bacteria DNA work를 하고 있습니다   Restriction 후 concentration이 낮아 vacuum centrifuge로 농축시키는데    농축전 gel에서는 밴드가 연하게보이고, 농축후에는 밴드가 보이지않는데   제가질문드리고 싶은것은   1. 이것은 centrifuge에 무슨문제가있는걸까요? 2. Restriction 후 concentration을 높일수 있는 방법은 무엇일까요?   입니다   답변부탁드리겠습니다   감사합니다

안녕하세요, 현재 cell line 제작 중에 있습니다. virus를 이용해 transduction 시키려고 하는데요, 저희 교수님은 transfection을 이용해 integration 시키지 왜 virus를 만드냐는 말씀을 자주 하셔서요. 1. transfection을 통해서도 integration이 되는지 2. 된다면 virus을 이용할 때와의 차이점은 효율 뿐인지 3. 효율 차이가 많은지 에 대해 질문 올립니다.

Temperature sensitive mutant에 대해서 방법 하나를 봤는데요  이게 제가 제대로 이해한것이 맞는지 확인부탁드립니다 ㅜㅜ 우선 ts mutation되어있는 어떤 유전자를 넣고 그 세포를 permissive temperature에서 키우면 control과 같이 자라지만  non-permissive temperature 예를 들어 39'c에서 키우면 죽어 있는 부분을 확인해서 그 cell들을 따와서 사용하는건가요...?    

안녕하세요 5'-6-FAM(fluorescein amidite)가 결합된 antisense oligonucleotides를 mouse injection하고 target organ을 whole mount dissection으로 slide 제작하고 target cell에 antisense oligonucleotides가 들어갔는지 confocal로 확인하는 실험을 하고있습니다 염색은 DAPI, Phalloidin(actin염색, alexa fluro 647)로하고 dapi, 647, fam 채널로 찍고있습니다 문제는 injection시행하지않은 control slide에서도 fam signal이 상당히 나와서 실험군의 signal이 신뢰할만한 것인지 의문이 듭니다 control slide의 형광이 보이지않을 정도의 confocal setting에서 실험군 촬영하는 것 외에 혹시 다른 방법이 있을지요? 아니면 FAM에대한 antibody를 써보신 분이 있으신지 궁금합니다. 감사합니다

pET21b를 실험실에서 사용하고 있는데요  pET21b를 DH5a에 transformation해서 mini prep을 하면 yield가 높게 나오는데 scale을 키워서 culture한 뒤 midi prep을 하면 아이에 없다 시피 농도가 나옵니다.  다른 사람이 해도 그래서 전 연구자 실험 노트를 봐도 midi prep을 진행해본 사람이 없더라구요    답답해서 질문 남깁니다.  pET21b vector는 원래 이런건지 알고 싶습니다. 다른분도 이러신가해서요 ..ㅜㅜ 

qrt-pcr 할때 Plate를 8개의 튜브가 한줄로 연결되어있는 튜브를 사용하였었는데 실험실에 이제 튜브를 거의 다 써가고 예전 선배님들이 쓰시던 plate가 많이 남아있어서 사용하려고 하는데 의문이 있습니다. 96well pcr plate로 모두 분주후에 sealing film을 붙이는데요. 원래 사용하던 튜브로 할때는 rt-pcr 돌리기전에 centrifuge로 spin down을 시켜주는데 96well plate는 어떻게 spin down을 시켜줘야하나요? 도와주세요ㅜㅜ 

 comp cell은 DH5a를 사용중이고,  vector는 lentiV2를 이용중입니다 제가  primer 20bp크기를 insert하려는데 콜로니가 안떠서 고수님들께 자문구합니다.   DH5a는 RBC에서 구매해서 사용중이라 문제는 없는것같습니다. BsmB1으로 자르고 gel extraction 후 밴드 잘린거 확인했습니다.   comp cell 20ul에 plasmid 1.7ul넣고 transformation은 ice 20 min 42도에서 heat 45 sec ice 20 min 뒤에, S.O.C 50ul 넣고 37도  shake incubator에 1시간 배양 후  lb+amp plate에 모두 spread합니다   콜로니가 아예뜨지 않는데 어떤 단계를 확인하거나 바꿔야 할까요 vector도 바꿔보고 glass beads로  non-heat 으로도 해보고, ligation 단계에서 ATP도 넣어봤는데 콜로니가 안뜨네요ㅠㅠ  도움 부탁드립니다.ㅠ  

한 논문에서 본 실험의 시약 조성비입니다   해당 논문에선 200nM Lba Cas12a, 1uM crRNA, NEBuffer 2.5 ul, 20U RRI, RPA product9(dsDNA) 2ul, 800 nM fluorophore quencher labeled ssDNA probe로 reaction volume은 25 ul 이라고 하였습니다.    실험 초보여서 이렇게 쓰여있어 어떻게 넣어야 할 지 의문입니다.   동일한 Lba Cas12a을 찾아보니 stock의 concentration이 1uM인데 그렇다면 Lba Cas12a를 5ul 넣어 200nM 을 넣으면 되는 것 인가요? total volume은 25 ul 이기에 1/5인 5ul를 넣어서요.    RRI의 양과 논문과 같은 Probe를 사용한다면 고정적인 수치일것이고  그렇다면 만약 다른 crRNA를 사용하고자 한다면 그 crRNA의 농도에 따라 reaction volume 도 달라지는 것 아닌가요?    사진은 논문 원문입니다.    감사합니다. 

안녕하세요, real-time pcr을 배우고있는 석사학부생입니다. 이번에 conventional pcr과 real-time pcr의 차이를 찾아보고 있는 도중 real-time pcr 과정에서 Ct값을 확인해서 증폭값을 확인할 수 있는데, 내가 원하는 target template만 증폭됐는지 알기는 전기영동을 하지 않는이상 어렵지 않나요..? 그런데 다른 선배님들은 전기영동을 따로 하지 않으시더라구요.. 아직 배우고있는 과정이라 궁금한게 많습니다. 도움 부탁드립니다.

안녕하세요.  실험 중 궁금한 점이 있어 질문올립니다. viralRNA를 qPCR로 검출하는 실험 중 plateau의 RFU값이 낮게 나오는데, 원인을 모르겠습니다.   실험 과정은 1) 백신에서 추출한 viral RNA를 onestep qRT-PCR로 검출시 그래프가 잘 그려졌습니다. 2) 문제는, 실제 바이러스와 백신에서 각각 추출한 viral RNA를 twostep qRT-PCR로 검출 시 바이러스에서 추출한 cDNA의 최종 RFU값이 낮게 그려집니다. 백신에서 추출한 cDNA의 경우 최종 RFU값이 이전처럼 높게 나오구요. ct값은 오히려 바이러스에서 추출한 샘플이 높게 나옵니다. - 2번 실험에서 qPCR은 qiagen의 quantitect onestep mix에서 RT만 빼고 사용했습니다. 혹시 이게 문제가 될 수 있을까요? 의견 부탁드리겠습니다!

안녕하세요. PCR primer를 디자인할때 어떻게 고르면 잘 고를 수 있을지 질문하고 싶어서 글 남깁니다.   제가 primer-blast를 여러 조건을 넣고 돌렸는데, 사진처럼 여러 프라이머가 나옵니다.   원래 여러 프라이머가 나오는건 알지만 문제는 프라이머끼리 겹치는 부분 때문에 어떤 것을 선택하면 좋을지 잘 모르겠다는겁니다...   혹시 기준 같은 것이 있을까요? 알려주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ

고등학생입니다. 신장성 요붕증의 원인인 AVPR2 유전자의 점돌연변이를 잘라내는 모의 실험을 계획했는데요.  10-23 DNAzyme을 이용해 제거하고 AVPR2 유전자의 점돌연변이 부분을 제거하여 제거가 잘 되었는지 확인하는 실험입니다. AVPR2 유전자 돌연변이로 280번째 아미노산이 치환되어 신장성 요붕증이 발생한 것이므로 ncbi에 들어가 정상인의 280번째 아미노산을 확인한 정상인과 신장성 요붕증 환자의 염기서열을 비교해 돌연변이 위치를 파악합니다. 그 후 이 돌연변이만의 10-23 DNAzyme를 설정하고 제대로 절단됐는지 확인하고자 AVPR2 유전자의 점돌연변이 mRNA 절단 여부를 판단합니다. 잘라낸 부분의 mRNA를 증폭시키기 위한 primer를 설정하고 전기영동의 각 Lane에 대조군인 AVPR2 유전자의 돌연변이 mRNA, AVPR2 유전자의 돌연변이로 인한 신장성 요붕증 환자의 DNA, 증류수를 넣는다고 가정했습니다. 실험군으로는 직접 설정한 DNAzyme을 이용해 돌연변이를 제거한 환자의 mRNA를 넣고 프라이머 등을 넣는다고 가정했으며 RT-PCR 후 전기영동을 통해 증폭 여부를 판단하여 가설의 성립 여부 확인으로 모의 실험이 종료됩니다. 이 모의 실험에서의 오류가 있을까요??

안녕하세요. 현재 zebrafish를 double knockout 해서 만들어져있고,  이때 RNA-seq결과로 나온 특정 유전자들에 대해서 cloming을 하려고 합니다.   그런데 이때 cloning을 하려면 cDNA를 어떤 것으로 사용해야 될까요?   두 유전자가 a, b라고 한다면 wild type   ,    a-/-    ,    b-/-    ,     a+/-,b+/-     ,    a-/-,b-/-  cDNA 나 knockout 한 model에 대해서 개념이 헷갈려서  어떤 것의 cDNA를 사용하여 target gene을 뽑아야 되는지 모르겠습니다 도움 부탁드립니다!

안녕하세요, 특정 gene을 과 발현 시키는 stable cell line 제작 중입니다. 저는 보통 viral vector를 이용해 virus를 만들어 infection 시켜주는 방식으로 실험을 진행하는데요, 교수님께서 항상 왜 그냥 transfection해서 integration 된 cell을 골라내지 않냐고 말씀하셔서요. 지나가는 소리로 선배들에게 transfection을 하면 infection보다 효율이 안좋다 란 얘긴 들었고, transfection reagent는 핵막을 뚫지 못해서 division 되는 cell에만 들어가고 virus는 (lenti 사용) 핵막을 뚫는다, 정도만 알고 있는데 정확한 효율 차이 등을 아시는 분이 있으신가요? 답변 부탁드립니다 :-)

1번 3번 5번이 각가 다른 Vector이고 Ligation 시킨 sample이고 2번 4번 6번이 각각 그 Vector를 digestion 시킨 상태의 Vector를 컨트롤로 걸어둔것입니다. 여기서 든 의문이 Control로 잘린 Linear한 Vector DNA를 넣어줬는데 왜 Band가 Ligase 처리한 Vector DNA[Circular form]보다 더 아래에 있는가 궁금해서요.. 혹시  1.Vector DNA + Insert DNA[159bp]의 Size가 당연히 더 크기 때문? 2.Restriction 처리가 한쪽만 일어나서 한쪽 부분의 Vector와 Insert만 붙어서 Ligation이 실패한것 인건가요?

안녕하세요. vector를 BamHI, XhoI으로 double digestion하고 있습니다. (vector에 다른 Bam, xho site는 없습니다.) 그런데 RE처리 할 때 Bam,Xho로 한번에 처리하니 extra band가 생기고, 이상해서 1. Bam 2. purify (pcr purification , D.W 40 Elu)  3. Xho  이 순서로 digestion 했습니다. 이때 2번과정 이후 EP를 내려보니 3개의 band가 형성되었는데, 3번 Xho 효소를 처리한 후, 다시 EP를 내려보니 하나의 band만 남은 것으로 확인되었습니다.   결과는 이렇게 나왔습니다.   1. BamHI이  star activity가 있다고 알고 있는데 그래서 enzyme을 너무 과량으로 넣어서 그런건가요?   2. Bam -> purify -> xho 까지 하고 나니 band가 다시 정상적인 size의 band로 나왔는데 이것도 왜그런 것인지 모르겠습니다. 3. 이 sample들 모두 버리고 다시 xho, Bam순서로 진행해야 할까요?

안녕하세요. 대학교 학부 실험생입니다. 다름이 아니라 최근에 전기영동 실험을 하는데 Hind3와 Nde1으로 cut하는 결과값이 계속 잘 안나와서 스트레스를 받아서 질문글을 남깁니다. 사용하는 백터는 Pet23b 이며   insert가 다른 플라스미드 3가지(앞에3개), 뒤에는 하나가 안나왔지만 Hind3와 Nde1으로 double cut한 plasmid 3가지 입니다. 여기서 뭔가 이상하게 나와   Plasmid , Hind3처리, Nde1처리, Hind3+Nde1 처리한 순입니다. 해당사진으로 Nde1이 이상해 cut이 안나는거 같아 Nde1으로 농도만 다르게 한체 실험한 결과  Plasmid, Nde1(1), Nde1(1.5), Nde1(2) 순의 결과가 나왔습니다.()<-괄호 안 숫자는 제한효소 양입니다. Nde1의 띠가 자꾸 이상하게 나오는데 band가 2곳에서 생기는게 아닌거보면 잘리는거같기도하고 의문점이 너무 강하게 듭니다. 질문 1. Hind3가 잘못된게아닌 Nde1이 안잘린게 맞는건가요?? 아니면 둘다 cut되었는데 다른곳에서 잘못되어 결과가 이상하게 나온건가요?? 1-1. Nde1이 컷이 안되었다면 어째서 band가 한곳에서만 나오는건가요?? 2. Nde1과 Hind3를 처리할때 D버퍼에서 활성도차이가 Nde1(75~100), Hind3(10~50)이라 차라리 single cut을 두번하는게 나을까요?? 2-1. Single cut을 두번한다면 에탄올침전법을 이용하여 분리하면 된다는데 해당방법에 대한 설명을 조금더 해주실 수 있을까요? 혼자 연습해보니  유실이 너무 많이되는거 같습니다. 제 지식이 너무좁아 부끄럽지만 질문 글 읽어주셔서 감사합니다.

mini prep 하려고 plate에 spreading 해놓은걸 깜빡해서 4도씨 냉장고에서 4일 정도가 지나버렸는데 이걸로 prep을 해도 괜찮은걸까요?

안녕하세요, Crispr Cas9 knock-out 시스템을 랩에 구축하려 공부중인 대학원생입니다. 궁금한 점이 있어 질문드립니다.   guideRNA는 shRNA와는 다르게 반드시 CDS만을 target해야 하는 것으로 이해했습니다.   Cas9과 gRNA를 expression하는 vector를 transfection하는 system으로 knock out을 진행하고자 하는데요, 이를 통해 knock out이 발생한 cell에서는 Cas9과 target의 CDS에 대한 gRNA가 계속 발현하게 될텐데,   이 cell에 만약 WT 혹은 mutant의 target gene을 plasmid를 통해 도입시켜 준다면, 도입시켜준 gene에 대한 knock out도 발생하게 될것으로 예상되는데, 실제로 그러한지 궁금합니다. 제가 이해한 바가 맞는지...   그리고 이러한 현상을 피하기 위해서 반드시 doxycyclin-dependent하게 발현하는 cas9과 같은 제품을 사용해야 하는지도 알고 싶습니다.

세균 감염 시료 2개를 타켓 primer를 이용하여 PCR하였는데, 1개시료는 정상위치에 나왔고, 다른 시료는 정상위치에서 2개로 나뉘어진 밴드가 나왔습니다.  PCR이 제대로 된 것인지, 타켓세균인지 확인하고자 시퀀싱을 맡겨서 blast로 확인해 보니 일치도가 둘다 98%, 97% 이렇게 나오네요.  1. 일치도 97, 98%면 동일 세균이라 볼 수 있을까요?  2. blast 로 시퀀싱 확인할때, forward primer 결과와 reward primer 결과를 각각 따로 확인하는 방법 밖에 없나요? 이를 논문에 넣을 때는 둘 중 한 가지 결과만 넣으면 되는 것인지 궁금합니다.    시퀀싱 data를 처음 핸들링 하다보니 모르는 게 많습니다. 고수님들 가르쳐 주십시오.