SARS-CoV-2의 spike protien을 Sanger sequencing을 통해 확인하고 있습니다.    one step RT-PCR kit(HyQ One step RT-PCR kit)를 이용해 cDNA 합성과 PCR까지 한번에 진행하고 있고, 전기영동 상에서 band가 뜨는 것을 확인 후sequencing을 업체에 의뢰하고 있습니다.    그런데 결과를 받아보면 여러개 sample 중 한두개씩 결과가 좋지 않네요ㅜㅜ    아래와 같이 comment를 받았습니다.    실험실에서 확인했을 때는 아래와 같이 band가 명확하게 확인되어 의뢰했는데 왜그럴까요..? (영동 사진의 4,5번이 sequencing 결과가 나오지 않았고, 나머지 sample은 sequencing 결과를 받았습니다.)      각각의 sample은 CT값을 기준으로 비슷한 정도의 것입니다.    10개 정도의 sample에서 한두개가 이렇게 튀니 속상하네요ㅜ   생각해볼 수 있는 원인이 뭐가 있을지 궁금합니다.

석사 1년차 왕초보 실험자 입니다 ㅠㅠ 넙치 간에서 RNA 분리를 실시 하고 gDNA를 제거하는 과정후 전기영동 결과 입니다. 일단 결과는 RNA가 거의 다 분해되어 버렸다고 볼수 있는데 cDNA 합성 과정으로 넘어가면 안되고 다시 실시하는게 맞는 거겠죠...? gel 조성은 1%입니다. (첫번째 로딩은 DNA 마커로 그냥 한번 넣어본거라 무시하셔도 됩니다)

실험실에서 이렇게 배워서 저는 이런 방법으로 DNase I을 처리했거든요. 근데.. 사용하는 DNase I (takara)의 protocol을 보면 제가 하는것과 protocol이 다르고, 또 저는 RNA 농도말고 volume으로 맞춰서 넣는데 이렇게 해도 되는건가요?? 위의 언급한 방식으로 DNase I을 처리하고 실험했을때 큰 문제가 없었고 DNA 분해가 되는 것 같습니다만...ㅠㅠ 틀린 protocol이라면 말씀 부탁드립니다.ㅠㅠ 

제가 찾아본 모든 프로토콜에서 첫 단계가 Trizol을 넣어주는 거였는데 Trizol 넣기 전에 media를 버려야하는 것인가요? 배양 중인 plate에서 rna를 뽑아낼 거라서.. 매우 기본적인 질문이긴 합니다만 주변에 물어볼 사람이 없어서 질문 남깁니다..

안녕하세요. 실험하다가 궁금한 것이 생겨 질문을 올리게 되었습니다. RNA Extraction 과정에서 Trizol 처리하고 chloroform을 처리한 뒤 RNA 상층액을 따로 뽑아내어 isopropanol 처리 시 뿌옇게 변하는 이유가 궁금합니다!

안녕하세요, 평소 궁금했던 점 찾아서 보곤 했는데 질문 올려봅니다.    실험의 개요는 그람음성세균에서 RNA 추출 후 mRNA를 cDNA 합성하여 RT-PCR하는 실험입니다.   현재 Qiagen RNAprotect bacteria reagent handbook을 보면서 그람음성세균의 RNA 추출실험을 준비하려고 하고, RNA 실험은 해보지 않은 초보자입니다.   1. 이 회사 제품은 RNA protect reagent를 처리하고 실험하라고 하는데, 이런 처리의 유무가 RNA 회수에 많은 영향을 미치나요? 다른 회사 제품에는 이런거 없는 kit도 있던데 궁금합니다.   2. cell lysis에 lysozyme, proteinase K incubation 하라고 되어 있는데,  이 회사는 Sigma L7651 lysozyme (>=40,000 units/mg)을 15mg/mL으로 포함한 TE(30mM Tris.Cl, 1mM EDTA, ph 8.0)  buffer 200uL에 proteinase k를 10-20uL첨가하여 sample에 처리하라고 되어 있습니다.  1)  제가 lysozyme sigma L1667(>=100,000 units/mg) 을 가지고 있는데,  이것으로 40,000 unit 되게 계산해서 첨가해서 써도 될까요? 이 제품은 다른 회사 kit를 구매할 때 어느 회사 lysozyme을 쓰면 좋다는 정보가 없어서 제가 임의로 구입했던 것입니다.   2) 위의 내용에 맞게 희석해서 쓸 수 있도록 lysozyme은 stock으로 만들어놓고 -70도씨 보관하면서 꺼내써도 괜찮나요? 그냥 TE buffer에 녹여서 적정량 aliquot 해두고 쓰면 되는지 궁금합니다.    3. TE buffer 제조 관련 1M Tris,HCl(pH8.0)과  EDTA powder(EDTA.Na2.2H2O, F.W. 372.24)를 가지고 있는데, EDTA가 시약 통 라벨에 5% 녹였을 때 pH가 4.45라고 나와있습니다. (EDTA.Na2.2H2O, F.W. 372.24)는 인터넷에 보니 아래와 같이 나와있는데, pH를 보정해가면서 녹여서 8.0까지 맞춘 stock을 만들고 TE buffer 제조해야 되나요.  "Preparation Instructions: This product is slowly soluble in water at room temperature up to 0.26 M, which is approximately 96 mg in a final volume of 1 ml. The pH of this solution will be in the range of 4 to 6. EDTA salts are more soluble in water as the pH increases: the more EDTA there is in the salt form, the higher the pH of a water solution, and therefore, the higher the room temperature solubility. This can be achieved by a gradual addition of concentrated sodium hydroxide solution to the EDTA solution."   4. RNA 실험에 쓰이는 모든 도구는 0.1% DEPC 처리 등 해서 쓰라고 되어 있던데, lysozyme 정량할 때랑 EDTA 정량할 때 쓰는 시약 스푼 같은 것도 모두 EDPC 처리-열처리해서 DEPC 제거 이런 과정들 다 거쳐야 하는지요, 그리고 만약 EDTA를 pH 보정을 한다면 이 때 pH 전극 등 접촉으로  혹시 오염가능한 RNase는 어떻게 불활성화 할 수 있을까요?    5. 현재 타사의 RNA ectraction 추출 kit로 추출 후 gDNA가 잔류되어 qiagen으로 바꿔 해보려하는데 qiagen protocol에는 보통은 별도의 DNase처리가 필요없다고 하는데, 이 보통의 범위가 어느 정도인지 잘 모르겠습니다. 옵션으로 필요할 경우  RNeasy mini kit 사용시 RNase free DNase 처리를 washing 단계 전에 할 수 있다고 안내하는데, 그람음성세균의 RNA 추출시 DNase 처리 안해도 gDNA 잔류없이 잘 되었는지 어땠는지 아시는 분 있을까요?    자료를 찾아봐가며 준비하고 있기는 한데 하나부터 열까지 모르는 분야 실험이라 조언 부탁드립니다. 

Transformation시 사용되는 e.coil strain이 뭐가 있는지 궁금합니다

plate 채로 얼린 cell을 rna extraction하려고 하는데   얼려진 cell을 어떤식으로 녹이고 긁어내야하는지 모르겟습니다..

저희 실험실은 신생랩인데 10년전에 구입한 것으로 추정되는 창고에 남아있던 피펫팁을 사용합니다.   RNase free 팁, RNase free water 가 RNA work에서 필요하다고 하더라구요   1.봉투하나 클린벤치 안에서 뜯어서 조심히 팁렉 안에 넣고 오토클레이브 돌리는 걸로는.... 너무 오래된 팁이라..안되겠죠??(열로 RNase를 파괴할 수 있다거나..) 2.kit 써서 RNA 추출할건데 RNase free water는 RNA 디프리저에 저장할 때 사용하는건가요??    3.RNA 저장할 때도.. RNase free micro tube가 따로 있는건가요??

DNA 뽑을때 멸균해야하는지 질문을 올렸더니 너무 감사하게 아래처럼 답변을 해주셨습니다!   일반적인 실험테이블에서 하면 됩니다 막 cleanbench안에서 하고 그 정도는 안해도 됩니다 당연히 실험하실때 실험대 닦기도하고 시약들은 auto된거 사용하는 정도는 하시니까 그대로 진행하시면 됩니다 조금다르게 RNA 뽑을때는 신경 많이 쓰셔야됩니다   그런데 토양 16S RNA 분석을 진행할거라 RNA를 뽑는건데 신경을 많이 써야한다는게 RNA 를 뽑을 때는 꼭 클린벤치에서 진행해야한다는 말씀이신걸까요?? 항상 많은 도움 주셔서 너무 감사합니다.

안녕하세요 오늘도 교수님의 과제로 괴로운 대학원생입니다..    이번에 in vivo 혹은 in vitro에서라도 treatment할 mRNA를 만들어보라는 막연한 주제를 던져주셔서 실험실 세팅을 하려고 하는데, cloning 과정이나 IVT 합성 과정이나 이런 것들은 키트에서 알려준대로 하면 되어서 큰 문제가 없는 듯 합니다.  문제는 mRNA로 만들어낼 부분의 sequence인데,, CDS 부분에 들어갈 것은 어느 정도 정리가 되었으나 앞뒤로 붙이는 UTR이라는 부분이 굉장히 중요하고 공개된 소스가 많지 않아서 어떻게 sequence를 짜야할지 이 접근에 대해서 오리무중인 상태입니다.. mRNA를 처리할 세포주에 따라서도 UTR이 중요하게 바뀌는 거 같아서 지금 해보라고 하신 세포주의 동물 타입이 3가지라 이것도 답답한 현실입니다.  이 실험에 대해서 깊은 이해가 있지 않아서 어떤 정보를 접근해야지 얻을 수 있는지도 모르겠어서 실상 인터넷 삽질만 계속하고 있는 중이네요..   해당 실험에 대해서 알려주실 수 있으신 분은 답변부탁드립니다.. 간절하네요.. 

안녕하세요. RNA prep (spin column 방식) 을 할 때,,, lysate에 ethanol을 첨가하고 column으로 옮기던데, 이때 ethanol은 어떤 기능을 하는 건가요? 답변 부탁드립니다. 감사합니다.

Isolation Kit이 Qiagen과 Thermo에서 많이 사용한다고 들었습니다.   혹시 괜찮은 제품이 있을까요?   ep tube/magnetic beads 두 방식 모두 괜찮습니다.   cell 및 tissue용으로 부탁드리겠습니다!

안녕하세요 저는 이제 막 대학원 입학한 초보 실험자입니다. 다름이 아니라 Trizol을 이용해 spleen에서 RNA를 뽑고 RNA가 잘 뽑혔는지 확인해보려고 전기영동으로 확인했는데 계속 밴드가 잘 안나와서 질문올립니다,,   18S는 잘 나온 것 같은데 5S 밴드가 진하게 나오고 28S는 저렇게 밴드가 끌린모양으로 나와서 이 RNA로 실험을 진행해도 될지 의문입니다,, 아무리 찾아봐도 28S가 18S보다 2배정도 두껍게 나와야하고 뚜렷한 밴드 형태를 가지던데 저 28S는 degradation이 되어 18S band가 두껍게 보이는 건가요? 28S밴드 형태가 쭉 끌린 형태는 degradation되거나 농도가 진하면 그렇다던데 이 때문인걸까요? 전기영동은 native electrophoresis로 1.2% agarose로 50V에 40분 내렸습니다,, 작은 V에 천천히 내리는게 좋다고 해서 이랬는데 너무 오래 내려서 이런걸까요,, nanodrop으로 260/280, 260/230 수치는 괜찮았고, 첫번째 두번째 RNA는 농도가 진해서 dilution한 최종 농도 적어놨습니다..   첫 질문인데 답변 부탁드립니다ㅠ 읽어주셔서 감사합니다.

안녕하세요 학교 실험실을 다니면서 실험을 배우고 있는 학부생입니다! 제가 RNA 뽑던 중에 isopropanol을 1시간 30분 정도 방치를 하고 centrifuge를 돌렸어야했는데 방치를 안하고 바로 centrifuge를 돌려버렸어요ㅠㅠㅠ RNA 뽑는데 많은 영향을 줄까요...?

PCR 시도해보려고 열심히 자료 조사하고 실험계획 만들었는데 슬프네요 다른 방법없을까요??   그리고 진공건조는 몇도에서 하는건가요??