gene level에서 특정 유전자의 overexpression 과 knock-out 된 세포주의 effect 를 비교 분석하고자 합니다. gene level에서 특이 유전자를 overexpression 또는 knock-out을 시키켜 효과를 비교하려면, CRISPR/Cas9 system 으로 해도 문제 없을까요? 염두해야할 주의사항 이나 limitation은 어떤게 있을까요? 아니면 기존의 cDNA sequence insertion (vector) 으로만 하는게 좋을까요? 도움을 주시면 너무 감사하겠습니다 ㅠㅠ

저희가 특정 DNA/RNA를 검출 하려고하는데요. 전기영동으로 사이즈 확인이 아닌, 형광현미경으로 특정 핵산의 검출을 하고 싶은데요. 어떤 방법이 있는지 궁금합니다.

1 OD 흡광도에서 dsDNA 농도가 50, ssDNA가 38이라는 것은 이론적으로 아는데 ssDNA가 dsDNA의 농도의 두 배가 되지 않는 이유가 무엇인가요?

  안녕하세요? 저는 실험을 배우고 있는 학부연구생입니다. 박테리아 유전자 KO 실험을 진행하려고 하는데 이런 종류의 실험이 아예 처음이라 조언을 얻고자 질문을 올리게 되었습니다.  E.coli strain의 gene 하나를 KO하려고 하는데요.  저희 실험실이 단백질 관련 연구실이라 원래 유전체 편집 실험을 아예 하지 않아 굉장히 생소하고 가능할까 생각이 듭니다. 질문은,,  homologous recombination 실험을 통해서 원하는 유전자 하나만 깔끔하게 KO 시키는 것이 가능한지 궁금합니다.  그리고 이외에 또 추천하시는 다른 실험 방법이 있는지도 궁금합니다. 

gene level에서 특정 유전자의 overexpression 과 knock-out 된 세포주의 effect 를 비교 분석하고자 합니다.  이를 위해 비교로 사용 할 control 이 중요할 텐데요... gene level에서 특이 유전자를 overexpression 또는 knock-out을 시킨다면,  비교하기 위해 DNA 에다가 처리를 한 control이 있어야만 비교가 되는것인가요?  아니면 DNA에 아무런 처리없이 원 세포주를 control 로 삼아도 정당한 비교가 될까요?   도움을 주시면 너무 감사하겠습니다 ㅠㅠ

Comp가 실험실에 없어서 면봉을 넣고 굳혀서 동그란 형태의 홈을 만들려고 하는데 동그한다고 실험 결과가 바뀌거나 하진 않겠죠?

실험 문의는 아니고 DNA 복구 기작에서 궁금한점이 있습니다. DNA 복구 기작중 뉴클레오티드 절제 복구, 광분해 복구, 염기 절제 복구가 있는 것으로 알고 있습니다. 인간의 경우는 광분해 복구는 안일어나는 것으로 압니다만 세균에서는 셋 다 일어나는 것으로 압니다. 세균에서 그리고 인간에서 어떤 경우에 각각의 복구 기작이 일어나는지 궁금합니다. 예를 들어 DNA에 존재하는 유라실의 제거 복구에는 염기 절제 복구가 일어 나는 것으로 알고 있는데, 이때 뉴클레오티드 절제 복구가 일어날 수는 없는지 말입니다 그리고 뉴클레오티드 복구 기작에서도 염기 절제 복구에서도 인산 다이에스터 결합을 끊는거로 아는데 이는 공통된 특징인지요    

안녕하세요. 요새 T cell line을 가지고 실험중입니다. CRISPR/cas9으로 특정 유전자를 KO한 후 ELISA로 해당 유전자가 조절하는 단백질을 정량하고자 했는데 오히려 더 많이 나오더라고요. 제가 보유하고 있는 sgRNA와 cas9는 HEK293T에서 90%이상의 indel이 발생함을 확인했습니다. 물론 T cell에서 도입 효율이 떨어지겠지만 단백질양이 증가하는 것이 이해가 안됩니다. 혹시 이런 경우도 있나요?  그게 아니라면 prep 문제려나요 ㅠ 도움부탁드립니다.

  안녕하세요. 비전공자입니다. pcr 진행 후 전기영동을 진행하는데 로딩다이 끌림이 발생해서 바꿀려고 합니다. 혹시 브랜드마다 차이가 있을까요?   현재 바이오팩트 100bp 로딩다이를 이용하고 있습니다. 

안녕하세요, TKO 만들다가 너무 애먹고 있어서 도움을 요청하려고 합니다. 첫번째 KO을 stable하게 만들때 blasticidin selection을 이용하였고, 두번째에 CRISPR gRNA-Cas9-Puro 발현을 이용하여 퓨로마이신 selection 이용하여 selection 하고 세번째로 gRNA-GFP 발현을 이용하여 sorting 하려고 했는데 GFP sorting 에 어려움을 겪고 있습니다.   혹시 클로닝을 이용할수 있거나 완제품으로 판매중인 plasmid중 blasticidin 과 Puro 와 겹치지 않는 selection 방법이 있을지요..   항생제 selection이 아무래도 가장 빠를것 같아서 겹치지 않는 항생제를 찾고 싶은데 일반적으로 TKO를 어떤 방법으로 만드는지 궁금하여 여쭤봅니다.   부디 도움 주시면 감사하겠습니다!

항생제를 dDNA에 넣어서 design하여 integration하여 지켜보자 라는 말씀을 박사님들께서 하시는데 무슨 뜻인지 이해가 안가서요…

    DNA double cutting 하여, 전기영동을 해서,  100bp 작은 사이즈를 볼려고, 50V_ 40분 3% agrose gel로 내렸는데,,  100bp 부분에 시커멓게 나와서 ㅠ  2%로 해도 똑같이 나오더라고요 ㅠ 100bp  부분에 시커멓게 안나올 수 있는 방법이 있나요? ㅠ

IBS에서 개발했다는 신델라 기사에서 신델라 기술은 모든 암 형성 과정에서 공통으로 생성되는 InDel 돌연변이의 DNA 이중나선을 잘라 DNA 손상복구를 막음으로써 암세포를 죽인다. 는 부분이 있습니다. 모든 암 형성 과정에서 공통으로 생성되는 InDel은 어떤 게 있나요?(기능/특징)

90도 이상의 고온에서는 DNA가 변성될 수 있어서 90도 이하의 온도에서 PCR을 진행하여야되나요? 내열성 효소가 있기 때문에 고온에도 변성되지 않고 버티는걸로 알고 있는데.. denaturation 단계에서도 94도 온도에서 진행하는데 이때도 DNA가 변성될 위험이 있는건가요?

total volume 20ul Final conc. 1.0ug 일때 DNA(1ug/ul)의 volume의 값은 어떻게 구하나요? 10X Reaction Buffer의 경우 Final conc. 1X로 volume 값은 2로 구했는데 이 방법처럼 구하면 되는건가요? 이 방식대로 계산하면 volume이 20ul 나오는데 맞나요? 그리고 10X Buffer에서 volume이 2가 나왔는데 이것만으로 Final conc. 알 수 있나요??

total volume 100µl final concentration이 1µg/µl 이 조건에서 sample 값과 DW를 구해야되는데 sample 1 농도(µg/µl) 14 일때 sample 7.1µl DW 92.9µl 이렇게 구했는데 final concentration이 10µg/µl 경우 sample과 DW 구하는 방식이 달라지나요?

 gene editing으로 donor vector의 gene을 KI하는 실험을 하고 있습니다. 여태까지는 ZFN vetor (R/L), ZFN donor vector에 원하는 gene을 nuclofection으로 잘 넣어왔습니다. addgene에서 받은 vector이고, HA는 각 800 bp가 조금 넘습니다.  최근에는 ZFN 대신 Crispr/Cas system으로 KI을 전환하려고 합니다. 여태 써왔던 동일한 target에 ZFN R/L 대신 gRNA+Cas9을 RNP로 넣고, donor vector를 그대로 쓰려고 합니다. 그런데 ZFN 때는 딱 cleavage 양 옆으로 HA이 맞아 떨어졌는데, CRISPR cut site는 11bp 정도 떨어져있더라구요. 이 경우에도 제대로 KI이 될지? 경험자분의 의견을 여쭈어봅니다. 그리고 off-target이 적은 target sequence가 하나 더 있는데, 이 경우에는 아예 170 bp 정도 떨어져있습니다. 이 쯤되면 그냥 HA을 새로 design하는게 나을까요? 사실 저희 연구실과 제가하는 일은 gene editing과는 관계없는 곳이라, 가능하면 addgene에서 받은거에 최소한의 일만 하고 싶어서요.    미리 답변에 감사드립니다.   

CRISPR Cas9을  sgRNA plasmid Cas9 plasmid dornor oligo 이렇게 실험 중인데 haplotype이 나오면 sanger에서  two peak이 떴다가 single peak이 떴다가 하나요? 두 번을 읽었는데 한번은 에디팅 전 후의 double peak이 뜨고 한 번은 에디팅 전의 원래 peak이 뜹니다.   어떤 것을 믿어야할까요?

virus의 double strand DNA 유전체는 1.0x105 kD 분자량을 지닌다. 뉴클레오타이드 AMP GMP TMP CMP의 각 분자량은? 4개의 평균값은?

DNA extraction 시 PCI용액을 넣어주는데 PCI용액이 든 병에 상층액과 하층액으로 나누어져 있더라구요 여기에서 상층액은 넣지 말고 하층액만 넣어서 실험을 했는데 상층액은 왜 있는 것이고 무슨 성분의 시약인가요?