RNA 추출하는 과정에서 chloroform 넣고  4도에서 원심 돌렸는데 일부 샘플에서 투명층이 분리가 안되고 하얗게 gel 처럼 굳어버리네요... 샘플은 혈액입니다.  원인과 해결방법 아시는 분 있을까요?

RNA 추출을 하고 있는데 뭘 해도 안되고 DEPC treated water로 사용하는 모든 기구들을 소독을 해도 안돼서 너무 힘들어서 글 남깁니다.. 제가 stool suspension(대변 현탁액)에 있는 노로 바이러스에서 RNA 추출을 해야 하는데 계속 되지 않아서 기구 소독에 신경을 많이 썼는데요. 너무 안되니까 이제 샘플에 문제가 있지는 않을까라는 생각이 조심스럽게 듭니다. 바이러스가 생존을 하려면 숙주가 있어야 하는데 제가 받는 샘플은 어떠한 동물 세포나 조직에 배양된 바이러스가 아니라 그냥 stool suspension에 있는 바이러스이거든요. 저는 이 stool suspension을 다른 곳에서 아이스팩에 동봉된 상태로 보낸 곳에서 보낸지 3시간 만에 받아 바로 -80도에 aliquot해서 보관을 했었습니다. 하지만 제가 받은 샘플의 경우 조직이나 세포에 배양된 바이러스가 아니다 보니 바이러스가 쉽게 죽지 않을까 생각도 해봤는데 교수님께서 stool suspension에서 바이러스 상태로 RNA 추출를 추출하는 거고 RNA 자체를 받은 게 아니라 샘플에는 절대 문제가 없다고 하시는데 정말 바이러스 샘플에는 문제가 있을 가능성이 없을까요..?

안녕하세요. RNA 추출 관련해서 궁금한 점이 있어 댓글남깁니다. 먼저 두서없이 긴 질문 드린 점 죄송합니다. 현재 RNA 추출을 해야하는데, RNA 추출이 실험의 처음 단계이고 이걸 넘어가야 다음 단계를 넘어갈 수 있는데 몇 번을 해봐도 절대 나오지 않는 난황을 겪고 있지만, 실험실에 RNA 추출하시는 분이 현재는 계시지 않아 도움을 요청할 곳이 없어 너무 힘들어 도움 요청해봅니다.. 제가 지금 stool suspension에서 RNA를 추출하고 있는데 몇 번을 해봐도 항상 RNA 추출이 안되더라구요.. Nanodrop 측정 결과 A260/A28은 3부근이 나오고, A260/A230은 0.19부근이 나옵니다. 또한 agarose gel로 측정했을 때도 밴드가 보이지 않습니다. agarose gel의 경우, RNA가 600bp가 넘으면 agarose gel로도 확인이 가능하다고 하여 일반 DNA agarose gel 만드는 방식으로 만들었으며, loading은 RNA(측정결과 110 ng/uL) 1uL, 6x loading dye 1uL, DEPC treated water 1uL를 섞어 loading하였습니다. Nanodrop 결과와 agarose gel 결과를 통해 RNA가 깨졌거나 아예 추출되지 않았다는 것을 알게 되었는데 실험 과정 중 어떤 부분이 문제일지 여쭙고 싶습니다. 먼저 사용하는 샘플인 stool suspension은 다른 연구실에서 받은 것으로, 10^6 pfu/mL의 농도를 가졌으며, 전처리 후 filter까지 내린 액체 상태의 샘플을 보낸 기준으로 3시간 후에 받아 바로 -80도에 aliquot하여 사용할 때마다 하나씩 꺼내서 사용합니다. 저희 연구실의 경우, DNA, protein, E. coil 등을 취급하며 공간이 넓지 않아 RNA 를 추출할 때는 클린벤치를 이용하였습니다. 먼저 실험하기 전, tip과 ep-tube, 핀셋은 auto clave로 가열멸균하여 RNA용으로 따로 만들었으며, 시약을 제외한 사용할 모든 기구들읕 70% 에탄올로 닦아준 후 클린벤치에 넣고 1시간동안 uv를 쬐어 소독을 시켜주었습니다. 그런 후 사용할 시약들은 에탄올로 소독하여 넣어준 후 실험동안에는 클린벤치를 절대 나가지 않았습니다. 또한 추출하는데 사용하는 제품은 Qiagen의 viral RNA mini kit입니다. 처음 제품을 받아서 프로토콜에 나온대로 310 ug의 carrier RNA에 AVE 버퍼(lysis용)를 310 uL를 넣어주어 냉동 시킨 후, 5.6 ug씩 aliqout한 것을 사용 전 용해시켜 AVL 버퍼 560 uL에 섞어준 후, 이 용액에서 560uL를 따 140uL의 stool suspension과 섞은 후 10분 간 반응시켜주었습니다. 그런 후 560 uL의 99% 에탄올을 섞어 볼텍싱 후 컬럼을 돌려 만든 (stool suspension+AVL+에탄올) 용액을 2번을 걸쳐 컬럼에서 걸러주었습니다. 그런 후, AW1 500 uL를 넣어 1분동안 6000rpm으로 버퍼를 걸러 주었고 다음으로는 AW2 500 uL를 넣어 13000 rpm으로 3분 간 걸러주었습니다. 마지막으로 kit에 있는 AVE 버퍼를 넣고 1분간 배양하여 용출해주었습니다. 또한 이 결과가 잘 나오지 않아 연구실에서 예전에 만들어 놓은 DEPC treated water를 용출 용액으로 사용하기도 하였습니다. 파이펫을 잡는 손은 최대한 샘플에 손을 닿지 않도록 주의하며 실험을 할 때는 꼭 마스크를 씁니다. 전반적인 제 실험과정은 이러한데 RNA 추출의 nanodrop 결과는 할 때마다 A260/280은 3부근이, A260/A230은 0.1~0.4부근이 나오는데 도대체 제 실험 과정에서 어떤 부분이 문제일까요..?

isolation of total RNA from cultured mammalian cells 실험을 진행했는데 전기영동 결과 해석 방법을 모르겠습니다. 

프로토콜대로 했는데 전기영동에서 RNA가 안보이네요 실험과정은 이렇습니다 2.5 x 105로 24well plate에 seeding한 뒤 3일 뒤에 cell pellet을 harvest 하였습니다 Q사와 A사의 Total RNA 키트를 사용하였고 모든 작업은 ice box에서 이뤄졌습니다 Lysis buffer 350ul 와 b-mercaptoethanol 3.5ul를 넣고 세포를 완전히 용해시킨 후 두번의 wash 과정을 거치고 중간 과정에서 DNase I 처리 과정이 있어서 각 컬럼마다 N사의 DNase I 를 넣어서 DNase I (RNase free) (1unit) 1ul 10x reaction buffer 10ul 3DW(nuclease free water) 89ul 총 100ul로 37도 인큐베이터에 10분간 반응시켰습니다 그 후로는 프로토콜의 wash 과정에 따랐고 RNase free water로 50ul로 elution 하였습니다 DNase 처리를 하였음에도 전기영동에서 gDNA contamination이 일어난 이유와 2개의 밴드로 나뉘어 보여야 될 RNA가 왜 안보이는지 모르겠습니다 2% agarose gel에서 실시했구요 어떻게 해야 될까요 도움 부탁드립니다

   말 그대로 급하게 써야되는데 컬럼이 없어서 실험이 안되요.. ㅠㅠ   PAXgene miRNA 컬럼 5개만 빌려주실분 키트 오면 갚음..   댓글달아주세요 ㅠㅜ

안녕하세요  현재 과실에서 RNA 추출을 하는데 buffer를 제조할 때마다 바닥에 겔층이 계속 생겨 질문드립니다. ㅠㅠ RNA extraction buffer (200ml 기준) 조성은 아래와 같습니다. 2% CTAP  2% PVP(K-30) 100mM Tris-HCl (pH 8.0) 25mM EDTA (pH 8.0) 2M NaCl 0.5g/L Spermidine ----------------------여기까지 첨가하고 196ml로 3차 증류수로 정용한 후 멸균한 뒤에 beta-mercaptoethanol 4ml(2%)를 첨가합니다. pH와 가루시약은 소수점 .000 까지 정확하게 맞추고 있으며 시약을 교반시킬 때는 핫플레이트에서 높은 열을 가해서 녹이고 있구요 ㅠㅠ 시약을 완전히 녹이고 멸균을 해도 buffer 밑바닥에 1cm 정도의 겔이 굳어있는 현상이 발생합니다..   여러번 제조했었는데 딱 한번 겔 층이 생기지 않았었습니다. 이때를 제외하고는 동일하게 제조하고 있지만 게속 겔 층이 생기고 있구요..   혹시 비슷한 경험이 있으시거나 해결책을 아시는 분이 계실까요? 답변 부탁드립니다. ㅠㅠ    

안녕하세요.   RNA 추출 정제 퀄리티 분석에 질문이 있어 브릭 선배님들께 질문드립니다.    저는 미세조류를 연구중인 박사과정생입니다.  RNA 추출 및 qRT-PCR 분석을 주로 해오다, RNA-seq 분석을 위해 준비중입니다.  세포를 대량 배양한 뒤 stress를 제공하고 전체 전사체 변화를 관찰하는 것을 목적으로 하고 있습니다.  문제는 새로운 균주를 분리하였는데, 그 균주의 mRNA purity에 문제가 있는 것으로 보입니다.  먼저 고농도의 mRNA을 얻고자 Trizol method를 이용하여 추출 후 전기영동하여 확인했습니다 (TBE, 100mV, 15min, 1% gel).   1번 2번 3번 모두 서로 다른 균주입니다.   근데, 2번 샘플만 smear가 형성되며 밴드가 잘 확인되지 않습니다.  Sample ID Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Factor 1 168.959 μg/ml 4.224 1.899 2.224 2.089 40.00 2 324.389 μg/ml 8.110 4.829 1.679 0.998 40.00 3 84.607 μg/ml 2.115 1.023 2.067 2.247 40.00 260/230 결과도 좋지 않게 확인됩니다. 농도는 좋은데, 농도가 왜 높게 나왔는지 원인 파악이 어렵습니다.    trizol reagent 존재 하에 cool-homogenization 이후, chloroform을 처리하였고, 12000g 에서 15분 원심분리하였습니다. 1,3번 샘플들과 달리 2번에서만 보이는 특징은... 유일하게 노란색 상층액이 형성되었습니다. 이를 isopropanol 처리 후 pallet을 형성하였을때 불투명한 베이지색 pallet이 형성되었습니다.  다행이 DW에는 잘 녹았지만, quality를 믿기 어려운 결과가 나와 재실험을 들어갔습니다.    농도를 포기하고 purity를 높이기 위해 membrane column형식의 gene all kit (RiboEX )를 이용하여 RNA를 추출하였습니다.  이때 탄수화물/당류의 오염을 고려하여 cell이 담긴 RiboEX 용액에 chloroform을 처리하는 것이 아니라, homogenization 이후 cell debris와 RiboEX 용액을 분리한 뒤 chloroform을 처리하였습니다. 이후 12000g에서 30분간 원심분리하여 최대한 깨끗한 상층을 얻고자 하였습니다. (원심분리 이후 상층액의 노란 정도는 줄었지만, 여전히 깨끗하진 않습니다)   Sample ID Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Factor 22-09-28-2 33.820 μg/ml 0.846 0.417 2.028 1.256 40.00 22-09-28-3 53.770 μg/ml 1.344 0.667 2.014 2.009 40.00 22-09-29-4 77.667 μg/ml 1.942 1.061 1.829 1.417 40.00 시료를 세 가지 다른 방식으로 추출하였습니다(필터 제거, debris 제거, 필터 및 debris 제거 등).  그 결과 3번 샘플이 260/280; 260/230 모두 괜찮게 나와 기대를 갖고 전기영동을 내려보았습니다. (TBE, 100mV, 12min, 1% gel)  야속하게 18S, 28S 밴드가 보이지 않습니다.   또 특징 중에 하나가, 이 샘플의 경우 trizol 및 RiboEX method 모두 가장 높은 peak가 260nm가 아닌 270nm에 가깝게 나타났습니다. 이러한 경우 오염에 의해 RNA-seq 분석이 어려운 상태인지 선배님들의 견해가 궁금합니다.  또, RNA 전기영동시 rRNA 밴드가 형태가 끈적한 물질에 의해 smear처럼 형성하는 것인지, 혹은 실제로 RNA가 다 분해된 것인지 의견을 여쭈어 보고 싶습니다.    브릭에서 올라온 해결 방안들을 보면서 여러가지 method를 실험해보았지만, 명확한 해결 방안을 찾지 못했습니다. 경험 많으신 선배님들의 많은 조언 부탁드립니다.    감사합니다. 

안녕하세요. 석사 과정 진행 중인 대학원생입니다. 실험실에서 mouse lung을 채취하여 RNA extraction을 진행하는데 문제가 있어 문의를 남기게 되었습니다. 몇 달째 항상 RNA extraction할 때마다 pellet이 비특이적으로 관찰되지 않습니다. 군차이로 인해 pellet이 안보이는 것도 아니고, 어떤 샘플에서는 나타나고 어떤 샘플에서는 나타나지 않고 너무 비특이적입니다. 실험실에 있는 protocol대로 RNA extraction을 진행하였고, 실험방에 있는 모든 선생님들이 그 protocol대로 RNA를 뽑습니다. 따라서, protocol에는 문제가 없습니다. 시약 문제라기에는 실험방에 있는 모두가 같은 시약을 쓰고, aliquot해서 사용하는 것이라면 다 새로 aliquot하여 사용했습니다. 따라서, 시약에는 문제가 없는 것 같습니다. 여러 방안에서 많이 생각해보다가 RNA extraction하는 과정 중에 pellet이 안보이는 이유가 다음과 같은 이유들로 인해 문제가 될 수도 있는지 궁금한 것들을 나열해 보았습니다. 1. lung을 homogenizer로 가는 과정이 너무 세게 진행되면 안될까요? 2. chloroform을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요? 3. chloroform을 넣고 centrifuge를 돌린 다음, 상층액을 따는 과정에서 너무 바짝 따는 것이 문제일까요? 4. isopropanol을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요? 5. mouse lung에서 RNA extraction하는 것이 어려운 것인가요? 열심히 searching했는 데도 불구하고 왜 비특이적으로 나타나지 않는 것인지 알 수가 없어서 이곳에 문의를 남깁니다.. 선생님들께서도 이러한 문제를 겪으신 적이 있는지 궁금하고, 어떻게 해결하셨는지 궁금합니다.. 혹은 선생님들께서 RNA extraction 과정 중 주의하는 점들이 있다면 그것을 알려주신다면 감사하겠습니다.. 과정마다 제가 잘 주의하여 했는지 돌이켜 보고 싶습니다.

안녕하세요 실험에 대해서는 아예 모르는 초짜 대학원생입니다ㅠㅠ 졸업 논문을 위해 실험을 하게 됐는데, Cell에서 RNA를 추출해서 qRT-PCR을 돌려야 합니다. 현재 Qiagen RNeasy mini kit로 cell에서 rna 추출을 하고 있는데, 최소 6번은 했는데도 spectrophotometer로 흡광도 측정해봐도 아무것도 안 나와서 멘붕입니다.. 혹시 제가 하고 있는 과정 중 잘못됐거나 추가해야 될 점이 있으면 조언해주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ   *추출 전에 Buffer RLT 1 ml 당 B-ME 10 ul 첨가하고, Buffer RPE에 96-100% 에탄올 44ml 첨가했습니다*   *RNA 추출* 1. 6-well plate에 키우고 있어서 6 well plate 안 상층액 버리고, PBS로 wash했습니다. 2. RLT 350 ul 넣고 기울인채로 피펫 끝으로 긁어서 모이게 한 다음 튜브에 옮겨서 1분동안 vortexing했습니다. 후에 70% 에탄올 350 ul 넣고 피펫팅 10회 해서 섞었습니다. 3. 혼합한 700 ul를 spin column에 옮겨서 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. (그런데 이렇게 했을 때 막 위쪽에 하얗게 될 때도 있고 액체가 다 밑으로 안 내려올 때도 있습니다. Cell 양이 너무 많아서일까요ㅠ) 4. RW1 700 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 5. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 6. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 2분 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 7. Spin column을 새로운 2 ml collection tube에 넣고 뚜껑닫고 10000g에서 1분 원심돌렸습니다. 8. Spin column을 새 1.5 ml 튜브에 옮기고 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣었습니다. 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다. 9. 8번에서 한 그대로 같은 튜브에 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다. 10. Spin column 제거하고 뚜껑 닫고 18 ul씩 4개로 나눠서 -80도씨에 보관합니다.   보관하기 전에 spectrophotometer로 아무리 재봐도 값이 안 나옵니다ㅠㅠ 너무 답답합니다.. 짚이는 것은 cell 양이 너무 많은지, 피펫팁으로 긁어오는게 너무 부족한지, vortexing을 너무 높은 속도에서 하는지, 알코올 넣고 피펫팅을 너무 조금 하는지 세게 하는지.. 이런 것들이 원인일까 싶기는 합니다ㅠ 추출은 실험대에서 하고 있고, 추출하기 전에 알콜로 소독하고, 피펫도 Rnazap? Rnase 제거하는 용액 뿌려서 닦고 피펫팁은 autoclave 돌린 것 사용하고 있습니다. 가운 입고 마스크 쓰고 말은 안하고 라텍스 장갑 끼고 rnazap 뿌려서 비빈 다음 진행하고 있습니다.   고칠 점 있으면 부디 알려주시기 바랍니다ㅠㅠㅠㅠ 감사합니다.

안녕하세요, 현재 병원성미생물로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 그 cDNA를 RT-PCR 돌리는 과정을 하고 있는데요.   나노드랍 찍으면 가끔 Impurity 1 에 Guanidine ITC가 표기되고, Impurity 1 A260 및 Impurity 1 %CV 값과 그에 따른 Corrected (ng/uL)가 나옵니다.   이렇게 나오는 경우에는 RNA를 다시 추출하는게 맞을까요 아니면 그냥 보정된 Corrected 농도로 cDNA를 합성해도 별 문제가 없을까요? 그리고 Guanidine ITC가 나온다는건 washing이 덜 되었다는걸 의미하는걸까요?

안녕하세요. 현재 6well에 Raw cell을 seeding해 RT PCR을 진행하고 있는 학생입니다.  밑에 첨부한 사진과 같은 프로토콜로 진행하고 있는데, 세포가 많은 상태에서 진행함에도 불구하고 Rna isolation 과정에서 pellet이 거의 보이지 않으며, nano drop 260/280결과, Nucleic acid 농도도 굉장히 낮아 cDNA 합성을 진행할 수가 없는 상태입니다 ㅜㅜ.  (나노드롭 결과를 따로 정리한 파일입니다. )  rna 추출을 8번 이상 진행했는데도, 제대로 결과가 나온적은 한 번밖에 없습니다. ㅠㅠ 제가 RNA 추출 과정에서 세포를 죽이는 것 같은데, 아무리 생각해도 뭐가 문젠지 모르겠어 질문을 올리게 되었습니다.  모든 실험은 클린벤치에서 진행하고 있고, 지금까지 에탄올을 첨가할 때 조심스럽게 넣지 않았는데 그것이 문제인건지..? 아니면 트라이졸 피펫팅 과정에서 20번을 넘게 하기 때문에 세포가 죽어버리는건지 ..? 모르겠습니다 ㅠㅠ  미리 답변 감사드립니다!   

rna 정제할때 phenol chloroform isoamyalcohol 사용하는데 이때 얘의 역할이 뭔가요..? 물보다 무거워서 핵산 침전 안되게끔 하는게 맞나요?

안녕하세요. 대학원 석사과정생입니다. 실험 중에 cell에서 RNA extraction을 자주 하는데, 가격이 부담되어 기존에 사용하던 제품보다 조금 더 저렴한 제품이 있을까 해서 질문드립니다. 검색은 계속 해봤지만 종류가 워낙 다양한지라 선배님들께서 사용하시는 제품 중에 추천을 받을 수 있으면 좋을 것 같아서 질문드리게 되었습니다. 제가 기존에 사용하던 제품은 50prep에 230,000원(부가세 별도)인 제품입니다. 추천부탁드립니다. 감사합니다.

cell 에서 RNA prep 하려고 Trizol에 넣고 보관하기 위해서 5분정도 -80도에 넣었다가 샘플을 다 못넣은걸 늦게 발견해서 37도로 빠르게 해동하고 샘플 다시 넣은 다음 -80도에 넣었는데 혹시 RNA에 많이 안좋을까요? 아마 RNA가 그 시간 동안 cell 밖으로 나오진 않았을 것 같아서요

대조군과 실험군 RNA를 뽑은 후에 DNase I (Phenol/Chloroform extraction으로 inactivation 함) 처리를 하고 cDNA를 합성했습니다. 각각 RT(+)와 RT(-) 샘플을 만들어서 qPCR을 진행했는데 실험군에서는 RT(-)에서 Ct값이 안뜨고 대조군의 RT(-)에서는 Ct값이 뜨는걸 확인했습니다. (negative control인 water에서는 ct값이 안떴습니다.) 같이 DNase I 처리를 하엿는데 왜 대조군 샘플에서만 RT(-)가 뜨는 걸까요..? 아예 RNA 단계에서부터 오염되서 그런걸까요.,,.? 근데 오염됐다고 해도... DNase I처리하면서 purification이 됐다고 생각했는데...ㅠㅠ 어떻게 해야 하나요?? 고수분들 도와주세요..!