사용했습니다    western 초보라 아직 data 해석에 미숙해서요 ㅠㅜ 아시는분 답변 부탁드립니다 ...    band 라인은 하나입니다 ,..!!    +)다른 gel의 band는 휘어지게 나왔는데 이 이유도 아실까요 ??  같은 gel이여도 휘어진 band랑 안휘어진 band랑 공존합니다 ㅜㅜ     >위에 첨부한 두 사진들의 결과는 모든과정을 동일하게 동시에 진행했으며, Ab만 다른아이들입니다 ㅜㅜ  

안녕하세요, 매번 검색만 하다가 처음 질문 남겨봅니다.  protein extraction을 하고 정량을 했는데 protein 농도가 터무니없이 적게, 거의 안 넣었다고 봐도 될 정도로 나왔습니다. 샘플마다 값도 너무 튀고요.. 동일한 조건으로 이전에 실험했을 땐 이정도로 적게 나오진 않았어서 매우 당황스럽습니다.. 제가 복기 해봤을 때 기존과 크게 다른 점이 없어서 너무 답답합니다. 앞으로 이 분야를 더 배우고 싶은데, 단백질 추출도 못하면 무슨 실험을 진행할 수 있겠나 싶어서 막막합니다. 제가 아직 학부생이라 부족한 점이 많습니다... 제가 한 실험 과정과 정량 후 결과값은 아래에 첨부해두었습니다. 잘 부탁드립니다. lung cancer cell 4*10^5으로 6well에 seeding >> 18h 후 80%정도 찬 것을 확인 후, 시료처리 >> 24h 후 protein extraction <extraction> 1. media suction 후 well당 cold DPBS 1mL로 washing >> suction후 cold DPBS를 well당 1mL씩 넣고 스크래퍼로 긁어준 뒤 따서 e-tube로. 3000rpm, 5min, 4℃ centrifuge ; 여기까지 진행했을 때 처리한 시료 농도가 높았던 샘플 하나(B3라고 하겠습니다)가 pellet이 안 보였습니다.   2. 상층액 suction 후 RIPA solution 넣고 강하게 피펫팅 >> 강하게 볼텍싱 >> ice에 꽂아놓고 20min incubating(5min 간격으로 강하게 볼텍싱 해줬습니다.) ; RIPA+P.I.+PMSF를 1:0.01:0.001로 섞어서 RIPA solution을 만들었고, 위에서 언급한 B3는 20uL로, B3를 제외한 나머지 샘플들은 80uL로 pellet을 풀어줬습니다.  피펫팅은 100uL짜리 피펫으로 거품이 날 정도로 세게 여러번(제 체감상으로는 한 40번정도 피펫팅한 것 같아요)했습니다.   3. 15000rpm, 20min, 4℃ centrifuge >> 상층액만 따서 새 e-tube에 넣기 ; centri 끝나고 나니까 첫 centrifuge 사용때보다는 줄었지만 pellet이 보였고, B3에서도 아주 조그만 pellet이 보였습니다.  상층액은 80uL로 푼 샘플들은 75uL, 20uL로 푼 샘플은 15uL정도 딸 수 있었습니다.   4. 정량 1, 2, 3, 4, 5는 standard A1~3, B1~3은 sample입니다.(A1, B1은 CTR)   1 2 3 4 5 A1 A2 A3 B1 B2 B3 DDW 18 14 10 6 2 18 18 18 18 18 18 RIPA 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0 sample 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 BSA 0 4 8 12 16 0 0 0 0 0 0 DC A 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 DC B 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800 단위 : uL 표와 같이 조합 후 볼텍싱해주고 상온에서 15min incubating >> 96well에 well당 200uL씩 넣고 750nm 흡광도 촬영   5. 계산 표 윗줄은 최근 실험 결과, 표 아랫줄은 이전 실험 결과입니다. R^2   A1(CTR) A2 A3 B1(CTR) B2 B3 0.9906 1uL당 농도 0.579531 0.265105 0.295931 1.424168 1.07275 0.172626 0.9902 1uL당 농도 1.005952 0.809524 0.815476 2.029762 1.863095 1.369048 현재 이런 상황입니다. 저희 랩실 사람들이 80uL로 풀었을 땐 대부분 람다당 농도가 1은 넘습니다. 저의 고민은 1. 왜 람다당 농도가 거의 0에 수렴하는가? 2. 왜 람다당 농도가 샘플마다 이렇게까지 차이가 나는가?(추출 전 육안으로 cell상태 확인했을 때 confluency랑 비례하지도 않음..) 이렇게 두 가지 입니다. 제발 문제점을 파악해서 잘 해결될 수 있으면 좋겠습니다..

Ni-NTA agarose (Qiagen)으로 protein purification하고 있는 대학원생입니다. 실험실에서 처음으로 재조합 후 단백질 발현을 하고 있는데 궁금한 점이 있어 올립니다. <protocol> 1. 200mL LB broth (AP100) OD600: 0.5-0.7 incubation 2. 0.1mM IPTG, 30℃, 150rpm, 6h induction 3. 원심분리 및 supernatant 제거 (-80℃ 보관) 4. 20mL lysis buffer (50mM NaH2PO4. 300mM NaCl, 10mM imidazole) 5. Lysozyme 1mg/mL incubate on ice for 30min 6. Sonication (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 30회) 7. 원심분리, supernatant 및 pellet 보관 8. Ni-NTA slurry 1mL 원심분리 및 supernatant 제거 9. 2mL lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl) mix (inverting) 10. 원심분리 및 supernatant 제거 11. 20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker) 12. lysate-Ni-NTA micture column으로 옮긴 후 bottom cap 제거하여 flow-thrugh 수집 13. 2.5mL washing buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole)로 2번 진행 및 수집 14. 0.5mL Elution buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole)로 4번 진행 및 수집 15. BCA assay, SDS-PAGE <질문> 1) 50mL culture로 sonicaiton (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 20회) 조건으로 충분히 파쇄되고 약간 투명해지는게 확인됐습니다. 하지만 200mL culture는 기존 조건으로는 덜 투명해져서 sonication 횟수를 30회로 늘렸는데 더 좋은 방법이 있을까요? 횟수가 늘어나면 좋지 않다고 들어서요.. (현미경으로 관찰하면서 cell 파쇄됐는지 추가로 확인하고 있습니다.) 2) SDS-PAGE 결과, Elution 쪽에 목표 단백질인 약 30kDa 외에도 여러 band가 떴습니다. 이에 교수님은 Ni-NTA에 protein을 붙이는 과정에서 잘못된거 아니냐고 하셨는데 '20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker)' 반응을 더 늘려야 할까요? 3) 약간 바보같은 질문일 수 있는데 혹시 protein genE size가 855bp인데 kDa으로 환산하면 30kDa이 맞을까요?.. 사이트랑 기존 계산법으로는 30kDa으로 나오는데 교수님은 70kDa이라고 하셔서요..

안녕하세요  BCA assay를 하기 위해 준비중입니다. BCA A 와 BCA B를 49:1의 비율이라고 할때 BCA A가 이 제품이 맞는지 확인부탁드립니다.  

안녕하세요. PD-10을 이용한 buffer exchange 관련해서 질문이 있습니다. 제가 protein을 주로 다루지 않고 화학분야라 처음해봐서 어려움이 많네요 ㅠㅠ 제가 할 것은 His tag protein의 조성이 실험에 영향을 주어 Buffer exchange를 하려고 합니다. 이때, PD-10 column이 제 실험에 적합할 것 같아 사용하려고 합니다. - Storage condition : 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 125 Mm imidazole, 50% Glycerol (v/v) - Exchange 후 condition : PBS   질문 : 1) Glycerol 50% (v/v)이 viscosity하여 column하는데에 영향을 줄 것 같아 dilutio해서 진행하려고 하는데 어느 정도 %로 할지 궁금합니다. 서치해보니 5~10% glycerol 정도는 PD-10 으로 가능할 것 같은데 기준 같은 것이 있을까요? 잘 분리되는지 여부는 small scale로 test를 해봐야 아는 걸까요?   2) Gravity protocol 에서 elution 단계에서 3.5 mL를 받는다고 적혀있는데 보통 하나의 test tube에 전부 받는지, 아니면 조금씩 (약 0.5 mL) 씩 나눠 받는지 궁금합니다. 또한, 3.5 mL 를 받고 나서 추가적으로 더 elution buffer를 넣어서 collection하진 않을까요? Protein이 다 나오지 않았을 수 도 있으니까요.   프로토콜 첨부하겠습니다. 도움주시면 감사하겠습니다. ㅠㅠ

4.8. Preparation of Cytosolic and Nuclear Extracts  Cells were treated and harvested as described above, lysed with hypotonic lysis buffer [25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulphonic acid (HEPES; pH 7.5), 5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, and 5 mM dithiothreitol (DTT)], and incubated for 15 min on ice. NP-40 (2.5%) was added and the cells were lysed for an additional 10 min. Nuclei were collected by centrifugation at 7500× g for 15 min at 4 ◦C. The supernatant was collected as the cytosolic fraction. Nuclear proteins were resuspended extraction buffer (10 mM HEPES, pH 7.9, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, and 0.2 mM DTT) and incubated for 20 min at 4 ◦C. Extracts were centrifuged at 16,000× g for 10 min, and protein levels were determined using a BCA protein assay kit (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) according to the manufacturer’s instructions. Both fractions were then used for Western blot analysis.   라고 나와있는데, 이처럼 세포질 내의 단백질을 추출하고, 핵 내의 단백질을 따로 따로 추출할 때, 이 때 사용되는 lysis buffer에 의해 핵막은 붕괴가 안 되는걸까요? 어떻게 선택적으로 같은 '인지질'에 영향을 주는 buffer 임에도 불구하고 핵막에 손상을 주지 않고 핵 내의 단백질을 얻을 수 있는지 원리가 궁금합니다!   좀 쉽게 상세히 설명해주시면 감사하겠습니다! 부탁드립니다!!

안녕하세요  WB 1차 2차 안티바디에 대해 아직 정확한 개념이 잡히지 않아서 글을 남기게 되었습니다. WB를 actin으로 단백질을 확인하고자 합니다.   1차 안티바디와 2차 안티바디를 사용하려고 하는데 이렇게 사용을 하면 되는지 확인부탁드립니다.   1차 안티바디는 rabbit 이며, 2차안티바디는 HRP rabbit입니다.   윗선배가 없는 상황이라 너무 기초적인부분을 올려서 죄송합니다. 이전 교수님께서 설명해주시기로는 HRP가 발광을 한다고 하셨던걸로 기억을 합니다. 그래서 2차 안티바디는 HRP가 적혀있는걸 사용해야 dectetion을 했을 때 band가 나온다고 하신걸로 기억합니다.    1차 안티바디     2차 안티바디

안녕하세요? 나름 Histag purification 고인물이라고 자처했는데,,, 아주 기초적인 부분에서 질문이 있어 남겨봅니다. 제 질문은 아래와 같습니다.   Elution 후 Ni와 결합한 Imidazole을 어떻게 제거하는가? PBS만으로 왜 제거 되는가?   저는 보통 Elution 후에 아예 Ni를 없애버리고, recharging 하는 방식을 썼었는데, 이게 Elution 후에 그냥 PBS로 washing만 하고 (Ni 유지), 다시 써도 되더라구요;;; 그렇다면 PBS washing이 Ni와 결합한 Imidazole을 고효율로 씻어내렸다는건데… 그게 가능한가요? Imidazole과 competition하는 내 histagged 단백질은, PBS washing에 끄떡없는데 말이죠? 혹시 소중한 지식 있으시면 나눔 부탁드립니다.   *참고) resin capacity는 거의 60 mg 이었고, 그거 다 잡고 PBS washing 후 flowthrough 30 mg정도 또 잡음. 그 외에도 엄청 많이 사용하는데 계속 됨;;

국내사 중에 HDX-MS 혹은 XL-MS를 통한 epitope mapping 하는 곳들이 있을 까요? 전문적으로 하는 곳 추천 받고 싶습니다.

대장균에서 발현/분리/정제한 단백질에 cy5.5 dye를 염색하는 것이 실험실에서 간단히 되는 일인가요?  지식도, 경험도 부족하고, 주변에서 본 것도 없어서 ㅜ.ㅠ 단백질에 염색한 후 마우스에 주입해서, 이 단백질이 어디로 가는지 보는 실험을 하려고 합니다. 일단 염색이 석사생 손에서 수월하게 뚝딱 되는 것인지가 궁금하고요, 또 염색이 잘 되면, 마우스에 들어가서도 하루-이틀 안깨지고(?) 잘 버티는지가 궁금합니다. 이건 케바케일 것 같아 꼭 답 안해주셔도 됩니다!

안녕하세요, 대학원 석사 과정 중에 있는 학생입니다. 제목에서처럼 western blot 진행 과정에서 transfer 전에는 marker가 잘 확인 되었고, transfer 후에 gel에는 없지만 membrane에서 marker가 확인되지 않아(정확히는 매우 연하게, 없다싶을 정도로), transfer가 잘 되지 않았다고 판단했습니다. 그래도 혹시 몰라 antibody를 붙여 확인해보았는데, beta-actin 기준 protein 밴드가 뚜렷하게 나타나서... 혹시 transfer 후에 marker는 사라졌으나 protein은 잘 옮겨가는 경우도 있나요? 제가 그 membrane과 똑같은 조건으로 다른 membrane도 동시에 실험 진행 중이었는데, 다른 membrane은 marker가 잘 확인 되었고, protein도 잘 나타났습니다. transfer buffer는 똑같은 것을 사용했기 때문에 문제가 없다고 생각하고, 한 기기에서 두 개의 transfer tank를 연결했기 때문에 기기의 문제라고 보기도 어렵다고 생각합니다. 전압은 100V, 100분으로 설정하였고, gel 농도는 10%입니다. 사진은 beta-actin이고, marker가 확인 된 것과 안 된 것 입니다.(동시에 진행된 membrane입니다.) 혹시 비슷한 경험과 원인, 조언 주시면 감사하겠습니다ㅜㅜ

안녕하세요.  저는 최근에 Extracellular vesicle 연구를 시작한 대학원생입니다.  EV의 isolation이후 ELISA로 CD63 단백질 발현을 확인하며 EV의 양을 가늠해 보고 있는데요.  문제는 ELISA 결과를 보면 같은 샘플에 대해서도 어떤 well은 반응이 뜨고 어떤 well은 뜨지 않으면서 편차가 굉장히 크다는 것입니다.  물론 손으로 실험 하다보면 당연히 편차는 생기는 것이겠지만 그 정도가 OD 기준으로 10배 가까이 발생하기도 합니다.  혹시 이런 경우 실험의 숙련도와 상관 없이 고려해봐야 하는 이슈가 뭐가 있는지 경험 많으신 분들께 여쭙니다.  감사합니다. 

안녕하세요, 저는 현재 A라는 eukaryotic protein을 E.coli에서 발현 중에 있습니다. A라는 protein을 insoluble하게 발현하여 activity가 있는 것을 확인했으며, A라는 Eukaryotic protein을 B라는 protein과 한 T7 promoter상에서 연결하여 발현 중에 있는데, 제가 원하는 site에서 보이지 않아 질문을 남겨봅니다. Vector는 pET28a(+)를 사용하여 N,C-ter 양쪽 모두 His-tag이 붙어있습니다. Induction condition은 16~37도 까지 Time 역시 바꿔가면서 Optimization을 모두 진행해보았는데 되질 않는 것 같습니다.  제가 Target으로 하는 예상 kDa는 62kDa인데, Induction후에 whole protein, pellet에는 예상 kDa부근에서 보이는데 Elution시에는 보이지 않고 30kDa부근에서 보입니다. Elution은 imidazole 250mM~300mM로 진행하였습니다. 따라서 protein이 insoluble하거나 His-tag 정제 시 문제가 있는 것 같아 보이는데, 해결이 되질 않습니다. 제가 놓친 부분이 있을까요? 참고로 loading 시 boiling도 하였고, 중간에 종결코돈도 없습니다. 아래 사진 첨부드립니다. 감사합니다.

안녕하세요  SDS-PAGE실험 중 궁금한게 생겨서 질문남깁니다.  이전에는 이런경우가 거의 없었는데 최근에 젤 러닝 후 염색하면 항상 레인 밖으로 번지듯이 내려오는게 보여서요  혹시 원인이 뭔지 아시는 분 있으신가요? 그리고 저렇게 내려온 경우 western blot 과정에서 문제가 생길 수 있나요?

cell에 IL-1b or LPS 처리 후 con에 비해 변화한 western blot band를 두고 선배들이 induction이 잘 된 것 같다고 설명하더라구요. induction과 expression의 차이가 있나요? cell에 IL-1b나 LPS를 처리하면 염증성 사이토카인등이 분비될 것이고.. 그럼 염증 마커들을 확인했을때 마커 두께가 두꺼워 질 것이고..그렇다면 발현이 증가한 것 아닌가요..? induction이라는게 정확히 이러한 실험에서 어떤 상황을 이야기하는 것일까요...?  

안녕하세요, 논문을 읽으면서 공부하고있는 대학생입니다. 다름이 아니라 논문을 읽으며 phosphomimetic mutant, phosphoinhibitory mutant 같은 용어가 많이 쓰이는것을보게 되었습니다. 그런데 논문을 읽으며 보니phosphomimetic 돌연변이가 있으면 인산화가 잘일어나지 않는다고 하는 것을 보게 되었는데요, 실험에서는 이 돌연변이가 이미 인산화되어있는 상태처럼?기능을 하는 것 같아서요ㅠㅠ 대체 이 두가지 돌연변이가 정확히 무엇인지 알 수 있을까요?