안녕하세요  최근에 랩실을 옮겼는데 이 곳에서의 cryosection protocol이 제가 알던 것과 달라서 질문 해봅니다.   sucrose 15%, 30%로 dehydration 시키는 것 까지는 똑같습니다.   그런데, 원래 저는 dehydration 시킨 샘플을 바로 oct compound에 embedding 했습니다. 그 후 deepfreezer에서 O/N 하여 section을 진행했습니다.   이 곳의 protocol에는 dehydration후, OCT-PBS 1:1 용액에서 1hr, 100% OCT compound 용액애서 1hr 및 O/N 하라고 되어있습니다. 그 이후에 액체질소로 샘플을 얼리라고 합니다.   얼리기 전에 OCT compound에 넣어 두는 이유가 무엇인가요?    

Wwstern blot 실험 transfer 를 하는 과정 중에서 iBlot 2 Dry Blotting System 기기를 사용했는데 기기를 실행 시작하였는데 초반에 바로 취소 실수로 눌렀습니다...3v말고 잘못 선택한줄 알고ㅠㅠㅜㅜㅜ.... 그래서 transfer Stack 새로 뜯어서 넣고 다시 원래했던 겔로 넣어서 transfer 수행했는데 문제가 있을까요...?

PBST (Wash Buffer)와 Blocking Buffer 인데 유기산인지 무기산인지 ㅠㅠ 이 외에도 있긴한데 잘 모르겠네요 혹시 무엇인지 알려주실수 있을까요.?

western blot할때 PBST를 조제를 하려고 하면 PBS와 tween 20를 넣어서 조제 하자나요..?? 만약 500ml을 조제 한다고 치면 tween 을 5ml 넣고 나머지는 PBS로 희석하는데 제가 실수로 5ml 를 정확하게 안 넣은것같아요... 실험결과에 문제가 될까요ㅠㅠㅠ....??? 이걸 이용해서 다른것도 조제 해야하는데 실험 결과에 영향이 갈까요...????ㅠㅠㅜㅜ

안녕하세요. 저는 석사과정 학생입니다. 저희 실험방은 노던을 주로 하는데요. membrane에 방산선동위원소로 label한 프로브를 hybridization 시켜서 film에 casset안에서 노출시킵니다. 근데 저희 실험방에서는 항상 membrane이랑 film이랑 카제트에 넣은뒤에 딥프리저(-70ºC)에서 노출을 시키거든요. 시간은 시그널에 따라서 overnight하기도 하고 몇시간만 하기도 합니다.   근데 왜 딥프리저에서 노출을 하는지 선배들이 아무도 모르더라구요 ..? 검색해봐도 exposure 관련하여 온도에 대해 고찰하는 경우는 또 거의 없다싶이 하구요 .. 단순히 어두워서 그런건가? 라고 하기에는 차라리 암실에 그대로 두는게 더 낳을거 같고... 또 western 할때는 전부 상온에서 expose하잖아요 ;;  이게 특별히 이유없이 그냥 실험방 관례라서 다들 그렇게 하는걸까요?? 친구는 뭐 '샘플이 더이상 reaction 못하게 하는거다!' 라고 하는데 .. 젤 내리기전에 샘플들 inactivation 충분히 시키는데 이게 뭔소린가 싶기도 하구요.   아시는 분 있을까요?

안녕하세요. 저는 노던을 요새 배우고 있는데요 .. 실험방에 set up 되있는 방법은 .. capilary 방법을 통해 하고 있습니다.  사실 예전에는 노던의 원리만 대강 알았지.. 실험적으로 처음 접했을때 buffer의 이동을 따라 블로팅한다는게 참 충격이었습니다 ..  그래서 궁금점이 생기는데,  노던은 웨스턴과 달리 capilary 방법이 major한 이유가 있나요 ? 단순한 생각으로는 뚜렷하게 (-) charge를 띄는 RNA를 전기로 이동시키는게 훨씬 간단하고 빨라보이거든요. 그런데도 전기를 사용하는 protocol이 오히려 훨씬 제한적이고 많이 안쓰이더라구요 .. 뭔가 RNA에 미치는 영향이라도 있는건가요? 반대로 웨스턴은 capilary 방법으로 transfer가 안되나요 ?? western 만큼은 전기를 안쓰는 곳을 본적이 없네요 ..    참 단순한 의문점인데 .. 궁금하네요 ㅎㅎ 답변주실분 계실까요 ?

오랜기간동안 Northern blot을 수행하고있습니다.Knockdown을 하여 감소된 패턴으로 specific한 band를 detection하였지만 size가 맞지않네여....novel gene size를 알기위해 Northern을 진행하고있는터라 size확인이 절실한 상황이네요제 추측으론 RNA denature 문제, 또는 DNA ladder(rRNA size는 젤 확인상 size 일치)를 쓰고있는데 이것이문제인듯해보이기도 하고요..RNA denature 강화하기 위한 방법과 또 다른 문제가 있을거라고 생각하시는 분 계신가요??있으면 좋은 조언 부탁드립니다. 감사합니다.

늘 RNA 추출에 애를 먹다가 이번에 흡광도를 측정했는데 순도도 그렇고 괜찮게 나왔더군요.(순도는 1.7~1.8, A260 값이 0.1~0.2 정도 나왔습니다.)늘 순도가 1.5 이렇게 나왔는데 이번엔 꾀 순도가 좋은 RNA를 얻었겠구나 싶었는데막상 formaldehyde gel에 영동을 했더니... RNA가 아예 없습니다.영동하면서 생긴 문제 때문일까요... 아님 원래부터가 아예 없었는데흡광도와 순도가 그렇게 나온것일까요...

transfection 할때 siRNA+Lipofectamin+Opti Mem을 사용 하였는데요well 에 cell 들이 뭉친상태로 하곤 했는데 단계를 착각하여실수로 분리한다음 저 혼합액을 넣었거든요 괜찮을까요 ??현미경으로 확인해보니까 확실히 colony 에서 detach 되서세포들의 둥근 형태가 보이던데요

RNA prep하고, gel 내렸습니다 아래에 잡밴드들이 많은데 Northern 진행해도 될까요? 없애려면 어떻게 해야 하나요 ㅜㅜ 뭐가 문제인거지

특정세포에서 염증환경을 유도 후 사이토카인의 발현을 확인하는 실험을 진행중인데요예전에 프라이머리 세포에서 PCR조건을 잡았던 gene이셀라인 세포를 이용해서 PCR진행했더니 밴드가 뜨질않아요..세포마다 발현정도차이가 있거나 PCR조건이 다를 수 있다는건 알지만여러가지 조건으로 다 돌려봐도 전부 no-band의 결과가 나오네요..다른 사이토카인들도 안나오면 염증환경이 유도되지않았거나세포자체에서 사이토카인 발현이 안나오는거라고 생각 할 수도 있겠지만다른 사이토카인들은 잘 나오는데 IL-1b만 밴드가 뜨지않아서.....IL-1b가 특정세포에서만 발현이 되는 gene도 아닌데 이런 결과가 나올 수 있나요??혹시 프라이머가 이상해서 그런거라면 프라이머 짤 때 어떤 실수를 해서 이런 결과가 나오게 된건지 궁금합니다........아시는분 계시면 답변 부탁드릴게요ㅠㅠ!!

Rna정량을 해서 northern blot을 하고있습니다.정량후 동일한 ng을 loading하였는데 Band굵기가 달라서 굵기와 밝기를 조절하고 있는데요..(참고로 260/280이 2.1로 거의 동일합니다)Sample을 500ng으로 희석하고 sample마다 다른 양을 따서 로딩했는데요(2ul, 1.8ul, 1.7ul ...) 이렇게되면 밴드 굵기와 밝기는 같지만 노던할때 동일한양을 로딩하지않아 분석할수없다고 생각되는데요밴드 굵기와 진하기?를 일정하게 맞춰서 로딩해도 분석이 가능한가요?

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안녕하세요TG mouse에서 EGFP에 대해 northern blot을 진행하려고 하는데probe를 만들어야합니다.일반적으로 probe를 만들 때, gDNA에서 GFP primer로 PCR한 샘플로 probe를 만들어도 되나요?TG mouse 조직에서 mRNA를 추출, cDNA를 합성하여 이 cDNA를 가지고 PCR를 실시(RT-PCR)하여 probe를 만들어야하나요?또한 probe test라는 것을 실시하는 것으로 아는데, 대략적으로 이 test를 어떻게 실시하는지 아무리 검색해도 나오지 않아서요 ㅠㅠ부탁드립니다 ㅠㅠ아 probe는 DIG KIT를 이용할 예정입니다!

northern blot을 할 때 probe에 biotin을 붙여서 진행하면 non-radioactive method가 되는지?또한 어떤 방법으로 RNA를 찾아내는 지?궁금하네요 고수님들의 답변 기다립니다.

노던실험을 진행하고 있습니다.probe는 PCR products, RI 사용하고 있고 size는 약 500nt 정도 됩니다.loading control로 GAPDH 사용하고 있습니다. interesting target RNA는 4000,8000nt 입니다.같은 실험 조건으로 한 결과 GAPDH는 정확한 size가 나왔지만 4000과 8000nt 의 RNA는 같은 패턴으로 unspecific band 3개가 나타나고 있으며 이 size는 당연히 28s 18s RNA가 아니고요pre-hyb,hyb 온도 65~68도 까지 해봤고 워싱 충분히 진행했어여. 혹시 total RNA 중 제법 큰사이즈의 RNA가 denaturing이 잘 되지 않아서 일까 생각되어 denaturing에 관여하는 formamide의 비중이 높은 RNA loading dye를 지금 진행하고 있습니다. 문제점이 정확히 뭔지 도저히 모르겠네요. 훌륭하신 우리 인재님들 답변좀 부탁드려요 ㅠㅠㅠ

처음 논문을 보고 있는데 figure 이해가 안되서 질문드립니다검색해보니 SAOS2 cell 은 p53에 발현이 없는 세포로 나와있었는데노던블러팅의 결과를보면 ... saos-2-p53 라고 나와있길래 질문드립니다.SAOS2-p53 은 무슨 의미인가요?  

GAPDH PCR한 사진입니다. DNA가 쭉 끌리게 나온것 같은데요뭐가 잘못인지 잘모르겠네요RNA는 trizol뽑고 인트론 원스텝 키트를 이용하여 cDNA합성 및 Premix을 한 후 PCR을 하였습니다시료는 세포이구요...그리고 궁금한게 하나더 있는데요 셀양에 비하여 DNA가 뽑히는양이 적은것 같아요..답답하네요 도와주세요

확인용으로만 사용할건데요.TAE+agarose gel 사용해도 된나요?그럼 버퍼도 그냥 TAE 사용하면 되는거죠? 이때 TAE 희석시 DEPC-W 꼭 써야하는지..그리고 어떤분은 1마이크로그람만 걸어도 된다하시고 어떤분은 20은 걸어야한다고 하시는데.. mRNA loading 양을 보통 몇으로 해야 깨끗하게 잘 보이나요?

확인용으로 gel을 내려봤는데,사선으로 내려온건.. 젤이 자꾸 움직이는 바람에 그런거고..너무 스미어한데, 10μg 으로 너무 많이 loading 해서 그런건가요?그리고 loading buffer 를 아래와 같이 만들어 65도 heating 후 사용했는데..loading buffer 가 이상한가요?도와주세요! RNA loading buffer (sample buffer) 37% formaldehyde   5.25 μl Formamide   15 μl 10X MOPS   4 μl RNA 15 μg 7.5 μl