안녕하세요, miRNA에 대한 연구를 진행하고자 하는 석사과정중인 학생입니다. 현재 miRNA를 이용한 biosensor에 대한 연구를 하려고 하는데, biosensor를 할 때 miRNA를 농도별로 확인을 하는 과정이 있었습니다. 그래서 miRNA의 농도를 어떻게 구하는지 궁금해져서 논문들을 확인해보았는데, total miRNA의 농도를 확인할 때 이용한 kit들은 많이 소개를 해주고 있지만 특정 miRNA의 농도를 구하는 법은 딱히 언급해주지 않더라고요..! 그래도 표준 물질 첨가법을 이용하여 농도를 확인할 수 있다는 것을 확인했는데, 이를 제외하고 어떤 방법이 있는지 궁금해서 글을 남기게 되었습니다. 감사합니다!

miRNA inhibitor를 회사에서 파는게 있고 논문을 읽다보니 주문해서 제작한 방법이 있던데요 회사에서 파는 inhibitor는 제가 억제할 miRNA sequence에 specific 한 sequence로 miRNA inhibitor를 파는 반면에  논문에서 주로 많이 사용하는 miRNA inhibitor sequence는 miRNA sequence와 중간 중간 서열이 다릅니다.    siRNA와 달리 miRNA 억제할 때는 sequence와 맞지 않아도 억제가 잘 되는 건가요?

hTERT를 siRNA를 통해 활성을 억제하여 암을 치료하기 위해 drug로써 사용하기 위해서 투여하면 암세포 말고 줄기세포등의 다른세포들도 텔로머레이스 활성이 억제되지 않을까하는 생각이 들어 질문드립니다. 

많은 종류의 암이 텔로머레이스의 비정상적인 활성으로 인해 무한히 증식으로 생겨나는데 그럼 텔로머레이스가 제 역할을 할 수 없도록 siRNA로 처리하는 방식으로 암을 치료하는 것이가능할까요?

TaqMan 실험을 처음해봅니다...! TaqMan® MicroRNA Assays 제품만 구매하면 cDNA 합성하고 qPCR도 할 수 있는건가요?

miRNA에 대해 공부하고있는데 궁금한 사항이 있어 글남겨봅니다   miRNA가 mRNA와 관련이 있다는것은 알겠는데 miRNA가 어떤 RNA에게 영향을 미치면 그 miRNA 의 -3p나 -5p도 같은 영향을 미친다고 봐도 되는지 궁금합니다.   예를들어 miR-1 이 특정 A라는 유전자의 발현과 관련이 있으면 miR-1-3p나 miR-1-5p도 A의 유전자 발현에 영향을 미치나요?   아무리 찾아봐도 잘 모르겠어서 혹시 참고할 자료라도 알려주신다면  열심히 공부하겠습니다   감사합니다.

안녕하세요. 최근 siRNA실험을 진행하고 있는 대학원생입니다.   siRNA 프로토콜을 열심히 숙지하고, siRNA에 대해서 공부하면서 처음으로 siRNA실험을 진행하고 있습니다만, Transfection이 잘 안되고 있습니다.   실험 초반, Gene Down이 된 것을 확인하고, 이 후 실험에서는 계속 Gene Down이 잘 되지않아 처음에는 siRNA의 실험을 자주하면서 활성도가 떨어졌을거라 가정도 했지만 제 실험방법에 문제가 있을 것 같다고도 생각하면서 브릭에 계신 연구원 선생님들의 지혜를 꼭 구하고 싶어서 이렇게 글을 씁니다. 내용이 길고 복잡하더라도, 도움주시면 저도 꼭 훌륭한 연구자가 돼서 많은 도움을 줄 수 있는 선배 연구자가 되겠습니다.   제가 사용하는 siRNA Protocol 입니다.  siRNA Protocol내용 중 1.Prepare the following solutions: Solution A: For each transfection, dilute 2-8 µl of siRNA duplex (i.e. 0.25-1 µg or 20-80 pmols siRNA) into 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868. 항목을 수행하기 위해   Target Gene에 대한 siRNA 시약(siRNA duplex)을 구매했고, Data sheet에 나와있는 Resuspension을 참고하여 [Resuspend lyophilized siRNA duplex in 330 µl of the RNAse-free water provided. Resuspension of the siRNA duplex in 330 µl of RNAse-free water makes a 10 µM solution in a 10 µM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA buffered solution] <- (Target siRNA Data sheet내용) 설명서대로 구매한 Target siRNA 파우더에 함께 제공된 RNAse-free water 330 µl를 넣었습니다. 그 후, siRNA Protocol을 참고하여 위에서 만든, siRNA duplex 8 µl를 따서 siRNA Transfection Medium: sc-36868 100 µl에 섞었습니다.   2.Solution B: For each transfection, dilute 2-8 µl of siRNA Transfection Reagent: sc-29528 into 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868. Peak activity should be at about 6 µl siRNA Transfection Reagent. 항목을 수행하기 위해 siRNA Transfection Reagent: sc-29528를 구매하여 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868에 8 µl를 따서 섞었습니다.   3. Add the siRNA duplex solution (Solution A) directly to the dilute Transfection Reagent (Solution B) using a pipette. Mix gently by pipetting the solution up and down and incubate the mixture 15-45 minutes at room temperature. 3번 항목을 수행하기 위해   1번과 2번에서 만든 시약을 섞고 30분동안 상온에서 반응했습니다.   혹 제가 놓치고 있는 부분이나  잘못된 방법이 있다면, 선생님들의 지혜를 구하고 싶습니다. 다른분들도 도움이 될 수 있기에 글 삭제 안하겠습니다!   siRNA_Protocol도 첨부하였습니다.  

  ㅜㅜ siRNA 로 transfection 시간당 농도당 해도 단백질 억제가 안되네요  (다른 단백질은 잘해왔는데 이번에 새로하는게 문제예요)   그래서 교수님이 shRNA를 해보는게 어떻냐 하시는데.......  실험실 안전등급이 virus 사용이 안되는 등급이라......    shRNA는 보통 lentivirul particle 이지 않나요?  그냥 shRNA vector를 넣어 단백질발현 억제가 가능한가요?       

이렇게 특정 sequence의 microRNA 에 붙어서 형광을 발광하는  molecular beacon이 주문 제작 가능한 국내기업 있으시면 정보 부탁드립니다. 감사합니다.  

안녕하세요.    핵산쪽에 관련하여 연구하고 있는 중 조언을 구하고자 글 올립니다.   준비한 핵산에서 예를들면 TTTTT(6)개 에서 TTTTT(5)   로 뉴클레오타이드 하나의 차이를 구별할 수 있는 분석법이 있을까요??   GEL로는 분자량이 너무 낮아서 힘들것 같고, 현재 MALDI-TOF 방법을 생각하고 있는데, 다른 적절한 방법이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.

안녕하세요... 계산이 너무 어려워 질문 드립니다. 친절하게 답변 부탁드려요ㅜㅜ   siRNA 시험 하려고 하는데 20nmole stock 이 있는데 50nmole 로 실험을 진행해야합니다 이때 얼마를 넣어야 하는건지 계산을 못하겠어요ㅜㅜ 계산식도 알려주시면 감사하겠습니다.ㅠㅠ   *저는 100mm dish 사용 예정입니다.

Small RNA-Seq을 회사에 의뢰했는데 Library에 dimer가 섞여서 library 제작이 실패했다는 답변을 받았습니다. 이 말이 잘 이해가 안되서 그런데 설명해주실 수 있으신가요..?

안녕하세요~ miRNA mimic으로 transfection을 통해 qrt-PCR로 발현확인 후,다른 protein과의 발현여부를 확인하고 있습니다.  transfection 전 mi rna 추출과정에서, nano drop으로 측정한  rna 순도가 지금까지 한 실험 중 가장 높은 농도는 7~80ng이었습니다. 지금까지 반복실험을 4번정도 진행하였는데 평균적으로 50정도됩니다.  RNA 농도를 더 높여보려고 pellet양을 늘리는 방향으로 진행중인데,  혹시 transfection농도가 잘못되었거나, 다른 이유로 인해 RNA 농도가 매번 적게 나오는 건지 고민입니다.  보통 1000으로 나눠주는반면, 200-500으로 값을 계산해준뒤 희석하여 사용하였습니다.  Transfection 조건은 이러합니다. 60파이 plate Media 2ml miRNA mimics 20nM로 희석해준 용액에서 3.75 마이크로리터 따서 R buffer와 희석. (37.5nM(저희실험실에서 일반적으로 계산해서 하는 효율적인 Transfection농도)) cell 양은 1.5*10^6 이나, 1*10^6으로  transfection 진행하였습니다. 현미경으로 본 cell 수는 거의 90퍼센트 정도되었는데, 막상 pellet을 모아보니 다른 cell에 비해  확실히 적은 느낌이 듭니다. MCF7 자체가 그런건가요 ?   

완전 초보 실험자입니다ㅜ affymetrix에 의뢰해서 miRNA microarray를 진행하고 분석결과를 받았는데요.. 기존의 문헌에서 의미있다고 보고된 miRNA들은 하나도 제대로 검출이 안됐는데 이게 이럴 수도 있는 건가요? 분석결과를 믿어도 되는건지 대체 어떤 과정이 잘못됐길래 이런건가요? ㅜ 혹시 이런 경험 있으신 분들 조언 부탁드립니다. 그리고 microarray에서 의밌게 나온 miRNA들은 RT-PCR로 반드시 verification해야하는게 맞는지요? RC-PCR은 업체에 맡겨서 하나요? 아니면 그냥 실험실에서 자체적으로 할 수 있는건가요? 경험있는 선생님들의 조언 부탁드립니다 ㅠㅠ

안녀하세요 miRNA 실험을 준비하는 대학원생입니다.  저는 miRNA 발현을 확인하는 real-time PCR을 진행하려 하는데,  보통 mRNA로 real-time PCR을 하면 primer sequence로 주문해서 사용했었는데 miRNA primer sequence도 같은 방법으로 주문하면 되는건가요??  단지 primer를 짧게 주문하면 그게 miRNA가 되는건지,  아니면 miRNA 전용으로 primer를 따로 합성하는지 궁금합니다. ㅠ 답변 감사드리겠습니다 ㅠㅠ

몇주동안 세포에 물질처리를 하고 물질처리>cDNA합성> rtpcr지 반복실험을 하고잇는데요. 문제는 분명 같은 조건으로 같은 실험을 했다 생각했는데 결과가 다릅니다 예를들어 특정 값이 튀거나 mock이 물질처리한만큼 낙다운이 되거나... 이번실험에선 특히 과정의 전체적으로 파이펫팅도 '많이 골고루' 해주었고 파이펫 팁 끝에 남은것도 모조리 잘 분주한것 같은데 결과가 튀었습니다. 그래서 더더욱 이상한것입니다... 혹시 어느부분에서는 파이펫팅을 해주면 안된다 이런게 있었을까요? 시약, 프라이머 믹스처, qPCR 정량 등등 혹시몰라 일일이 파이펫팅도 해줬는데 ㅠ 지나친 파이펫팅도 문제요인인지 궁금합니다 ..