안녕하세요, 현재 cell line 제작 중에 있습니다. virus를 이용해 transduction 시키려고 하는데요, 저희 교수님은 transfection을 이용해 integration 시키지 왜 virus를 만드냐는 말씀을 자주 하셔서요. 1. transfection을 통해서도 integration이 되는지 2. 된다면 virus을 이용할 때와의 차이점은 효율 뿐인지 3. 효율 차이가 많은지 에 대해 질문 올립니다.

 comp cell은 DH5a를 사용중이고,  vector는 lentiV2를 이용중입니다 제가  primer 20bp크기를 insert하려는데 콜로니가 안떠서 고수님들께 자문구합니다.   DH5a는 RBC에서 구매해서 사용중이라 문제는 없는것같습니다. BsmB1으로 자르고 gel extraction 후 밴드 잘린거 확인했습니다.   comp cell 20ul에 plasmid 1.7ul넣고 transformation은 ice 20 min 42도에서 heat 45 sec ice 20 min 뒤에, S.O.C 50ul 넣고 37도  shake incubator에 1시간 배양 후  lb+amp plate에 모두 spread합니다   콜로니가 아예뜨지 않는데 어떤 단계를 확인하거나 바꿔야 할까요 vector도 바꿔보고 glass beads로  non-heat 으로도 해보고, ligation 단계에서 ATP도 넣어봤는데 콜로니가 안뜨네요ㅠㅠ  도움 부탁드립니다.ㅠ  

고등학생입니다. 신장성 요붕증의 원인인 AVPR2 유전자의 점돌연변이를 잘라내는 모의 실험을 계획했는데요.  10-23 DNAzyme을 이용해 제거하고 AVPR2 유전자의 점돌연변이 부분을 제거하여 제거가 잘 되었는지 확인하는 실험입니다. AVPR2 유전자 돌연변이로 280번째 아미노산이 치환되어 신장성 요붕증이 발생한 것이므로 ncbi에 들어가 정상인의 280번째 아미노산을 확인한 정상인과 신장성 요붕증 환자의 염기서열을 비교해 돌연변이 위치를 파악합니다. 그 후 이 돌연변이만의 10-23 DNAzyme를 설정하고 제대로 절단됐는지 확인하고자 AVPR2 유전자의 점돌연변이 mRNA 절단 여부를 판단합니다. 잘라낸 부분의 mRNA를 증폭시키기 위한 primer를 설정하고 전기영동의 각 Lane에 대조군인 AVPR2 유전자의 돌연변이 mRNA, AVPR2 유전자의 돌연변이로 인한 신장성 요붕증 환자의 DNA, 증류수를 넣는다고 가정했습니다. 실험군으로는 직접 설정한 DNAzyme을 이용해 돌연변이를 제거한 환자의 mRNA를 넣고 프라이머 등을 넣는다고 가정했으며 RT-PCR 후 전기영동을 통해 증폭 여부를 판단하여 가설의 성립 여부 확인으로 모의 실험이 종료됩니다. 이 모의 실험에서의 오류가 있을까요??

안녕하세요, 특정 gene을 과 발현 시키는 stable cell line 제작 중입니다. 저는 보통 viral vector를 이용해 virus를 만들어 infection 시켜주는 방식으로 실험을 진행하는데요, 교수님께서 항상 왜 그냥 transfection해서 integration 된 cell을 골라내지 않냐고 말씀하셔서요. 지나가는 소리로 선배들에게 transfection을 하면 infection보다 효율이 안좋다 란 얘긴 들었고, transfection reagent는 핵막을 뚫지 못해서 division 되는 cell에만 들어가고 virus는 (lenti 사용) 핵막을 뚫는다, 정도만 알고 있는데 정확한 효율 차이 등을 아시는 분이 있으신가요? 답변 부탁드립니다 :-)

사람세포에 transfection을 하려고 합니다. 실험설계 상, plasmid를 먼저 넣고 그리고 siRNA로 KD를 해야하는데 siRNA는 48~72시간이 최적이라고 알고 있습니다. plasmid를 넣고 나서 효율이 몇 시간 정도 가나요? 아마 plasmid를 우선 넣고 24시간 뒤에 siRNA를 넣어 72시간 후에 cell harvest할 것 같습니다.

transformation 후 colony 확인하여 mini-prep 후  gel 전기영동 100v 30분 돌린 결과입니다. 위쪽은 DNA인게 확인되었는데 (크기 비교 결과 맞음) 아래쪽이 대체 무엇인지 모르겠습니다. ㅠㅠ - 1.2% LE agarose gel 사용했고, DNA 4ul+D.W 6ul+6X loading dye 2ul 총     12ul loading 하였습니다. - mini prep 결과 퀄리티는 오염없이 잘 나왔습니다. 제발 알려주세요 ㅠㅠ

electrocompetent com cell 을 제작 중에 있습니다. 원래는 하루면 OD값이 원하는 정도까지 도달해야 하는데 절반이 안되게 자라는 상황입니다. method는 protocol대로 잘 지켰습니다. 원래는 좀 더 최적화를 하여 com cell을 만들어야 하지만 현재는 여건이 되지 않아서 혹시 배양 시간을 지켜서 그냥 만드는 것과 원하는 OD값까지 키우는 것 중 어떤 게 더 중요하다고 생각하시나요?? 제가 너무 기초가 부족하네요 ㅜㅜ 읽어주셔서 감사합니다.

3.3kb와 3kb짜리 유전자를 pCR4-TOPO vector에 TA cloning kit를 사용해서 진행하고 있습니다. pcr product (농도는 약 300ng/ul)를 4ul + vector 1ul + salt 1ul  해서 30분, 4시간, 12시간, 16시간 이런식으로 다 해봤는데 콜로니가 아예 뜨지 않거나 엄청 많이 떴었습니다. 엄청 많이 뜬 경우에 blue colony가 아예 없을떄도 있었습니다 (이게 가능한가요) 콜로니가 너무 많아서 새로 긁어서 white colony를 m13 primer로 colony pcr했더니, 원래 나와야하는 곳은 적어도 3kb이상인데, 2kb에서 밴드가 많이 뜨는것을 확인했습니다.   pcr product extraction시 문제가 생겼나 해서 pcr product extraction한 것을 전기영동해봤더니 원래대로 3.3, 3kb에 뜨는것을 봤습니다. vector와 mixture를 만들때 문제가 생기는 것 같은데... 어떤 문제가 있을수 있나요? 도와주세요 ㅠㅠㅠ

E.coli JM109로 원하는 plasmid DNA를 넣어서 LB agar에 어제 넣어서 24시간동안 incubation 했는데요. 제가 아는 colony와 함께 곰팡이가 폈습니다ㅠㅠ 이런 경우에는 colony 사용하면 안 되고 다시 시작해야 하는거죠? 곰팡이는 포자가 있으니까요....   LB agar plate를 22년 03월 28일에 만들어진 것을 사용했는데 그게 문제였을까요? Ampicillin 최종 농도는 참고로 100 ug/mL입니다. 항생제가 있어도 곰팡이가 자랐네요. 아니면... 현재 clean bench가 없어서 실험대 위에서 알코올램프 키면서 실험을 하고 있는데요. 그 과정에서 오염이 된 것 일 수도 있겠고요. 그것도 아니면....heating block 온도가 42도가 아닌 51도에서 1분 동안 heat shock해서 그런 것인지...ㅠㅠ   plate 가장자리 부분에 있는 colony는 picking 할 수 있는 사이즈인데...곰팡이가 폈네요ㅠㅠㅠ 휴우....ㅠㅠ

안녕하세요. vector transformation 중에 문제 있어서 이렇게 질문을 남깁니다....   addgene에서 pMo130 vector를 주문해서 E.coli XL1-BLUE에 tansformation을 시도했는데....colony가 하나도 안 나왔습니다....... 그 이후에 vector의 양을 늘려서 한 번더 시도해봤는데...안 되네요.... 이 vector는 XL1-BLUE에 transformation하면 안 되는 vector인가요?? transformation할 때는 항생제로 kanamycine LB plate를 사용했습니다. 이게 잘못된 것은 아니죠??....... 사이트에 들어가면 JM109에 하라고 적혀있기는 한데....저희가 지금 그 균주를 구매할 수 있는 상황이 아니라서요.... E.coli XL1-BLUE 말고는 E.coli DH5a 만 있는 상태입니다... E.coli DH5a에 시도해보면 나올까요??.... cloning 고수님들 답변 부탁드려요....  

안녕하세요. 찾아보니 알거 같으면서도 헷갈려서 이런 기본적인 질문을 드리게 되었습니다. 제가 사용하는 벡터는 pet28a이고 kan 저항성을 가지고 있습니다. 그리고 사용하려는 host는 bl21(rosetta)이고 cm 저항성을 가지고 있습니다. 배양시 kan과 cm 둘 다 넣어서 배양을 하라고 하는데 pet28a는 kan 저항성밖에 가지고 있지 않은데 kan, cm 둘 다 넣는 배지에서 배양을 하면 각각은 다 죽는거 아닌가요..? 항생제 하나 넣어서 선별하는건 이해가 되는데 double selection은 이해가 잘 안 되네요 ㅠㅠ 쉬운 질문이지만 답변 부탁드리겠습니다. 항상 감사드립니다.

안녕하세요. 고등학교에서 생물을 전혀 안한 생공 학부생입니다. 이번에 한 실험에서, 도무지 이해가 안가는 부분이 있어 질문드립니다.ㅜㅜ  제가 이번에 JM109주의 대장균에 pUC19플라스미드랑, pUC19플라스미드의 MCS에 EGFP발현유전자를 삽입한 플라스미드pEGFP를 넣어 형질전환하여 암피실린배지에 배양하고, PCR이나 SDS-PAGE를 하는 실험을 했습니다. 여기서 제가 궁금한 부분은 blue-white screen에서인데요. 위에서 말한 두 균을 LBA배지, LBAI, LBAX, LBAXI 배지에다가 배양했습니다. (A:암피실린, I:IPTG, X:X-gal) 그랬더니 결과는 pU19는 전부 흰색, pEGFP는 전부 녹색으로 나왔습니다. 저는 이 결과가 맞다고 생각했는데 교수님 말씀으로는 LBAXI 배지에서는 원래 파란색이 나와야 맞다고 하셨고, 저는 여기서 이해가 멈춰버렸습니다..ㅜㅜ αcomplementation 공부할 때, F'lacZ M15에서  ω단편이 발현되고, 여기에 lacZα를 도입해서 발현시키면 두개의 단편이 만나서 베타 갈락토시데이스활성을 회복하고,  여기서 lacZα의 가운데에 MCS부위에 외부 유전자가 들어오면 α단편이 중간에 끊기니까 두 단편이 만나도 활성을 회복하지 못한다고 이해했는데요. 이 실험에서도 MCS에 GFP발현유전자를 삽입했으니까 활성을 회복하지 못하고 흰색이 되어야하는거 아닌가? 생각했습니다. 근데 실험 지도서를 다시 들여다보니, pUC19의 lacZα가운데에 MCS가 있는 반면에 pEGFP에서는 lacZα의 옆에 EGFP가 붙어있더라구요. lacZα가 끊기지 않았으니 파란색으로 나오는 건 알겠지만(근데 그럼 왜 결과는 흰색이 나왔는지도 잘 모르겠네요..), 그렇다면 "pUC19플라스미드의 MCS에 EGFP발현유전자를 삽입"했다는건 대체 어디에 삽입을 했다는건지 이해가 안되었습니다..  lacZα의 옆에 MCS가 있다는 건가요?? 제가 아직 그림을 해석할 줄 몰라서 GFP를 어디에 삽입했고, 왜  lacZα가 말짱한지가 이해가 안되네요ㅜㅜ 혹시 설명해주신다면 정말정말 감사하겠습니다..

OD를 측정해서 competent cell을 만들어야 되는데 아직 OD가 적정값에 들어왔는지 확인을 못했는데요. 앞사람의 실험ㅇ나 제가 갑자기 일이 생겨서 doubling time마다 측정을 못할때 우선 4도씨에 넣어놓고 OD값을 측정해본뒤, 아직 도달하지 않았으면 다시 배양기에 넣어놔도 될까요? 4도씨에 들어갔다 다시 배양기로 들어가면 cell한테 충격을 주는거 같아서요. 혹은 RT에 그냥 놓아도 되는건지…?

transformation 후 colony가 뜬 plate를 3주동안 4도씨에서 보관중 입니다. colony를 pick해서 mini prep하여 안에 있는 vecor 를 cut해서 linear로 만들어 전기영동을 찍어볼수 있을까요? 실험을 배우고 있는데 vector를 cut하고 paste하는 방법을 배우고 싶어서요 너무 오래된거 같아서 진행해도 되나 싶습니다…

시간이 없어서 streaking 해서 colony를 따서 접종 하는 방법 말고 그냥 균주가 들어있는 stock에서 화염멸균한 이쑤시개나 tip을 담갔다 pick하는 방법 처럼 하여 접종 하는 방법은 안되는 걸까요?

DH5a, Top10, SURE, XL1 blue 뱔로 특징을 알수있을까요? top10이 XL1 blue보다 cel growth가 빠르다 , vector가 더 작다 와 같은 특징들이요

yeast 에 들어가는 vector가 얼마 남지 않아 mini prep을 통해 늘려야 된다고 배웠습니다 허나 yeast는 E.coli를 걸쳐서 transformation을 해야된다는걸로 알고있습니다. yeast에 들어가는 vector를 E.coli에 transformation 할수 없는데 어떻게 그 vector를 늘릴수있나요?

안녕하세요 이제 막 배우기 시작한 학부생입니다.   PUC19 plasmid를 가지고 mini prep을 진행하였고 plasmid DNA를 얻는것 까지 진행했습니다. yeast에 transformation을 해야되는데 yeast transformation에 들어가는 vector는 분명 다른것인데 mini prep을 통해 얻은 plasmid DNA는 어떻게 활용하는것인지 질문드려도 될까요?  

yeast T/F 시에 넣는 vector가 얼마 남지않아서 E.coli com. cell 제작후 mini prep을 통해 얻어내라고 말씀을 해주셨습니다. yeast에 들어가는 vector E.coli에 들어가는 plasmid가 다른것인데 어떻게 vecotr를 늘릴수 있다라는것인지 알수있을까요?

yeast transformation을 할려고 E.coli transformation을 하고있습니다. yeast에 들어가는 vector에 amp 항생제가 들어가는데요 그러면 E.coli에 amp marker가 들어가는 plasmid를 아무거나 넣어도 상관이 없을까요?