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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > DNA Modification
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Q. Triple KO (TKO) 제작 시 selection
안녕하세요, TKO 만들다가 너무 애먹고 있어서 도움을 요청하려고 합니다. 첫번째 KO을 stable하게 만들때 blasticidin selection을 이용하였고, 두번째에 CRISPR gRNA-Cas9-Puro 발현을 이용하여 퓨로마이신 selection 이용하여 selection 하고 세번째로 gRNA-GFP 발현을 이용하여 sorting 하려고 했는데 GFP sorting 에 어려움을 겪고 있습니다.   혹시 클로닝을 이용할수 있거나 완제품으로 판매중인 plasmid중 blasticidin 과 Puro 와 겹치지 않는 selection 방법이 있을지요..   항생제 selection이 아무래도 가장 빠를것 같아서 겹치지 않는 항생제를 찾고 싶은데 일반적으로 TKO를 어떤 방법으로 만드는지 궁금하여 여쭤봅니다.   부디 도움 주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 JMadison  |  07.07
Q. dDNA가 무엇인지 알수있을까요?
항생제를 dDNA에 넣어서 design하여 integration하여 지켜보자 라는 말씀을 박사님들께서 하시는데 무슨 뜻인지 이해가 안가서요…
회원작성글 졸린라이언  |  06.29
Q. DNA 전기영동 band
    DNA double cutting 하여, 전기영동을 해서,  100bp 작은 사이즈를 볼려고, 50V_ 40분 3% agrose gel로 내렸는데,,  100bp 부분에 시커멓게 나와서 ㅠ  2%로 해도 똑같이 나오더라고요 ㅠ 100bp  부분에 시커멓게 안나올 수 있는 방법이 있나요? ㅠ
회원작성글 dhehfl  |  06.24
Q. 암 공통 indel
IBS에서 개발했다는 신델라 기사에서 신델라 기술은 모든 암 형성 과정에서 공통으로 생성되는 InDel 돌연변이의 DNA 이중나선을 잘라 DNA 손상복구를 막음으로써 암세포를 죽인다. 는 부분이 있습니다. 모든 암 형성 과정에서 공통으로 생성되는 InDel은 어떤 게 있나요?(기능/특징)
회원작성글 햇  |  06.16
Q. PCR 진행온도
90도 이상의 고온에서는 DNA가 변성될 수 있어서 90도 이하의 온도에서 PCR을 진행하여야되나요? 내열성 효소가 있기 때문에 고온에도 변성되지 않고 버티는걸로 알고 있는데.. denaturation 단계에서도 94도 온도에서 진행하는데 이때도 DNA가 변성될 위험이 있는건가요?
회원작성글 gksdnfl  |  06.15
Q. DNA volume 값
total volume 20ul Final conc. 1.0ug 일때 DNA(1ug/ul)의 volume의 값은 어떻게 구하나요? 10X Reaction Buffer의 경우 Final conc. 1X로 volume 값은 2로 구했는데 이 방법처럼 구하면 되는건가요? 이 방식대로 계산하면 volume이 20ul 나오는데 맞나요? 그리고 10X Buffer에서 volume이 2가 나왔는데 이것만으로 Final conc. 알 수 있나요??
회원작성글 어니언 아몬드  |  06.15
Q. DNA 농도 값을 구할 때 final concentration
total volume 100µl final concentration이 1µg/µl 이 조건에서 sample 값과 DW를 구해야되는데 sample 1 농도(µg/µl) 14 일때 sample 7.1µl DW 92.9µl 이렇게 구했는데 final concentration이 10µg/µl 경우 sample과 DW 구하는 방식이 달라지나요?
회원작성글 유윤윱  |  06.15
Q. CRISPR KI때 cleavage site와 HA의 위치 관련
 gene editing으로 donor vector의 gene을 KI하는 실험을 하고 있습니다. 여태까지는 ZFN vetor (R/L), ZFN donor vector에 원하는 gene을 nuclofection으로 잘 넣어왔습니다. addgene에서 받은 vector이고, HA는 각 800 bp가 조금 넘습니다.  최근에는 ZFN 대신 Crispr/Cas system으로 KI을 전환하려고 합니다. 여태 써왔던 동일한 target에 ZFN R/L 대신 gRNA+Cas9을 RNP로 넣고, donor vector를 그대로 쓰려고 합니다. 그런데 ZFN 때는 딱 cleavage 양 옆으로 HA이 맞아 떨어졌는데, CRISPR cut site는 11bp 정도 떨어져있더라구요. 이 경우에도 제대로 KI이 될지? 경험자분의 의견을 여쭈어봅니다. 그리고 off-target이 적은 target sequence가 하나 더 있는데, 이 경우에는 아예 170 bp 정도 떨어져있습니다. 이 쯤되면 그냥 HA을 새로 design하는게 나을까요? 사실 저희 연구실과 제가하는 일은 gene editing과는 관계없는 곳이라, 가능하면 addgene에서 받은거에 최소한의 일만 하고 싶어서요.    미리 답변에 감사드립니다.   
회원작성글 GATA3  |  05.17
Q. CRISPR Cas9 haplotype
CRISPR Cas9을  sgRNA plasmid Cas9 plasmid dornor oligo 이렇게 실험 중인데 haplotype이 나오면 sanger에서  two peak이 떴다가 single peak이 떴다가 하나요? 두 번을 읽었는데 한번은 에디팅 전 후의 double peak이 뜨고 한 번은 에디팅 전의 원래 peak이 뜹니다.   어떤 것을 믿어야할까요?
회원작성글 새슬  |  05.11
Q. 뉴클레오타이드 분자량
virus의 double strand DNA 유전체는 1.0x105 kD 분자량을 지닌다. 뉴클레오타이드 AMP GMP TMP CMP의 각 분자량은? 4개의 평균값은?
회원작성글 Winteria  |  05.05
Q. DNA extraction
DNA extraction 시 PCI용액을 넣어주는데 PCI용액이 든 병에 상층액과 하층액으로 나누어져 있더라구요 여기에서 상층액은 넣지 말고 하층액만 넣어서 실험을 했는데 상층액은 왜 있는 것이고 무슨 성분의 시약인가요?
회원작성글 바이오팜  |  04.17
Q. DNA추출실험
안녕하세요 DNA추출실험을 할때 마지막 과정에 DNA pellet을 0.1x SSC solution에 녹이고 나노드랍을 찍어 purity를 확인했는데 SSC solution에 왜 녹였는지, 이 용액의 역할은 무엇인지 알려주실 수 있을까요?
회원작성글 바이오팜  |  04.17
Q. PDO 봉합사 동물시험 의뢰 기관
연구실에서  PDO 봉합사에 식물추출 PDRN 코팅을 하여 전임상 동물실험을 공인기관에 의뢰를 하고 싶은데 봉합사 시술에 관한 프로토콜을 가지고 있는 곳이 없더라구요 혹시나 아시는 곳 있으면 많은 답변 부탁드립니다. 시험은  이미지 분석(주름), (면적) In vivo(콜라겐 증가율) (염증인자 감소율)   정도 확인하려고 합니다
회원작성글 무낵  |  03.24
Q. 세포를 죽이지 않고 플라스미드 제거 하는 방법을 설명해주세요
과제 연구를 기획중입니다.  과제 연구의 주제를 세포를 삼고 돌연변이를 관찰하는 실험을 하고 싶은데, 여기서 너무 손이 많이 가는 플라스미드를 제거해서 관찰 하고 싶습니다.  세포가 살아있어야 하는데, 검색 해보니 플라스미드 추출 밖에  없어서 플라스미드를 제거한 살아있는 세포 만드는 법을 알려주세요 :(  
회원작성글 뿔난오리  |  03.15
Q. 금나노입자 Thiol기 올리고머 부착 확인 할 수 있는 방법이 뭐가 있을까요?
금나노입자에 [thiol]-DNA 올리고머를 부착하려고 합니다   부착이 제대로 되었음을 확인 할 수 있는 방법이 무엇이 있을까요?    
회원작성글 난홉아  |  03.08
Q. 미생물의 overexpression에 대해 궁금한 것이 있습니다!!
안녕하세요    미생물의 DNA work를 공부하고 있는 대학원생입니다.   다름이아니라 overexpression을 위한 primer design을 공부 중 이해되지 않는 것이 있어서 질문드립니다!   첫번째로, forward와 reverse primer 모두 시작점에 random bp가 들어가야 하는데, 이것은 enzyme을 supporting해주기 위해서라고 합니다. 어떻게 suppoting 해주는 걸까요...?   두번째로, Ribosome binding site (RBS)는 forward primer에만 추가해야 하는데 이유가 무엇일까요?    세번째로, primer에 G,C의 숫자가 많으면 Tm이 증가하고, A,T가 많으면 Tm이 감소하는데 그 이유가 무엇일까요?   논문들, 프로토콜들 찾아서 공부하고 있는데 이부분은 찾기가 쉽지않아서 질문드립니다 ㅠㅠ    답변부탁드리겠습니다!!
회원작성글 DS.K  |  03.02
Q. plasmid construction 도중 유전자 변형
wildtype에서의 아미노산은 leucine입니다만, E.coli에서 발현이 되지 않습니다. 스스로 유전자 변형을 일으켜서 proline으로 돌연변이화 합니다,  이 단백질이 있으면 e.coli의 peptidoglycan 형성과정에서 peptidoglycan의 중간체가 다른 물질로 변경됩니다. e.coli의 생존에 영향을 미치고있어서 유전자변형을 하고 있는것 같습니다만, 해결 방법이 있을까요 
회원작성글 단백질결정  |  02.04
Q. magnetic beads DNA추출 질문드립니다
magnetic beads 에서 beads가 DNA추출에서 DNA만 magnetic하는 원리가 무엇일까요? 왜 DNA만 뽑아낼수 있는건지 너무 궁금해서요
회원작성글 생명학도  |  01.12
Q. CRISPR/Cas9을 통한 Indel % 확인
안녕하세요, CRISPR/Cas9을 사용하여 원하고자 하는 gene의 KO을 진행시키고 있습니다. CRISPR/Cas9과 design한 sgRNA의 gene editing efficiency를 확인하기 위하여 우선 간단한 방법인 T7EI assay를 진행하였고, gel 상에서 식을 이용하여 계산해보니 약 10%정도의 NHEJ%라고 할 수 있는 값을 얻었습니다. 그러나 T7EI assay 같은 경우에는 실제 일어난 genome editing efficiency를 underestimate하고 또한 차이가 많이 날 수 있다는 것을 알고 있기 때문에, sanger sequencing을 한 다음 deconvolution tool인 TIDE를 활용하여서 대략적인 efficiency를 확인하고자 하였습니다. 하지만 실제 sequencing을 한 다음 TIDE를 돌려보니 4%로 값이 계산이 되었습니다. 다양한 parameter들을 조정해보았지만 값은 크게 변하지 않고 T7EI보다 더 낮은 수치를 보였습니다. 혹시 이에 대한 이유가 어떤 것이 있을까요? 일반적인 업체에서 하는 sanger sequencing이 아닌 다른 특수한 method가 필요한가요? 경험이 있으신 분들의 답변을 듣고 싶습니다.   감사합니다.        
회원작성글 주니어와퍼세트  |  2021.12.30
Q. 제조사가 다른 restriction enzyme의 혼용은 어떻게 해야되나요??
안녕하세요 현재 cloning을 진행하고있는데  지금 생각지 못한 문제점이 생겨서 질문드립니다.  저희랩에서 보통 enzynomics 사의 제한효소를 사용하는데요  cloning에 쓸 enzyme이 enzynomics사에 없어서 NEB 사 제품을 추가로 주문했습니다.  그런데 문제가 제가 지금까지는 같은 회사의 제품만 사용을해서  타사 제품을 같이 혼용해도 되는지와  회사별 버퍼 조성이 다른데 어떤 버퍼를 사용할지, 쓴다면 괜찮은지가  의문이 들어서 질문드립니다.  현재 사용하고자 하는 것은  1. NdeI(Enzynomics) / NsiI(NEB) 2. AatII(Enzynomics) / BsrGI(NEB) 이구요  Enzynomics 두 enzyme의 버퍼 조성은 같고 다음과 같습니다.  20mM Tris-acetate(pH7.9) 50mM potassium acetate 10mM magnesium acetate 100 ug/ml BSA   NsiI의 경우 100mM NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 100 µg/ml Recombinant Albumin (pH7.9)   BsrGI의 경우 50mM NaCl 100mM Tris-HCl 10mM MgCl2 100 µg/ml Recombinant Albumin (pH7.9)   입니다. 이런 경험이 있으신 선배님들의 답변 기다리고있겠습니다. 감사합니다.
회원작성글 soonlok  |  2021.12.21
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