안녕하세요, mouse genotyping을 하려는데 PCR condition에 문제가 있는것인지 band가 이상하게 떠서 여러번 시도끝에 도움을 구하고자 글을 씁니다 ... 증폭되어야 할 서열의 길이는 WT=500bp, MT=163bp 입니다. primer 길이는 20mer 이구요, PCR condition은 다음과 같습니다. (The Jackson laboratory protocol 24678 을 참고하였습니다) 94℃/3min→[ 94℃/15sec→ 65~60℃/15sec (touch down)→ 68 ℃/30sec] x10 cycles → [ 94℃/15sec→ 60℃/15sec→ 72 ℃/30sec] x28 cycles→ 72℃/10min

안녕하세요 사진과 같은 결과가 나온 이유를 뭐라 설명해야할까요 ㅠㅠ 동일한 조건에서 실험했기 때문일까요?? PCR 첫실험이라 모르는게 너무 많네용 ㅠㅠ

PCR 기계에서 온도조절이 위에서 되는 이유가 무엇인가요 ㅠㅠ? 아무리 찾아봐도 안나오네요

안녕하세요. Target gene 보다 좀 더 바깥쪽으로 primer를 design하려고 합니다. 그런데 NCBI에서는 유전자 서열들만 나오고, flanking sequence 검색이 안되네요 ㅠㅠ 혹시 어떻게 찾을 수 있는지 아시는 선배님들 계실까요?

안녕하세요, RT-qPCR 결과가 자꾸 이상하게 나타나서 질문 드립니다.   primer는 계속 사용해오던 것을 사용해서 primer문제가 아닌 듯 하구요.. 이전까지 결과가 이상한 적이 없었는데 최근에 PCR 돌렸을 때 melting curve 자체가 안뜨는 것처럼 나옵니다. 이전과 달라진 점이라면 한 sample로 여러 개의 gene을 봐야하는데 samle이 너무 많아  한 plate에 다 돌릴 수가 없어서 cDNA 1ul (1ug) + ultra pure water mix를  충분히 만들어 놓고 mix+primer+SYBR green 넣고 돌리고, 끝나면 똑같이 만들어 놓은 mix+primer+SYBR green 넣고 돌리고 이렇게 했습니다.. mix는 ice에 계속 박아둔 상태로 사용했는데 첫 번째 plate에서 본 GAPDH는 잘 나왔는데 그 다음 plate에서 부터는 smaple마다 melting curve가 잘 뜨는 sample이랑 안뜨는 sample이랑 섞이기도 하고.. 엉망 친창으로 나옵니다. mix를 한꺼번에 만들어서 사용해서 cDNA가 degradation 되거나 해서 그런걸까요...?ㅜ

저는 iPSC을 이용하여 특정 lineage로 분화시키는 연구를 하고있고 그에 대한 검증으로 각 분화 날짜에 따라 나와야하는 유전자들을 PCR을 통해 보고 있습니다. 따라서 사용하는 sample들은 iPSC(day 0), day 30, day 60으로 이루어져있는데 문제는 iPSC pluripotency marker가 아닌 분화 마커의 증폭이 iPSC에서 이루어 진다는 겁니다. 이론대로라면 분화가 이루어지지 않은 day 0의 iPSC를 사용한 qPCR에서는 GAPDH가 아닌 분화마커의 경우 증폭이 이루어지지 않아서 Ct값이나 melting curve의 피크가 보이지 않아야 하는것이 아닌지요 아니면 아무리 분화 마커라해도 PCR을 통해 40 cycle을 증폭시키면 티끌이라도 잡혀서 발현되는것 처럼 보이는 건가요?? 이럴경우 데이터 해석을 어떻게 해야하는지 조언도 부탁드립니다. 임의로 iPSC에서의 분화 마커의 Ct를 0으로 조절할수도 없는데...ㅜㅜ

안녕하세요 진단분야를 공부하는 대학원생입니다. real time-PCR 실험 진행 후 결과를 확인할때 RFU 값을 확인하는데요, Cycle 마다 상대적 형광 강도를 측정하는 것으로 알고 있습니다. 첫 Cycle 시 Control 조건에서는 형광이 발현되지 않아서 지속적으로 0에서 증가나 감소하는 변화폭이 나타나지 않는데, 다른 조건(형광 발현이 되는 조건)에서는 음수부터 쭉 올라가는 현상이 나타납니다. 상대적 형광을 측정하는 것이라면, 음수가 아닌 0 부터 쭉 올라가야하는게 아닌지에 대하여 궁금해서 질문드립니다.   감사합니다. :)

RFP protein의 일부를 잘라내 subcloning하는 실험을 하고 있습니다.   Sal1, kpn1 제한효소 사용하여 forward primer, reverse primer를 디자인 해야 하는데 제가 맞게 했는지 잘 모르겠어서 질문 올립니다.   Forward primer(랜덤서열(5bp) + Sal1 제한효소 + DNA 서열(15bp)) 5' - GGTATGTCGACATGGCCTCCTCCGAG - 3'   Reverse primer(랜덤서열(5bp) + kpn1 제한효소 + DNA 서열(15bp)) 5' - TAAGAGGTACCGGCGCCGGTGGAGTG - 3'

안녕하세요. qPCR을 하기위해서 primer를 제작을 했습니다. target gene은 vector에 있는 GUS유전자를 target으로 primer를 제작했습니다. target size는 219bp입니다.   실험 내용은 vector를 식물체에 형질전환을 했고, 형질전환 된 식물체에서의 GUS를 정량하는 것이 목표입니다. 정량 이전에 첫번째 밴드는 gDNA에서 qPCR용 primer로 증폭을 한 것입니다. mutant를 target으로 한 primer이기에 gDNA에서는 증폭이 되면 안되는데 자꾸만 밴드가 뜹니다 ㅠ Tm값은 61도이고, AT는 56도로 PCR을 진행했습니다. 혹시 AT값이 낮아서 non-specific한 밴드가 나오는건가  싶어서 PCR 진행시 55~60도로 gredient를 주어도 모든 AT온도에서 밴드가 나옵니다 ㅠㅠ 두번째 밴드는 공벡터 즉, GUS를 가지고 있는 벡터(형질전환에 사용된 벡터)에 증폭을 시킨 것인데, 사이즈는 맞는 것 같습니다. 그런데 10kb 이상으로 밴드가 희미하게 더 뜹니다.  사이즈가 커서 벡터가 나온건가 싶습니다.. (벡터농도가 27ng/ul였는데 급해서 희석을 안하고 1ul따서 PCR을 진행했는데 그것 때문일까요 ?) 도움을 주십시오 ㅜㅜㅜ

1. Pure culture 상태인 세균을 DW 100ql가 있는 Epp tube에 미량 넣는다   2. 세포파쇄장치에서 3분간 sonication한다.   3. 100도 water bath에 넣고 10분간 boiling 한다   4. 14000rpm, 4도에서 5분간 centrifuge 한다   DNA 추출 과정에서 2~4번 과정이 왜 필요한지, 정확한 과학적 근거가 궁금합니다

연구주제가 바이러스를 검출하는 primer set를 개발하는 것 입니다. 제 연구주제의 특이점은 primer set이고 따라서 이미 다른 논문에서 개발한 primer set인지 아닌지 확인하는 것이 제일 중요한 요점입니다. 지금 현재 sequence를 구글, 구글스칼라, 펍메드, 구글패턴트에 입력해서 확인하고 있습니다. 그런데 이렇게 하여도 완전히 정확하게 이미 개발된 primer를 다 찾는 건 아니라는 얘기를 들었습니다. 따라서 어떻게 하면 정확하고 확실하게 나와 있는 primer인지 아닌지를 알고 싶습니다. 부디 아시는 분은 알려주시면 정말 감사하겠습니다.

forward가 100um = 244ul 이고 reverse가 100um = 315ul 일때 forward, reverse primer가 둘다 각각 10pmol인 상태로 첨가된 용액을 만들고 싶은데 각각 몇 ul 넣고 D.W 는 몇 ul 를 넣어야 되는지 알고 싶습니다.

PCR 처음해보는데요. 논문에 25ul 볼륨에 primer 0.2 uM 넣으라고 하는데 primer 100pmol (합성하면) 짜리에서 2ul따서 + TE98 =100ul 만들고  이 100ul 스탁에서 1ul 을 따서 넣으면 0.2uM 이 되는게 맞는건가요 ?   100pmole/ul  x  X = 0.2pmole/ul x 25ul 0.05ul 넣는거인데  위에서 넣는 희석법으로 이렇게 도출되는게 이해가 잘안되서요..   기초적인 질문이라 죄송합니다. 상세하게 설명해주실분 ㅠㅠ

샘플에 페놀이 조금 섞여 들어간 상태에서 PCR을 돌리면 밴드가 아예 나오지 않나요? 페놀이 들어간건지 아닌지 알 수 있는 방법이 있을까요...

안녕하세요. qRT-PCR을 준비하고 있는 대학원생입니다. Thermo fisher 사의 OligoPerfect을 이용하여 관찰하고자 하는 gene의 primer를 디자인하고 있습니다. NCBI의 Blast를 통해 primer가 제대로 디자인 되었는지 확인작업을 하는 중인데, 간혹 보고자 하는 gene의 이름이 아닌, 염색체 자체가 뜨는 경우가 종종 발생합니다. 예를 들어, F11R이라는 gene symbol의 유전자를 관찰하려는 경우, NCBI Blast를 돌렸을 때, Huxu chromosome 25 이런식으로 뜨는 경우가 있습니다. OligoPerfect 말고 다른 프로그램을 이용하여 primer를 디자인해야되는건지 싶기도 하네요.. 이럴 때, 염색체가 아닌 제가 보고자 하는 gene만 확인하고자 하는 경우, 어떻게 하는 것이 좋을지 고견 부탁드리겠습니다.. 읽어주셔서 감사합니다.

안녕하세요  프라이머 짜고 있는데 Primer Blast 돌릴 때 Primer Pair Specificity Checking Parameters에서 Database를 선택할때 custom으로 하고 제가 선택한 PCR Template의 어세션 넘버를 넣어도 될까요 ?   EGFR 프라이머 짜고 있는데 결과값이 맘에 드는게 없어서 Database 선택할때 커스텀으로 하니 결과가 잘나와서요