qrt-pcr 할때 Plate를 8개의 튜브가 한줄로 연결되어있는 튜브를 사용하였었는데 실험실에 이제 튜브를 거의 다 써가고 예전 선배님들이 쓰시던 plate가 많이 남아있어서 사용하려고 하는데 의문이 있습니다. 96well pcr plate로 모두 분주후에 sealing film을 붙이는데요. 원래 사용하던 튜브로 할때는 rt-pcr 돌리기전에 centrifuge로 spin down을 시켜주는데 96well plate는 어떻게 spin down을 시켜줘야하나요? 도와주세요ㅜㅜ 

안녕하세요, real-time pcr을 배우고있는 석사학부생입니다. 이번에 conventional pcr과 real-time pcr의 차이를 찾아보고 있는 도중 real-time pcr 과정에서 Ct값을 확인해서 증폭값을 확인할 수 있는데, 내가 원하는 target template만 증폭됐는지 알기는 전기영동을 하지 않는이상 어렵지 않나요..? 그런데 다른 선배님들은 전기영동을 따로 하지 않으시더라구요.. 아직 배우고있는 과정이라 궁금한게 많습니다. 도움 부탁드립니다.

안녕하세요.  실험 중 궁금한 점이 있어 질문올립니다. viralRNA를 qPCR로 검출하는 실험 중 plateau의 RFU값이 낮게 나오는데, 원인을 모르겠습니다.   실험 과정은 1) 백신에서 추출한 viral RNA를 onestep qRT-PCR로 검출시 그래프가 잘 그려졌습니다. 2) 문제는, 실제 바이러스와 백신에서 각각 추출한 viral RNA를 twostep qRT-PCR로 검출 시 바이러스에서 추출한 cDNA의 최종 RFU값이 낮게 그려집니다. 백신에서 추출한 cDNA의 경우 최종 RFU값이 이전처럼 높게 나오구요. ct값은 오히려 바이러스에서 추출한 샘플이 높게 나옵니다. - 2번 실험에서 qPCR은 qiagen의 quantitect onestep mix에서 RT만 빼고 사용했습니다. 혹시 이게 문제가 될 수 있을까요? 의견 부탁드리겠습니다!

안녕하세요. PCR primer를 디자인할때 어떻게 고르면 잘 고를 수 있을지 질문하고 싶어서 글 남깁니다.   제가 primer-blast를 여러 조건을 넣고 돌렸는데, 사진처럼 여러 프라이머가 나옵니다.   원래 여러 프라이머가 나오는건 알지만 문제는 프라이머끼리 겹치는 부분 때문에 어떤 것을 선택하면 좋을지 잘 모르겠다는겁니다...   혹시 기준 같은 것이 있을까요? 알려주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ

안녕하세요. 신입 대학원생이라 조언을 구하고 싶어 글 몇 자 적습니다... 실험실에서 보유하고 있는 plasmid와 vector가 제가 원하는게 맞는지 확인하고 싶은데, (plasmid, vector는 각각 별개로 확인하고 싶은 것) 1. 25 bp 내외의 Forward, Reverse primer 제작 2. plasmid, vector + primer을 이용해 pcr 진행 3. gel에서 내려서 primer가 제대로 특정부위를 증폭했는지 확인   이렇게 해서 plasmid, vector가 제대로 된 것인지 확인하고 싶은데 이렇게 진행해도 되는지 감이 오지 않아 질문드립니다... 선배님들께서 혹시 별도의 과정이 필요한건지, 아예 실험 계획 자체가 잘못되었는지 조언 구합니다. 바쁘신 화중에 제 글을 읽어주셔서 감사합니다.

  안녕하세요. qPCR을 사용하여 실험을 진행하였는데 multi peak가 떠서 조언을 구하고자 질문드립니다... 기존에 제작한 primer 서열을 사용하였습니다.,, 기존 primer와 새로 구매한 primer를 함께 돌렸는데 새로 주문한 primer를 사용한 결과에서 multi peak가 떴습니다... 실험에 박식하신 분들께 조언을 구하고 싶습니다... 감사합니다...     green이 기존 primer.  red가 새 primer입니다..  

안녕하세요.. 기본적인 질문이지만 확인하고 싶어 올려봅니다... 사용하는 PCR kit 는 genescript 사의 제품을 사용하고 있습니다. 총 volumn 50 ul 중 2ul가 template라고 프로토콜에 명시되어 있습니다. 여기서 template를 100ng/ul를 2ul 넣게되면 25배로 희석되니 4ng이 들어가는 것이 맞나요? 하지만 논문에서는 최소 10ng 이 25ul에 들어가야 한다고 하니 2.5*2=5배 양을 더 높이고 D.W. 를 줄이는 것이 맞나요? 학과 선배는 논문에서 명시는 안되어있지만 gDNA를 희석 (1/2~1/10으로)하여 2 ul를 넣어야 한다고 하여.. 혼란을 겪게 되어 질문드립니다. 기본적인 질문 드려서 죄송합니다.

바이오니아의 genomic dna extraction kit로 구강 상피세포의 human gdna를 추출해서 전기영동으로 그 크기를 확인하는 실험을 해보고 싶은 고등학생입니다.. 그런데 추출 키트로 뽑아낸 dna는 pcr 없이 전기영동으로 그 크기를 확인하기에 턱없이 부족한가요?

real time PCR dye 제가 쓰는 CFX96은 JOE가 없어요.. 그래서 찾아보니 HEX와 파장이 비슷하던데 HEX로 읽어도 될까요?  아니면 Cal gold 540도 비슷하던데 괜찮을까요? 어차피 JOE는 IC (Internal control)입니다 sample dye는 있는데 IC dye가 없네요.. 아시는 분 알려주세요ㅠㅠ

안녕하세요 학부 연구생입니다. 제가 pcr 기계를 돌려야하는데 궁금한게 있어 질문드립니다. 현재 쓰는 기계는 eppendorf거구요, 사진에서 보이는 것 처럼 구멍이 두개가 있는데 튜브를 어디에다가 넣고 돌려야하는지 잘 모르겠습니다. 사용중인 튜브는 0.2ml이고 둘 다 넣어봤을때 들어가긴합니다. 다만 큰 구멍은 아주 약간 공간이 남고 작은거는 좀 꽉끼는 것 같습니다.  구글링을 아무리 해봐도 대부분의 기계가 구멍은 한개씩만 있고 이렇게 두개가 있는거는 없는거 같은데 혹시 써보신 선배님들 있으시면 답변 부탁드리겠습니다. 감사합니다.

PCR 기법을 습득하는데에 어려움이 있어 도움을 받고싶습니다. 1. 우선 프라이머 forward reverse를 따로따로 주문하여 받았는데, pcr 돌릴 때 샘플 넣는 한개의 pcr tube에 forward reverse primer를 동일량으로 반씩 넣으면 되는 건가요? 2. 참고한 논문에서 PCR amplification conditions on the Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System: 58'C for 5 minutes; 95'C for 2 minutes; 40 cycles of 95'C for 15 seconds and 60'C for 60 seconds. 이라고 적혀있는데, 58'C - 95'C - (95'C-60'C)x40 이렇게 진행된다는건가요? 처음을 58'C로 시작하는건 선배들 pcr template중에 없엇거든요ㅠ 3. 상대정량위해 GAPDH로 nomalization할 예정인데, gapdh 세팅값은 95'c - 54'c 20cycle -72'c로, 제가 쓸 프라이머들이랑 세팅값이 다릅니다. pcr 돌릴 때 예를 들어 8-strip-tube를 사용하면, 한 줄 튜브에 같이 못돌리고 따로따로 돌려야 되는것인가요?  

왼쪽이 ladder이고 오른쪽이 pcr product입니다. 전기영동했을때 자꾸 아래의 사진처럼 밴드가 찌그러진 듯한? 형태로 나오는데 왜그럴까요? ladder도 밴드처럼 찌그러진 형태를 보이는것 같습니다. 그래서 pcr보다는 전기영동 시에 문제가 있었던것같은데요.. ladder에서 작은 크기 부분은 정상적인 것 같기도 한데.... 혹시 이런 경험 하신분있나요ㅜㅜ

안녕하세요 PCR 후 전기영동한 gel에 사진과 같이 기포가 생성되었습니다.  겔 제작시  1. 어느정도 식은 겔을 틀에 붓는다. 2. 붓는 과정에서 생긴 공기방울 및 먼지 제거한다. 3. 굳힐 동안 먼지가 들어가지 않게 호일로 덮어둔다.    제작시 먼지와 공기방울의 영향은 크게 없을거라 저는 생각이 듭니다.   선생님들의 의견을 알려주시면 감사드리겠습니다.

저는 어떤 유전자의 조직별 발현량을 확인하고 있습니다. 이 유전자의 프라이머를 디자인하고, 밴드도 확인하고 qpcr로 원픽이 뜨는지도 확인하고있습니다. 그런데 자꾸 특정 조직에서난 피크가 두개씩 뜹니다 ㅜ.. 프라이머를 몇번 더 바꿔봤지만 같은 결과가 나옵니다. 도대체 왜 이런건지 이럴땐 어떻게 해야하는지 알려주실수있을까요..

real time PCR dye JOE대신 HEX로 사용 가능한가요? 제가 쓰는 CFX96은 JOE가 없어요.. 그래서 찾아보니 HEX와 파장이 비슷하던데 HEX로 읽어도 될까요?  아니면 Cal gold 540도 비슷하던데 괜찮을까요? 어차피 JOE는 IC (Internal control)입니다 sample dye는 있는데 IC dye가 없네요..

같은 mixture 조건으로 벌크를 만들어서 25ul씩 넣어서 증폭을 하는데 4반복하면 2개는 증폭이 되고 1개는 10~20분 지연되어서 증폭되고 1개는 증폭이 안돼요 다시 해봐도 몇개는 증폭이 되고 몇개는 안되는게 자꾸 반복돼요. 따로 만든것도 아니고 한번에 만든 mixture에서 이럴수가 있나요? 차라리 증폭이 전부 안되면 mixture를 잘못 만들었구나생각할텐데 결과가 자꾸 흔들리니 의문이네요

(나와야하는데) 아무리 해도 안나오는 밴드가 있어서 다른 선생님께 조언을 구했더니 희석하지말고 써보라고 하셔서 그때부터 항상 그렇게 쓰고 있는데 (물론 안나왔습니다.. 프라이머 문제) 그렇게 쓰자고하니 매번 볼륨이 너무 많이 들어가서요.. 25ul cDNA 합성하면 1,000 ng 내외로 나오는데, 여기서 1ul 따서 넣는 것도 말하자면 전체 rx. 볼륨으로 봐선 희석돼서 들어가는 건데.. 어떤 차이인지 궁금하네요..

안녕하세요, Real-time qPCR 기기를 구매하려고 이리저리 살펴보다 잘 모르는 부분이 있어 고수님들의 고견을 구하고자 글 남깁니다. 제가 주로 활용하려는 방법은 Taqman probe assay로 real-time qPCR 분석을 수행하고자 하며, 사용하는 probe는 FAM(Reporter dye)/TAMRA(Quencher)입니다. 이에 맞는 qPCR 기기들을 살펴보다 보니 FAM 까지만 detect되고, TAMRA는 detect 안되는, 하지만 가격이 상대적으로 착한 보급형 기기들도 있더라구요!  Reporter dye로 FAM을 사용하고 Quencher로 TAMRA로 사용하는 probe의 경우, FAM과 TAMRA 모두 detect가 가능한 qPCR 기기를 사용해야 하는지, 아니면 FAM만 detect되는 qPCR 기기를 사용해도 무방할지 애매하여 문의드립니다. 혹시 아시는 분 있으시면 가르침을 구합니다. 감사합니다~

DNA 추출방법 중에 헷갈리는 부분이 있어 문의 드립니다. Lysis buffer (5mM EDTA, 200mM NaCl , 100mM tris-cl, 0.4% SDS) 1. Lysisbuffer 400ul protinase k 10ul 60도시 O/N 2. 3M potassium acetate 40ul 추가 3. Penol/chloroform/iso-amy alcohol 400ul 넣음 4. Centrifuge 13000RPM 15분 후 상층액 200ul 추출 5. 100% EtOH 500ul 넣음 6. Centrifuge 13000rpm 15분 상층액 버린고 pellet만 남김 7. 70%EtOH 800ul 넣고 centrifuge 13000rpm 15분 상층액 버리고 pellet만 남김 8. Air dye 10분 9. ddH2O , TEbuffer 20-50ul 넣고 4도시에 녹인다. 이방법으로 사용하고 싶은데요 질문은 1. 3M photassium acetate 만들때 ( MW 98.14)100ml 만들때 29.442g 넣으면 되는게 맞는지 2. Penol/chloroform/iso-amy alcohol 이 없을때 그냥 chloroform 이용해도 가능한지 궁금합니다. 아직 많이 부족하여 여쭈어 봅니다.

안녕하세요 dna extraction이후 농도가 84.4ng / ul이 나왔는데 이것을 100ng / ul로 맞춰야 합니다( 원하는 총 volume은 100ul라고 할 때에) 이럴 경우 100/84.4를 하면 1.2가 나오니까 1.2ul 를 따고, 100-1.2한 98.2를 buffer로 채워주면 되는걸까요 ? 제가 전공자가 아니라 잘 몰라서요.. 이게 맞는지, 그리고 다른 방법이 있다면 말씀해주시면 감사하겠습니다.