PCR을 했는데 원래 detect 되어야하는 size에서는 band가 안나오고 2번째 line과 같이 100bp 이하에서 band가 나왔습니다... 다른 유전자가 검출된 건가 싶어 Gel extraction, TA-cloning후 prep 해서 sequencing을 보냈는데 결과에서 다른 유전자가 아닌 T-vector로 나옵니다. 이유 알고계신 분 있으시면 꼭 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ 감사합니다.  

정상적으로 결과가 나왔다면 band가 저것보다 훨씬 짧아야 했구요 ㅠㅠ band 휘어짐이 너무 심합니다 이유가 뭘까요? 아가로스 겔은 조교님이 만들어주신 1% 짜리로 했습니다 

  안녕하세요.. 현재 Site-directed mutagenesis를 하고있는데 colony가 안떠서 난항을 겪고 있습니다..   vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고, primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.   snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것입니다.    Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 한다는데.. 무튼 protocol은 다음과 같이 하였습니다..   PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 200ng PCR cycle :    95°C 30s 95°C 30s 55°C 60s 68°C 2:30s (1kb/30s로 조금 넉넉하게 줬습니다.) step 2부터 X 18  68°C 13:00   PCR이 완료되면, 바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation    그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 40min 돟안 shaking incubation   마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading       제가 예~전에 해당 protocol로 했을 때는 잘 했었던것 같은데, 그때랑 달라진건 polymerase 종류 (회사) 정도? 그래서 사실 high fidelity Pfu 다른 회사 2종류로 test 해봤는데도 역시 안뜨더군요..   무엇이 문제일까요...   선생님들의 지식을 조금만 나누어주시면 감사드리겠습니다.. ㅠㅠ

안녕하세요 assembly PCR이 너무 안되어 질문 올려봅니다... 두 gene을 10cycles을 돌려 assembled fragment를 확보하고(gel extration도 이용해봄) 다시 primer를 넣어 amplify를 시도하는데 계속해서 원래 두 개의 gene이 분리되어 나옵니다.. method의 문제로 일어나는 일 일까요?  첫번째 사진이 10cycles 후 사진이고, 두번째는 첫번째의 네모박스 사이즈의 dna를 gel extraction으로 분리 후 primer와 함께 amplify 한 사진입니다      

RNA template에서 oligo dT나 random hexamer와 Reverse transcriptase를 사용해서 RNA-DNA helix를 생성하고 RNase H를 사용해서 RNA만을 분해한 다음(ssDNA만 남고), DNA polymerase로 dsDNA로 합성해준다고 알고 있습니다. 그런데 여러 회사에서 파는 cDNA 합성 kit에는 왜 DNA polymerase가 없는 건가요? 그냥 RNA-DNA helix를 PCR에 사용하는 건가요?   그리고 저희 실험실에서는 Bio-RAD의 iScript cDNA synthesis kit를 사용하는데, 여기서 제공되는 RT는 RNase H+라고 하더군요 근데 RNase H는 RNA를 분해한다고 하는데, 그럼 최종 합성 prouct가 sscDNA로 남는걸까요?  

안녕하세요 현재 cloning을 하기 위해 PCR을 진행하고 있습니다. 3,600bp 정도 되는 insert를 PCR 뜨고 있는데 문제는 pfu pol이 아닌 그냥 taq pol을 써서 뜨면 잘 떠지는데 pfu pol로 뜨는 순간 바로 밴드가 안뜨더라구요.. 아무래도 3.6kb 정도 되는 insert를 따다 보니 막택으로 뜨면 잘 떠지더라도 sequencing을 해보면 point mutation이나 deletion이 되어 있더라구요.. 그래서 pfu pol로 뜨고 싶은데 같은 회사 polymerase라도 pfu냐 taq이냐 에 따라 안떠지는데 이럴 땐 어떻게 해야하나요ㅠㅠ

SCR1, TKL2, REI1에 대한 cDNA를 합성하였다고 가정하였을때 만약 전혀 다른 유전자인 ‘HXT5’에 대한 real time PCR을 진행할 경우에는 어떤 실험결과가 나올지 분석하려고 하는데,,, 여기서 궁금한게 앞서 합성한 SCR1, TKL2, REI1유전자는 HXT5 유전자의 RT PCR 결과와는 완전 무관한거 아닌가요??ㅠㅠ 그냥 독립적으로 HXT5 유전자에 RTPCR결과만 놓고 보면 되는거죠??   

대부분 rt pcr 이나 pcr을 할때 사실 저는 primer tm값이나 cycle 조건을 따지지 않고 annealing 58도 30초 72도 30초 이렇게 35cycle 로 돌려버리는 편이고 Bioneer accupower premix 로 우선 돌려봤다가 안나오면 phusion plus 로 해보면 왠만하면 나오더군요 근데 문제는 저렇게 해서 안나오는거는 뭐부터 바꿔야되는지 앞이 안보이더군요 그래서 혹시 pcr 이 안될때 어떤 workflow 를 가지고 실험을 하시는지 궁금하고 또한, 자주쓰는 polymer 나 회사 같은거 추천해주시면 고맙겠습니다

DNA, RNA 등을 EtBr과 유사한 SafeView로 염색해서 agarose gel에 로딩해 관찰하고 있습니다. UV transilluminator를 구매하려고 하는데, 모델이 365nm랑 312nm로 두 가지가 있습니다. 두 모델 가격 차이도 좀 나는데, 두 파장 중 어떤 것이 더 맞는지 잘 모르겠습니다. 사용하는 SafeView는 흡광 파장이 490~265nm입니다.  

안녕하세요 현재 대학원에서 인턴을 하고있는 학부생입니다. 문득 선배님들이 하시는 pcr을 보고 template을 어디서 얻어오는건가 궁금해서 질문을 남기게 되었습니다. gRNA, cloning 할 vector에 들어가는 유전자 부분을 가지고 오기위해서 primer를 제작한다는건 이해가 가는데 거기에 들어있는 유전자들은 어디서 가져오는건지 따로 primer처럼 주문해서 제작하는건지 여쭤봐도 될까요?

multiplex로 qPCR 진행했는데 연두색은 cy5-bhq2 / 빨간색은 fam-bhq1로 진행했습니다. 근데 연두색은 곡선이 매끄러운 반면, 빨간색은 곡선이 매끄럽지 않은데 왜 그런지 알고 싶습니다..ㅜㅜ 해결방안도요..! probe, primer 때문인가 싶어서 새로 희석해서 qPCR 진행하여도 빨간색은 계속 저렇게 곡선이 매끄럽지 않게 나옵니다,.,

안녕하세요 초초초보 학부생입니다. PCR을 선배님께서 시키셔서 하고는 있는데 이해가 안가서요. circular 벡터에서 제가 원하는 site가 있는 부분을 얻울수 있게끔 primer를 제작해서 PCR을 돌리면 원하는 부위만 잘려지게 되는 원리인가요?

pcr을 진행하려하는데요 denature temperature이 어느분은 95도 어느분은 98도로 진행하셔서요 보통 어느정도로 진행들 하시나요? 95도 와 98도로 올렸을때의 차이가 클까요?

 PCR 조건을 잡고 있어요. 논문에 있는 내용에서 조금씩 바꿔가면서 잡고있는데, 벽에 부딪힌 느낌이라 도움을 받고자 글을 씁니다. 각  PCR 조건은 사진에 적어두었습니다. 1) 잡밴드를 없애고, 단일밴드를 보기위해서는 무엇을 더 변경해 볼 수 있을까요? 지금 생각중인건, extantion time을 30초로 줄이는 것, denaturation time을 5분으로 줄이는 것.. 정도인데, 이렇게 줄인다고 잡밴드가 사라질지도 모르겠고..    2) exon 1같은 경우는 아~무런 밴드가 나오지 않아서 문제입니다..  왼쪽 사진 결과는 anaeling timp.을 58도로 올려서 진행했던 건데 안나오더라고요. 온도를 더 올릴지 내릴지도 고민입니다.   환자 DNA라서 이제는 횟수를 조절해야해서 같은 조성에 반응 시간만 바꾸는거라 시도를 못하고 있습니다. 조언 부탁드립니다.

안녕하세요.    Extracted mRNA로부터 만들어진 cDNA를 증폭할 때, 왜 primer를 forward와 reverse.. 이렇게 두 개를 쓰나요?   mRNA는 genomic DNA strand 중 single strand로부터 유래하기 때문에, 당연히 mRNA도 single strand로 존재하고, 그에 따라 당연히 해당 mRNA로부터 유래한 cDNA 또한 single strand로 존재합니다. 따라서 이 때, primer는 forward만 사용하면 될 것 같은데.. 왜 reverse primer까지 PCR 할 때 추가해야합니까? 어차피 추출한 mRNA에 대한 상보적인 sequence를 가진 strand가 없기 때문에 reverse primer는 넣어줘도 작용하지 않을 것 같은데.. 고수님들 고견 부탁드립니다.

3,4,5,6,7번 primer가 전부 안뜨고 8,대조군만 뜹니다 이게 왜 그런지 잘 모르겠습니다... 참고로 1번은 primer 0ul, 2번은 primer 1ul, 3번은 primer 5ul (여기까지 primer 1pmol/ul 농도로 사용) 4번은 1ul, 5번은 1.5ul, 6번은 2ul, 7번은 4ul, 8번은 5ul, 대조군은 2ul primer 10pmol/ul로 사용했습니다.

primer 주문하고 1 band 뜨는지 PCR로 확인할 때 RNA를 사용하라고 배웠는데 cDNA를 사용해도 상관없나요?

Biological 3 반복 Technical 3반복 ㅎ해서 총 9반복으로 진행했는데 .. ……B1……B2….. B3 T1……21…… 23 …..24 T2 …..21…….23…… 24 T3……21…… 23….. 24 이렇게 biological 간의 ct값 차이가 큰데 괜찮은 건가요.? 각각 샘플이 다른건 맞지만 biological로 같은 실험군에 속하는 건데 ct값 차이가 커도 되는지… ……..B1____B2 ____B3 T1___21____18_____ 19 T2___21___ 18 _____19 T3 ___21 ___18 ____19 프라이머마다 비슷한 ct값이 나오는 것도 있지만 어떤 프라이머에사는 위처럼 ct값이 biological마다 다르게 나올때가 있는데 이런 상황이 괜찮은건지 궁금합니다ㅠㅠ Melting curve는 one peak로 잘 나왔습니다…

  안녕하세요 근래에 qPCR을 진행하고 있는 대학원생입니다.... 다름아니라 제가 현재 pUC19 plasmid를 사용하여 qPCR을 진행중에 있는데 plasmid를 serial dillution하여 qPCR을 진행하였을 때 자꾸 낮은 농도의 sample에서 원치않는 melt peak를 확인하여 이에 관해 조언을 구하고자 질문드립니다....... 저는 이것이 qPCR로 측정하기에 너무 낮은 농도여서 이렇게 뜬다고 판단을 하고 있습니다... 지식이 풍부하신분들께 조언을 구하고 싶습니다....   pUC19에서 target한 부분은 ampr부분이며   qPCR condition은 pre denaturation  95도   2min denaturation        95도    30s annealing            55도   30s extension            72도    5s melt curve작성 으로 진행하였습니다....   qPCR 사진을 첨부드립니다..... cq 값이 높은 것이 높은 농도의 sample(10^11 copy)이며    낮은것이 낮은 농도(10^5 copy)의 sampleㅇ 입니다. melt curve 시뮬레이션을 통해 약 87도에서 peak가 뜬다는 것을 확인하였고, 높은 농도(10^11 copy)를 돌렸을 때는 peak가 잘 떳다고 판단되었으나 10^5 copy의 낮은 농도 sample에서는 peak가 요상하게..... 나왓습니다.......   추가 실험으로 더 낮은 농도도 돌려봤는데 그것도 요상한 peak가 나타났습니다......   읽어주셔서 정말 감사합니다...

타겟 식물에서 UGT 유전자에 대해 primer를 설계해서 타겟 식물의 UGT 유전자 서열이 NCBI에 없어서 시퀀싱하여 다른 종들과 alignment해 보고자 하는데,   primer를 설계할 때 같은 유전자를 갖는 다른 종의 염기서열을 이용해서 primer를 설계하여 PCR을 돌려보는 것은 시도해볼 만한 괜찮은 접근인가요??   찾은 논문에서는 Rhodiola에서 적용할 primer를 애기장대와 같은 다른 식물의 염기서열을 이용하여 primer를 짜서 사용한 거로 이해해서 질문드립니다.   참고논문 : Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for High-level Production of Salidroside from Glucose