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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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Q. PCR 관련 조언 부탁드립니다.
안녕하세요. PCR 관련해서 조언을 얻고자 글 올립니다. 다른 DNA plasmid 몇 가지를 동일한 조건으로 PCR을 진행하였는데 다 비슷한 부분에서 band 가 생깁니다.... 원하는 부위의 band가 맞긴한데 나오면 안되는 샘플에서도 band가 나오니, 실험의 결과를 믿기가 어려워 조언 구합니다. 왜 이런 결과가 나타나는건지 아시는 분 있으시면 댓글 부탁드립니다. ㅠ.ㅠ 감사합니다.   동일한 primer F,R (농도 : 100pmol) / 5x PCR Master Mix (rTaq) / DW 를 사용했고, PCR 온도는 서치하면 나오는 기본적인 protocol 에 명시되어 있는 온도로 지정했습니다. (Tm 값은 primer 보다 5도 낮게 진행하였습니다.) * 1, 2, 3 모두 다 다른 샘플입니다.... 1, 3 은 원하는 band가 맞는데 2는 아예 band가 나오면 안된다고 생각했는데 나온거라 1, 3의 결과도 믿을 수 없는 상황입니다....ㅜㅜ    
회원작성글 실험알못  |  08.18
Q. real time pcr ct값이 이상합니다 도와주세요
안녕하세요 실험 햇병아리 대학원생 입니다! GAPDH 의 경우 어느 sample이든 CT값이 15-16정도 나오지만 target gene의 경우 scr sample은 CT값이 28, siRNA를 treat한 sample들은 CT값이 25정도 나와서 siRNA을 쳤는데도 불구하고 efficency가 내려가지 않고 오히려 올라가는 상황을 보입니다ㅠㅠ시약을 바꿔도 Sample을 다시 뽑아도 같은 결과가 나옵니다ㅠㅠㅠ 이유를 아시는분 있을까요? 도와주세요ㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 살려주세요  |  08.18
Q. dCT? ddCT?
qRT-PCR 결과 해석할 때 dCT, ddCT 방법 이해가 조금 어려워서 문의드립니다. 찾아보니까  delta CT 는 target CT - housekeeping CT 라고 하는데 2^-dCT 는 그러면 housekeeping gene 대비 target 하는 gene의 발현량만을 구하는 건가요? dCT 에 마이너스가 붙는 이유는 무엇인가요...? 그리고 ddCT 방법을 쓰는 목적도 알고 싶습니다..  
회원작성글 hazzy  |  08.17
Q. 희석하는법 도와주세요 급합니다
안녕하세요. 아직 희석 농도 구하는게 익숙치 않아서 질문 드려요ㅠ 도와주세요.. 두가지 상황이 있습니다. 1. 12개의 서로 다른 100마이크로몰 샘플을 섞어서 2마이크로몰 500마이크로리터를 만들려고 합니다. 2. 5개의 서로 다른 100마이크로몰 샘플을 섞어서 2마이크로몰 500마이크로리터를 만들려고 합니다. 샘플과 DW를 몇씩 넣어야 하는지 이해시켜주세요..ㅠㅠ  
회원작성글 도와줘욤흑흑  |  08.17
Q. dsRNA RT-PCR하려고 하는데 denaturation 단계가 궁금합니다.
제가 따라하려고 했던 논문에서는 dsRNA를 RT-PCR시에 Random hexamer + dsRNA mixture 를 95도에서 5분 정도 denaturation 후에 RT-PCR mixture (random hexamer 제외)를 넣고이후 과정을 진행하면 된다고 적혀있었는데요. 찾아보니까 또 다른데서는 dsRNA만 denaturation 후에 RT-PCR mixture를 넣으면 된다고 적혀있더라구요.  그런데 qPCR시, ct값에서 denaturation에 따른 차이가 나타나지 않아서요.. 제가 denaturation을 잘못하는건지 궁금해서 이렇게 여쭤봅니다. dsRNA를 RT-PCR시에 denaturation 단계를 어떻게 진행해야 하나요??
회원작성글 soor  |  08.17
Q. PCR nonspecific band 외
안녕하세요? 실험 중 궁금한 것이 생겨 질문드립니다. PCR 진행 후 Gel을 Run 했을 때 나오는 Nonspecific bands을 발견하였습니다만, 이것들이 문제가 되는 근본적인 이유가 무엇인지 궁금해졌습니다. (Nonspecific bands의 존재가 Primer의 Design이나 Temperature setting의 문제를 시사할지도 모른다는 것은 이해했습니다.) 만약 원하는 Amplification target이 명확하게 잘 보인다면, 이를 elusion하여 사용하는 추후의 실험 과정(Cloning)에서 Target과 멀리 떨어진, 상관 없어 보이는 Nonspecific bands는 어떤 영향을 줄 수 있을까요?  
회원작성글 팡피링  |  08.15
Q. pcr 관련
  안녕하세요. 분자쪽은 아무것도 모르지만 실험을 진행하게 된 예비 대학원생 입니다.!! 제가 DNA까지는 뽑았는데 PCR을 진행하려 여러 프로토콜을 찾아봤는데 궁금한게 있어서 질문합니다.  master mix 2x 가 있으면 프라이머(F,R), 주형DNA,뉴클리아제프리워터 만 있으면 되는거 맞나요?   만약 맞다면 마스터 믹스는 2X그대로 사용하는게 아닌 몇배 희석해서 사용해야하나요?  
회원작성글 닭튀기는꼬꼬  |  08.12
Q. qrt-pcr 96well plate 사용법에 궁금한게 있습니다
qrt-pcr 할때 Plate를 8개의 튜브가 한줄로 연결되어있는 튜브를 사용하였었는데 실험실에 이제 튜브를 거의 다 써가고 예전 선배님들이 쓰시던 plate가 많이 남아있어서 사용하려고 하는데 의문이 있습니다. 96well pcr plate로 모두 분주후에 sealing film을 붙이는데요. 원래 사용하던 튜브로 할때는 rt-pcr 돌리기전에 centrifuge로 spin down을 시켜주는데 96well plate는 어떻게 spin down을 시켜줘야하나요? 도와주세요ㅜㅜ 
회원작성글 oneday  |  08.09
Q. real-time pcr할때 전기영동을 하지 않는 이유가 궁금합니다.
안녕하세요, real-time pcr을 배우고있는 석사학부생입니다. 이번에 conventional pcr과 real-time pcr의 차이를 찾아보고 있는 도중 real-time pcr 과정에서 Ct값을 확인해서 증폭값을 확인할 수 있는데, 내가 원하는 target template만 증폭됐는지 알기는 전기영동을 하지 않는이상 어렵지 않나요..? 그런데 다른 선배님들은 전기영동을 따로 하지 않으시더라구요.. 아직 배우고있는 과정이라 궁금한게 많습니다. 도움 부탁드립니다.
회원작성글 jleep  |  08.09
Q. viralRNA qPCR RFU값 관해 질문드립니다.
안녕하세요.  실험 중 궁금한 점이 있어 질문올립니다. viralRNA를 qPCR로 검출하는 실험 중 plateau의 RFU값이 낮게 나오는데, 원인을 모르겠습니다.   실험 과정은 1) 백신에서 추출한 viral RNA를 onestep qRT-PCR로 검출시 그래프가 잘 그려졌습니다. 2) 문제는, 실제 바이러스와 백신에서 각각 추출한 viral RNA를 twostep qRT-PCR로 검출 시 바이러스에서 추출한 cDNA의 최종 RFU값이 낮게 그려집니다. 백신에서 추출한 cDNA의 경우 최종 RFU값이 이전처럼 높게 나오구요. ct값은 오히려 바이러스에서 추출한 샘플이 높게 나옵니다. - 2번 실험에서 qPCR은 qiagen의 quantitect onestep mix에서 RT만 빼고 사용했습니다. 혹시 이게 문제가 될 수 있을까요? 의견 부탁드리겠습니다!
회원작성글 harnster  |  08.08
Q. 좋은 primer를 선택하는 방법 첨부파일
안녕하세요. PCR primer를 디자인할때 어떻게 고르면 잘 고를 수 있을지 질문하고 싶어서 글 남깁니다.   제가 primer-blast를 여러 조건을 넣고 돌렸는데, 사진처럼 여러 프라이머가 나옵니다.   원래 여러 프라이머가 나오는건 알지만 문제는 프라이머끼리 겹치는 부분 때문에 어떤 것을 선택하면 좋을지 잘 모르겠다는겁니다...   혹시 기준 같은 것이 있을까요? 알려주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ
회원작성글 미니썬  |  08.08
Q. plasmid pcr 조언 부탁드립니다...ㅠㅠ
안녕하세요. 신입 대학원생이라 조언을 구하고 싶어 글 몇 자 적습니다... 실험실에서 보유하고 있는 plasmid와 vector가 제가 원하는게 맞는지 확인하고 싶은데, (plasmid, vector는 각각 별개로 확인하고 싶은 것) 1. 25 bp 내외의 Forward, Reverse primer 제작 2. plasmid, vector + primer을 이용해 pcr 진행 3. gel에서 내려서 primer가 제대로 특정부위를 증폭했는지 확인   이렇게 해서 plasmid, vector가 제대로 된 것인지 확인하고 싶은데 이렇게 진행해도 되는지 감이 오지 않아 질문드립니다... 선배님들께서 혹시 별도의 과정이 필요한건지, 아예 실험 계획 자체가 잘못되었는지 조언 구합니다. 바쁘신 화중에 제 글을 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 실험알못  |  07.29
Q. qPCR을 진행하였는데 multi peak가 뜹니다...
  안녕하세요. qPCR을 사용하여 실험을 진행하였는데 multi peak가 떠서 조언을 구하고자 질문드립니다... 기존에 제작한 primer 서열을 사용하였습니다.,, 기존 primer와 새로 구매한 primer를 함께 돌렸는데 새로 주문한 primer를 사용한 결과에서 multi peak가 떴습니다... 실험에 박식하신 분들께 조언을 구하고 싶습니다... 감사합니다...     green이 기존 primer.  red가 새 primer입니다..  
회원작성글 백오덩  |  07.28
Q. PCR 시 template concentration 관련..
안녕하세요.. 기본적인 질문이지만 확인하고 싶어 올려봅니다... 사용하는 PCR kit 는 genescript 사의 제품을 사용하고 있습니다. 총 volumn 50 ul 중 2ul가 template라고 프로토콜에 명시되어 있습니다. 여기서 template를 100ng/ul를 2ul 넣게되면 25배로 희석되니 4ng이 들어가는 것이 맞나요? 하지만 논문에서는 최소 10ng 이 25ul에 들어가야 한다고 하니 2.5*2=5배 양을 더 높이고 D.W. 를 줄이는 것이 맞나요? 학과 선배는 논문에서 명시는 안되어있지만 gDNA를 희석 (1/2~1/10으로)하여 2 ul를 넣어야 한다고 하여.. 혼란을 겪게 되어 질문드립니다. 기본적인 질문 드려서 죄송합니다.
회원작성글 RBR  |  07.26
Q. genomic dna 추출 키트로 구강 상피세포의 dna를 추출하면
바이오니아의 genomic dna extraction kit로 구강 상피세포의 human gdna를 추출해서 전기영동으로 그 크기를 확인하는 실험을 해보고 싶은 고등학생입니다.. 그런데 추출 키트로 뽑아낸 dna는 pcr 없이 전기영동으로 그 크기를 확인하기에 턱없이 부족한가요?
회원작성글 luxxuria  |  07.26
Q. real time PCR dye 사용
real time PCR dye 제가 쓰는 CFX96은 JOE가 없어요.. 그래서 찾아보니 HEX와 파장이 비슷하던데 HEX로 읽어도 될까요?  아니면 Cal gold 540도 비슷하던데 괜찮을까요? 어차피 JOE는 IC (Internal control)입니다 sample dye는 있는데 IC dye가 없네요.. 아시는 분 알려주세요ㅠㅠ
회원작성글 송송ㅇ  |  07.26
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