blunt end ligation하다가 잘 안되는 부분이 있어 질문 올립니다. Vector는 2.7kb, 6kb로 Sma1 처리를 하여 blunt end, Insert는 1.2kb (Pfu polymerase, PCR product)로 둘다 blunt end 입니다. 농도랑 순도 모두 100ng/ul 이상, 2.0 (260/280)이며 ligation 시 10:1 (Insert/Vector), 4℃, O/N로 진행하고 있습니다. 근데 계속 Vector selt ligation만 나와 고민 중입니다. (제한효소, Insert primer로 확인) 저가 생각한 대안은 아래와 같습니다. 1) Insert/Vector 비율 늘리기 2) ligation 시 Sma1 소량 넣어 진행 (buffer, Sma1 volume 등 정확한 protocol은 모름) 혹 이것 외에 더 효율적인 방법이나 놓친 부분이 있을까요?    

PCR을 했는데 원래 detect 되어야하는 size에서는 band가 안나오고 2번째 line과 같이 100bp 이하에서 band가 나왔습니다... 다른 유전자가 검출된 건가 싶어 Gel extraction, TA-cloning후 prep 해서 sequencing을 보냈는데 결과에서 다른 유전자가 아닌 T-vector로 나옵니다. 이유 알고계신 분 있으시면 꼭 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ 감사합니다.  

이전에 SDM(Site-directed mutagenesis) 관련하여 질문을 올렸었습니다. (https://www.ibric.org//myboard/read.php?Board=exp_qna&id=789382)   골자는 SDM이 되지 않는 것에 대해서 조언을 구하는 글이었는데.. 결국 성공하긴 했습니다만, 여전히 매우 낮은 효율때문에 다시 질문을 올리게 되었습니다.   현 상황을 요약하면 다음과 같습니다.     vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고,   primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.   snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것이며, Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 맞춰준다고 합니다.     PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 500ng (기존 200ng)   PCR cycle :  95°C 30s 95°C 30s 55°C 60s 68°C 4:30s (기존 kb/30s 에서 kb/1min로 수정) step 2부터 X 18  68°C 13:00   PCR이 완료되면, 바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation    그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 120min (기존 40min) 돟안 shaking incubation   마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading       빨간색으로 표기한 부분이 저번 질문에서 올린 protocol과 다르게 한 부분입니다.   이렇게 수행하였더니 colony 3개를 얻을 수 있었습니다.. 물론 sanger 돌려보니 SDM 확인은 잘 됐는데요,   고작 3.5kb로 매우 작은 vector에서, 그것도 base 하나 바꾸는데 이렇게 효율이 안나오는 것도 이상하고, 이런 상태라면 더 큰 vector에서 a.a를 바꾸는 경우에는 아예 colony가 안뜰 것 같다는 걱정이 됩니다.   그래서 지금 문제를 찾고 있는데..       우선 총 2종류의 pfu기반의 high fidelity polymerase로 test를 진행하였습니다.   조건은 template 200ng template 500ng template 500ng+DMSO 로 잡고 진행하였습니다.   PCR 직후의 gel 사진을 보시면 (이때는 깜빡하고 control로 template을 걸지 못했습니다.. ㅠ) TOYOBO의 polymerase의 band intensity가 훨씬 높습니다.   사실 TOYOBO가 thermo보다 activity가 훨씬 높다는 건 기존에 잘 알고 있어서 해당 결과는 충분히 납득할 수 있었습니다.             Dpn1 4hr 처리 이후의 gel 사진입니다.   여전히 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높습니다. 해당 결과만 보면 무조건 TOYOBO에서 colony가 잘 떠야하는데..   결과는 thermo : template 500ng (w/o DMSO) 조건 딱 하나에서만 3개의 colony를 얻을 수 있었습니다.     저는 이 결과가 도저히 이해가 가질 않네요.   분명히 Dpn1 처리 이후, transformation 직전에 gel 사진에서는 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높은데, 정작 되는건 thermo에서, 그것도 매우매우 낮은 효율로 되는게 이상합니다.   본문에서 진행한 실험 말고도, 여태까지 try를 모두 TOYOBO로 했었는데 전부 안되는 것으로 보아 현재까지는 SMD을 수행하는데 있어 TOYOBO polymerase가 부적합 하다고 밖에는 생각되지 않습니다.   그래서 TOYOBO maual을 잘 찾아보니까..         해당 pol에는 3' exonuclease activity가 있다고, enzyme cut 하기 전에 purify하라고 나와있는데, 이것 때문일까요..?   근데 3' exo activity는 pfu 기반이면 다 있을 수 밖에 없는 건데, (klenow fragment가 아닌 이상에야) 왜 TOYOBO만 그런걸까요..         관련하여 선생님들의 조언과 의견을 여쭤보고 싶습니다.   감사합니다.

안녕하세요 현재 대학원 석사 1년차입니다. 원래 게속해서 진행해온 cloning과 transformation이 8월달 부터 인가 뭔가 점점 이상해졌습니다. 저희가 기존에 만든 C-cell을 이용해서 계속해서 transformation을 진행했는데요, 8월달 부터 transformation을 한 이후에 mini-prep을 진행해온 결과 원래는 300-400ng으로 잘 나왔었는데 어느순간 갑자기 50ng으로 확 효율이 떨어졌습니다.(mini prep kit 사용했습니다.) 너무 이상해서 여러번 transformation도 해보고 배지도 다 바꾸고 새로 다 만들어서 했는데도 이상해서 C-cell이 문제겠거니 해서 다른 랩에서 얻어온 C-cell을 이용해서 transformation을 해본 결과 비슷하게 나왔습니다. 그래서 C-cell을 사서 새로 transformation을 했는데 다행히 colony가 잘 떠서 liquid culture을 진행했는데요, 아니나 다를까 또 mini-prep을 진행한 결과 50ng밖에 안나왔습니다...ㅠ 심지어 안자란것도 있습니다..ㅜ antibiotic marker는 ampicilin을 이용하였구요.. 새로 산 DNA가지고도 transformation을 했는데 하나도 자라질 않았네요.. 일단 저희 학교 내 실험실에서 해볼 수 있는 모든 경우의수를 다 해보았는데 도저히 돌파구가 보이지 않네요... 혹시 저와 같은 비슷한 경험을 해보신 분이나 problem solving하신 분들 있으신가요??ㅠㅠ 

대장균을 형질전환시킬 때 고농도의 2가 양이온 (Ca2+)를 사용하는데, 효모의 형질전환에서는 대부분 리튬 아세테이트를 쓰는 이유가 있나요?   리튬은 1가 양이온인테 어떤 차이점이 있나요?

정상적으로 결과가 나왔다면 band가 저것보다 훨씬 짧아야 했구요 ㅠㅠ band 휘어짐이 너무 심합니다 이유가 뭘까요? 아가로스 겔은 조교님이 만들어주신 1% 짜리로 했습니다 

전기천공법으로  plasmid를 transformation하고 다음 날 확인했는데, 크고 하얀 콜로니 주변으로 자잘한 콜로니들이 에워싸듯이 몰려있거나 아예 하얀 콜로니들을 뒤덮고 있었습니다. 지금 저 이상한(?) 콜로니들을 새로 만든 amp 배지에 streaking 하면 순수한 transformant만 얻을 수 있을까요? 아니면 다시 transformation부터 다시 진행해야 할까요? *배지는 알아보니 만든지 좀 되었더군요... 일단 저도 앞으로 쓸 일이 있을거 같긴 해서 새로 만들었습니다.    

Transformation 할 때 bead로 굴려서 spreading 하는데 이때 노하우가 있을까요? colony가 자꾸 잘 안떠서... shaking하다가 cell들이 많이 죽을 수 있는지, 어느정도 해야될지 감이 잘 안잡혀서 도움 요청합니다..

  안녕하세요.. 현재 Site-directed mutagenesis를 하고있는데 colony가 안떠서 난항을 겪고 있습니다..   vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고, primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.   snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것입니다.    Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 한다는데.. 무튼 protocol은 다음과 같이 하였습니다..   PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 200ng PCR cycle :    95°C 30s 95°C 30s 55°C 60s 68°C 2:30s (1kb/30s로 조금 넉넉하게 줬습니다.) step 2부터 X 18  68°C 13:00   PCR이 완료되면, 바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation    그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 40min 돟안 shaking incubation   마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading       제가 예~전에 해당 protocol로 했을 때는 잘 했었던것 같은데, 그때랑 달라진건 polymerase 종류 (회사) 정도? 그래서 사실 high fidelity Pfu 다른 회사 2종류로 test 해봤는데도 역시 안뜨더군요..   무엇이 문제일까요...   선생님들의 지식을 조금만 나누어주시면 감사드리겠습니다.. ㅠㅠ

안녕하세요 assembly PCR이 너무 안되어 질문 올려봅니다... 두 gene을 10cycles을 돌려 assembled fragment를 확보하고(gel extration도 이용해봄) 다시 primer를 넣어 amplify를 시도하는데 계속해서 원래 두 개의 gene이 분리되어 나옵니다.. method의 문제로 일어나는 일 일까요?  첫번째 사진이 10cycles 후 사진이고, 두번째는 첫번째의 네모박스 사이즈의 dna를 gel extraction으로 분리 후 primer와 함께 amplify 한 사진입니다      

RNA template에서 oligo dT나 random hexamer와 Reverse transcriptase를 사용해서 RNA-DNA helix를 생성하고 RNase H를 사용해서 RNA만을 분해한 다음(ssDNA만 남고), DNA polymerase로 dsDNA로 합성해준다고 알고 있습니다. 그런데 여러 회사에서 파는 cDNA 합성 kit에는 왜 DNA polymerase가 없는 건가요? 그냥 RNA-DNA helix를 PCR에 사용하는 건가요?   그리고 저희 실험실에서는 Bio-RAD의 iScript cDNA synthesis kit를 사용하는데, 여기서 제공되는 RT는 RNase H+라고 하더군요 근데 RNase H는 RNA를 분해한다고 하는데, 그럼 최종 합성 prouct가 sscDNA로 남는걸까요?  

전기연동 실험을 진행했는데 결과해석부탁드립니다 ㅠ 혹시 실패한것이라면 요인은 무엇이 있을까요?

Adeno associated virus에 대해 공부하고 있습니다. 해당 Adeno associated virus plasmid의 transgene이 숙주 세포의 염색체에 통합되지 않고 episome을 형성 하는건 이해가 가는데 세포가 분열하면서 transgene의 발현이 줄어들고 발현이 감소되는데 이게 왜 유전자 치료 분야에 이상적인지 이해가 잘 가지 않습니다.   어쨌든 외부에서 들어온 transgene이 계속 발현되서 mutation이 일어날 수도 있기 때문에 발현이 점점 줄어 드는게 좋은건가 싶다가도 transgene이 계속 발현 되야 유전자 치료제로서 제대로 효과를 낼 수 있지 않나 싶습니다.   

안녕하세요 현재 cloning을 하기 위해 PCR을 진행하고 있습니다. 3,600bp 정도 되는 insert를 PCR 뜨고 있는데 문제는 pfu pol이 아닌 그냥 taq pol을 써서 뜨면 잘 떠지는데 pfu pol로 뜨는 순간 바로 밴드가 안뜨더라구요.. 아무래도 3.6kb 정도 되는 insert를 따다 보니 막택으로 뜨면 잘 떠지더라도 sequencing을 해보면 point mutation이나 deletion이 되어 있더라구요.. 그래서 pfu pol로 뜨고 싶은데 같은 회사 polymerase라도 pfu냐 taq이냐 에 따라 안떠지는데 이럴 땐 어떻게 해야하나요ㅠㅠ

SCR1, TKL2, REI1에 대한 cDNA를 합성하였다고 가정하였을때 만약 전혀 다른 유전자인 ‘HXT5’에 대한 real time PCR을 진행할 경우에는 어떤 실험결과가 나올지 분석하려고 하는데,,, 여기서 궁금한게 앞서 합성한 SCR1, TKL2, REI1유전자는 HXT5 유전자의 RT PCR 결과와는 완전 무관한거 아닌가요??ㅠㅠ 그냥 독립적으로 HXT5 유전자에 RTPCR결과만 놓고 보면 되는거죠??   

gene level에서 특정 유전자의 overexpression 과 knock-out 된 세포주의 effect 를 비교 분석하고자 합니다. gene level에서 특이 유전자를 overexpression 또는 knock-out을 시키켜 효과를 비교하려면, CRISPR/Cas9 system 으로 해도 문제 없을까요? 염두해야할 주의사항 이나 limitation은 어떤게 있을까요? 아니면 기존의 cDNA sequence insertion (vector) 으로만 하는게 좋을까요? 도움을 주시면 너무 감사하겠습니다 ㅠㅠ

구강상피세포를 kit로 추출해 1.2% agarose gel에 135v 20분 Dna농도를 뒤로 갈수록 많아지도록 내렸습니다. 로딩샘플을 만들면서도 확인하고 겔에 넣기 전에도 다시 확인하면서 로딩했는데 3번이나 결과가 이상합니다. Ratio 값이 1.9인 것과 1.8인 차이에 의해서 일어날 수 있는 일인가요? 5번째보다 6번째 well에 더 많은 양의 gDNA를 넣었는데 왜 5번째가 더 밝게 보일까요…

대부분 rt pcr 이나 pcr을 할때 사실 저는 primer tm값이나 cycle 조건을 따지지 않고 annealing 58도 30초 72도 30초 이렇게 35cycle 로 돌려버리는 편이고 Bioneer accupower premix 로 우선 돌려봤다가 안나오면 phusion plus 로 해보면 왠만하면 나오더군요 근데 문제는 저렇게 해서 안나오는거는 뭐부터 바꿔야되는지 앞이 안보이더군요 그래서 혹시 pcr 이 안될때 어떤 workflow 를 가지고 실험을 하시는지 궁금하고 또한, 자주쓰는 polymer 나 회사 같은거 추천해주시면 고맙겠습니다

fusion protein 이 어떤 원리로 어떤 작용을 하는지 쉽게 알수있을까요?

말그대로 동물세포의 DNA를 E.coli로 transformation? transcription? 싶은데 intron을 어떻게 제거해야하나요?   RNA 중합효소와 역전사 효소를 동시에 넣고 반응시킨 후 gel puri하면 exon만 있는 DNA를 얻을 수 있을까요?