안녕하세요! 현재 RT-PCR을 배우고 있는 학생입니다. 다름이 아니라 RNA를 추출하고, Nano drop을 찍으면 항상 Nucleic acid conc가 적게 나와서 고민입니다.. 평균적으로 50ng/ul이 나오는 것 같은데 혹시 이런 상황일 때 RNA 추출에서 주의해야할 점이 있을까요? 프로토콜 그대로 하고있다고 생각하는데 항상 이 값이 적게나와 다음 cDNA 합성 단계를 진행하지 못하고 있습니다 ㅜㅜ.. 마지막 단계에서 원심분리를 하면 펠렛이 Ep tube에 확실히 보이긴 하는데 나노드롭만 찍으면 값이 낮게 나오더라구요 Trizol에서 세포를 강하게 피펫팅 하는 과정에서 기포가 많이 생겨서 그런건지 아니면 Trizol에서 너무 오래 처리를 해서 그러는지 ㅜㅜ 혹시 조언좀 구할 수 있을까요? 

  SARS-CoV-2의 spike protien을 Sanger sequencing을 통해 확인하고 있습니다.    one step RT-PCR kit(HyQ One step RT-PCR kit)를 이용해 cDNA 합성과 PCR까지 한번에 진행하고 있고, 전기영동 상에서 band가 뜨는 것을 확인 후sequencing을 업체에 의뢰하고 있습니다.    그런데 결과를 받아보면 여러개 sample 중 한두개씩 결과가 좋지 않네요ㅜㅜ    아래와 같이 comment를 받았습니다.    실험실에서 확인했을 때는 아래와 같이 band가 명확하게 확인되어 의뢰했는데 왜그럴까요..? (영동 사진의 4,5번이 sequencing 결과가 나오지 않았고, 나머지 sample은 sequencing 결과를 받았습니다.)      각각의 sample은 CT값을 기준으로 비슷한 정도의 것입니다.    10개 정도의 sample에서 한두개가 이렇게 튀니 속상하네요ㅜ   생각해볼 수 있는 원인이 뭐가 있을지 궁금합니다.

RNA extracion을 하기위해 6well plate에 시딩을 하였습니다. 시간이 없어서 빨리빨리하려는 마음에 셀 수를 많이 시딩하였고 15시간만에 70~80% 차서 starvation을 하였습니다.  seeding후 24시간뒤에 starvation하는 것과 15시간뒤에 starvation하는 것에 차이가 있나요? 저희는 starvation은 12시간하고 treatment는 24시간합니다.

안녕하세요. 저는 석사 과정 1학기 차 학생입니다. 저는 qPCR과 RNA in situ를 통해 mRNA level을 확인 중인데요, 둘의 결과가 다르게 나와 혼돈스러운 상태입니다. qPCR을 하기 위해 RNA extration 과정에서 실수가 있나 싶어 2번이나 새로 뽑아보고, primer도 sequence를 달리하여 여러 primer을 사용해보았는데도 RNA in situ 와 결과가 다릅니다 ㅠ  in situ probe의 양도 희석을 다양하게 하여 진행해보았지만 여전히 둘의 경향이 너무 달라 혼란스럽습니다.. 이러한 경험을 하신 분이 계실까요? 계시다면 조언 부탁드립니다!!ㅠㅠ 감사합니다~

석사 1년차 왕초보 실험자 입니다 ㅠㅠ 넙치 간에서 RNA 분리를 실시 하고 gDNA를 제거하는 과정후 전기영동 결과 입니다. 일단 결과는 RNA가 거의 다 분해되어 버렸다고 볼수 있는데 cDNA 합성 과정으로 넘어가면 안되고 다시 실시하는게 맞는 거겠죠...? gel 조성은 1%입니다. (첫번째 로딩은 DNA 마커로 그냥 한번 넣어본거라 무시하셔도 됩니다)

cDNA 합성 과정에서 RNA 순도 측정시  260 nm/280 nm ratio는 1.8~2.0, 260 nm/230 nm ratio는 2.0~2.2이 적당한것으로 알고있는데 저는 RNA 순도 측정시 두 비율 다 2.0~2.3 정도의 값이 나옵니다. 260/230 ratio는 적당한것 같은데 260/280 ratio는 2.0을 넘어도 괜찮은 값일까요?  비율이 낮으면 오염인것으로 알고있는데 더 높아져도 오염일까요??

Primer foward 293ul를 넣으면100uM이 되는데 10p mol농도로 만들어 주려면 몇배를 희석해야하나요? 293ul넣은후 100uM이 되면 1000배희석후 100nM이되고 난 후 100배 희석후 10pM로 만들어 주어야하는건가요? 아님 제품이 25nmol에서 10pmol로 만들어주려면 ->25000/10해서 2500ul넣어주면 10pM이 되는건가요?

실험실에서 이렇게 배워서 저는 이런 방법으로 DNase I을 처리했거든요. 근데.. 사용하는 DNase I (takara)의 protocol을 보면 제가 하는것과 protocol이 다르고, 또 저는 RNA 농도말고 volume으로 맞춰서 넣는데 이렇게 해도 되는건가요?? 위의 언급한 방식으로 DNase I을 처리하고 실험했을때 큰 문제가 없었고 DNA 분해가 되는 것 같습니다만...ㅠㅠ 틀린 protocol이라면 말씀 부탁드립니다.ㅠㅠ 

안녕하세요 선배님들 cDNA합성이 제목과같이 왜저렇게 보일링해주는이유가궁금합니다 ㅠㅠㅠㅠ 

안녕하세요! RT-PCR 진행중에 있습니다. RNA 순도 2.0으로 잘 뽑았구요 housekeeping gene도 one-band 확인했습니다. 다른 프라이머에 대한 밴드도 예쁘게 잘 뜨고 있는데 유독 하나의 프라이머에서만 끌림 현상이 보이고 있습니다. D.W 갈고 새로 만들어서 써보고도 있는데 완전히 잡히지 않습니다. template 문제이거나 PCR 시약 문제라 생각하기에도 다른 프라이머에서 잘 나오고 있고, 다른 실험자한테는 깔끔하게 나오고 있습니다. 결국 제 손의 문제인가 싶다가도 그 프라이머만 유독 그러니 혼란스럽네요... 혹시 제가 놓친 무언가가 있을까요? 주의점이라던지..부탁드리겠습니다! 감사합니다.  

식물 잎에서 rna추출후 바이러스 혼합 믹스프라이머로 pcr후 전기영동을 하였습니다 전기영동결과 밴드가 너무 끌리고 시료 로딩홀에서도 마커가 같이 나오고 있습니다 6번째 시료의 경우는 추출 자체가 안된것 같기도 하고요. 이분야 전공자가 아니다보니 원인이 너무 다양해서 어느 부분부터 손을 대야할지 좀 막막하네요

human APC유전자를 CRISPR Cas9을 하여  haplotype의 gene editing clone을 얻었습니다. 이렇게 했을 때, exon2가 skipping 될 것이라는 예측을 기반으로 RNA에서 cDNA를 만들어 target seq PCR하여 sanger를 돌렸는데 control과 차이가 나지 않습니다. skipping이 안된 것일까요? 아니면 haplo로 되어서 minor peak이 묻힌걸까요? 이런 경우 어떤식으로 splicing varient를 확인할 수 있을까요?

shRNA cloning 된 것을 주문해서 받아서 cell에 Transfection을 하였어요. qPCR을 돌려서 control하고 비교했을 때에, 발현이 줄지 않고 약간 과발현 된 듯이 나와서요.  PCR하는 primer를 새로 짜야하나 확인하면서, shRNA 서열 위치를 확인했어요.   coding sequence (CDS) 뒷부분에 shRNA 서열이 짜여져 있더라구요. 나름 TATA box를 포함하는데, 앞 부분이 조절하는 부분으로 배웠던 것 같아서;; 뒷 부분에 서열로 인식해서 조절하는지 궁금해요.     

안녕하세요! 현재 대학원생 입니다 cell trizol처리 후 cDNA 합성 과정에서 RNA 농도 측정결과 seeding에서 문제가 없었다면 모든 군에서 비슷한 정도의 농도가 측정되어야한다고 생각했는데 이번 RNA 농도 측정 결과 한 sample 군에서만 다른 군들보다 평균 100정도 낮은 농도로 측정되었습니다. 다른 군들은 3-400정도로 농도가 측정되었고 한 sample군만 200대에서 농도가 측정되었는데 이 경우 세포 독성으로 인해 세포가 죽어서 그런것일까요..? 한 군당 n수 4로 진행하였는데 4개 모두 200대에서 측정되어서 RNA 추출 과정에서 실수가 있다기보단 세포에서 문제가 있을것같다고 생각되는데 맞는지 궁금해서 질문합니다 세포 trizol 처리 전 눈으로 세포 관찰 시 세포 뜬 정도가 다 비슷했고 부착된 세포들의 상태가 괜찮아서 뒷단계로 실험 진행했습니다!

안녕하세요 ..! 이번에 처음 RT-PCR을 하게되어서 나노드롭을 찍었는데 RNA 측정값이 247.2ng/ul이 나왔습니다.  cDNA는 1ug, total volume은 14ul로 만들기 위해 D.W와 RNA 계산을 ( 1000/247.2 )-14 로 세웠는데, 2ul기준으로 만들었으니(?) 1000/(247.2*5)을 한다음에 14를 빼주는게 맞아서 최종적으로 RNA 8.09ul+ D.W 5.9ul 이라 하더라고요. 근데 아무리 생각해도 2ul 기준이라는게 뭔소리인지, 왜 5를 곱해줘야되는지를 모르겠어서 질문을 하게되었습니다 ㅜㅜ 제가 놓치고 있는 부분이 무엇인가요...? ㅜㅜ 

제가 찾아본 모든 프로토콜에서 첫 단계가 Trizol을 넣어주는 거였는데 Trizol 넣기 전에 media를 버려야하는 것인가요? 배양 중인 plate에서 rna를 뽑아낼 거라서.. 매우 기본적인 질문이긴 합니다만 주변에 물어볼 사람이 없어서 질문 남깁니다..

안녕하세요. 탈모관련 실험에 관하여 문의드립니다. human dermal papilla cell에 minoxidil을 10, 20 uM로 48시간 처리하여 growth factor들을 확인하였는데, reference와 달리 전혀 발현이 증가하지 않고 있습니다. 세포도 바꾸어보고, minoxidil 외에도 다른 positive control들을 농도별로 처리 하였는데, 해답을 구할 수 없어 문의드립니다.    

프로메가 SARS-CoV-2 Variant Panel- 8 Target 키트 프로토콜인데요 제가 처음 실험하는 초짜라 잘 몰라서요 ㅠㅠ HEX칸 또는 FAM칸 안에 있는 숫자들은 Ct를 의미하는 건가요? 숫자가 작을수록 사이클이 적게 돈거니까 농도가 높은거죠? No Ct는 샘플에서 해당 variant가 발견되지 않았다는 의미인거죠?  

안녕하세요, 고등학생입니다 학교에서 남은 pcr검사기를 이용해서 어떤 실험을 할수있을지 간단한 조언이나 의견이라도 알려주실수 있을까요?  

dsRNA를 denaturation 시키고 Roche kit로 5', 3' RACE를 진행하고 있습니다. 5'쪽은 여러번 sequencing 보내서 컨펌한 상황이고 3'에는 끝쪽에 18bp 정도 A로만 이루어진 구간이 있는데 그래서 그런지 sequencing을 보내면 몇개가 없거나 몇개가 많거나 아니면 저 부분에 프라이머가 달라붙어서 끝까지 증폭이 안 되고 있습니다. 이런 경우 어떻게 하면 성공시킬 수 있을까요,,, 거의 반년도 넘게 끙끙거리고 있네요ㅜㅜ 도와주세요 ㅜㅜ