안녕하세요 현재 대학원 석사 1년차입니다. 원래 게속해서 진행해온 cloning과 transformation이 8월달 부터 인가 뭔가 점점 이상해졌습니다. 저희가 기존에 만든 C-cell을 이용해서 계속해서 transformation을 진행했는데요, 8월달 부터 transformation을 한 이후에 mini-prep을 진행해온 결과 원래는 300-400ng으로 잘 나왔었는데 어느순간 갑자기 50ng으로 확 효율이 떨어졌습니다.(mini prep kit 사용했습니다.) 너무 이상해서 여러번 transformation도 해보고 배지도 다 바꾸고 새로 다 만들어서 했는데도 이상해서 C-cell이 문제겠거니 해서 다른 랩에서 얻어온 C-cell을 이용해서 transformation을 해본 결과 비슷하게 나왔습니다. 그래서 C-cell을 사서 새로 transformation을 했는데 다행히 colony가 잘 떠서 liquid culture을 진행했는데요, 아니나 다를까 또 mini-prep을 진행한 결과 50ng밖에 안나왔습니다...ㅠ 심지어 안자란것도 있습니다..ㅜ antibiotic marker는 ampicilin을 이용하였구요.. 새로 산 DNA가지고도 transformation을 했는데 하나도 자라질 않았네요.. 일단 저희 학교 내 실험실에서 해볼 수 있는 모든 경우의수를 다 해보았는데 도저히 돌파구가 보이지 않네요... 혹시 저와 같은 비슷한 경험을 해보신 분이나 problem solving하신 분들 있으신가요??ㅠㅠ 

대장균을 형질전환시킬 때 고농도의 2가 양이온 (Ca2+)를 사용하는데, 효모의 형질전환에서는 대부분 리튬 아세테이트를 쓰는 이유가 있나요?   리튬은 1가 양이온인테 어떤 차이점이 있나요?

전기천공법으로  plasmid를 transformation하고 다음 날 확인했는데, 크고 하얀 콜로니 주변으로 자잘한 콜로니들이 에워싸듯이 몰려있거나 아예 하얀 콜로니들을 뒤덮고 있었습니다. 지금 저 이상한(?) 콜로니들을 새로 만든 amp 배지에 streaking 하면 순수한 transformant만 얻을 수 있을까요? 아니면 다시 transformation부터 다시 진행해야 할까요? *배지는 알아보니 만든지 좀 되었더군요... 일단 저도 앞으로 쓸 일이 있을거 같긴 해서 새로 만들었습니다.    

Transformation 할 때 bead로 굴려서 spreading 하는데 이때 노하우가 있을까요? colony가 자꾸 잘 안떠서... shaking하다가 cell들이 많이 죽을 수 있는지, 어느정도 해야될지 감이 잘 안잡혀서 도움 요청합니다..

Theta replication에 대한 기본적인 개념 혹시 설명해주실 수 있을까요? 논문을 찾아봐도 정확하게 나오지않는데.. rolling circle mechanism보다 좀더 stable하다 정도...

안녕하세요. Bacterial transformation 실험에 주력하고 있는 학부생연구원입니다. Transformation efficiency를 다른 논문에서 참고해서 계산을 하려고 하다보니, 대부분의 논문이 CFU/ug를 단위로 쓰더라고요. 이 단위의 뜻이 주어진 양의 competent cell에 DNA 1ug을 transformation 했을 때 생성되는 colony의 수라고 하는데, 다른 분의 의견으로는 Transformation efficiency면 사용된 competent cell의 전체 수에서 transformation된 세포의 수를 말하는 것이니까 transformation 후 spreading할 때 한 샘플을 selective plate와 항생제 없는 배지에 따로 키워서 항생제가 있는 배지에서 자란 콜로니 수를 항생제 없는 배지에서 자란 콜로니 수로 나눠야하는 것 아니냐는데, 그 말도 맞는 것 같아서요. 사실 transformatinon efficiency 정의를 봤을 때 잘 이해가 안되기도 하고요. 혹시 이것과 관련해서 이 공식이 어떻게 transformation efficiency를 설명하는 것인지.. 왜 CFU/ug을 unit으로 쓰는지 알려주실 분 계실까요?ㅜㅜ

DH5a comp.cell에 transformation을 진행하다가 실수로 42도씨 heat shock 이전에 LB media를 먼저 1ml 넣어버렸습니다. 프로토콜상으로는 Heat shock 이후에 LB media를 넣고 recovery time을 줘야하는데 순서를 ㅂㅏ꿔 진행해버렸는데, Transformation efficiency에 크게 영향을 미치나요..?ㅠㅠ  

Lac operator가 basal level이 높고 leaky하고 leaky한 basal이 있어야 lac이 작동한다고 설명하시는데 무슨 소리인지 모르겠네여. IPTG, ptac으로 충분히 translation이 가능한데 T7을 이용하는 이유는 basal 생성이 줄어들며 leaky해져서 잘 안 자라거나 죽어서, 원할 때만 induce하게끔 하기 위해서이고 basal level에서 inoculation하는게 어떻고 T7 사용할 때 basal level이 거의 안 만들어지고 pLysS T7 leak을 없애면 copy 수가 줄어든다는데 뭔지 모르겠네요 ㅠ

안녕하세요 이제 막 실험수업 듣는 학부생입니다!   transformation 이후 Amp+plate에 배양하여 다음날 colony가 뜨는지 확인하러 갔는데 하나도 없었습니다. 물론 저는 transformation과정에서 생긴 문제라고 인지는 하고 있어요. (ex. CaCl2를 pellet에 녹일 때 pipetting을 너무 쎄게 했다던가, 스프레딩을 쎄게 했던가 등등..)   그런데 transformation을 하기 전에 insertDNA와 plasmid DNA를 ligation을 했는데 혹시나 이 과정도 transformation을 하는데 영향을 줄 수 있는지 궁금해서 질문 드립니다.   1:1 1:3 insert(약280bp) 약26ng/ul     vector(약4200bp) 약30ng/ul 2ul 2ul SDW     T4 DNA ligase 1ul 1ul 10X ligation buffer 2ul 2ul Total 20ul 20ul 실험할 당시 ligation 관련 protocol입니다. total volume과 10x ligation buffer, T4 DNA ligase의 volume은 고정해 두었고, vector는 농도 50ng/ul을 맞춰주기 위해 2ul로 진행하였습니다. (인서트와 벡터의 분자량과 농도는 대략적인 수치로만 나타냈습니다) 조교님은 인서트와 벡터의 ng의 비율만큼 넣는 방법을 알려주셨는데, 인서트와 벡터의 볼륨비로 해도 상관은 없기 때문에 볼륨비로 진행한다고 하셨고, 저희는 그대로 insertDNA를 각각 2ul, 6ul만큼 넣어주었습니다.   여기서 궁금한 점은..  10X ligation buffer의 볼륨을 2ul로 고정하는 이유가 무엇인가요? 1) 벡터와 인서트의 ng비로 1:1을 맞추면 인서트는 0.15ul정도만 넣어도 되는데 2) 벡터와 인서트의 볼륨비로 1:1을 맞추면 인서트는 2ul을 넣어야 하잖아요? 물론 ligation 반응하는데 있어서 인서트가 많을수록 반응은 잘 일어나겠지만 1번과 2번의 볼륨 차이는 약 13배나 차이가 난다는 건데, 반응하는 물질의 양에 따라서 buffer나 salt농도는 다르게 해줘야 하지 않나요? 볼륨비로 하던, ng비로 하던 1:1을 하던, 1:3으로 맞추던 간에 10X ligation buffer의 양은 달라야 한다고 생각하거든요. 따라서 ligation할 때 buffer 등의 salt농도를 제대로 맞춰주지 못해서 생긴 문제로 transformation할 때에도 영향이 어느정도 있을거라고 생각하는데..   물론 조교님이 알려주신 프로토콜에 문제가 있을거라고는 생각은 안하지만 제가 전공지식이 너무 부족하고 실험도 처음이라 이해가 안가는 부분이 너무 많네요 ㅠㅠ 도와주세요..

integration된 균주는 colony pcr을 통해 integration의 유무를 확인할수있는데 plasmid를 transformation 진행한 colony는 잘 되었는지 확인을 할수있는 방법이 있을까요?

하나의 생성물을 발견하기 위해서 integration을 균주에 시키는것과 plasmid를 transformation시키는것 의 차이가 어떤건지 알수있을까요?

transformation 후 plate에 spreading 하기전 dilution을 진행후 spreading을 진행하고자 하는데요 보통 serial dilution 을 dw로 진행하시나요 ddw로 진행하시나요?

안녕하세요 학부 실험과제를 작성하다 궁금한 점이 생겨 질문 드립니다. bacteria transformation 결과 확인을 위해 pcr이후 전기영동을 했을때 positive control과 negative control을 사용하여 비교한다고 알고 있는데요. 이때 positive control에는 제작한 재조합 plasmid를 사용해 이것과 일치하는 지를 비교하는 것이고 negative control은 잘못된 예시로 판별한다고 하는데 이때 궁금한 것이 그냥 positive control만 사용해도 transformation이 잘 되었는지 알 수 있는 것 아닌가요? 왜 negative control를 사용해야하는지 잘 이해가 안갑니다. 또한 왜 negative control를 거의 증류수로 사용하는지 궁금합니다.

안녕하세요.   과제로 transformation에 관한 발표 주제를 받았는데요.   37도에서 키운 e.coli와 18도에서 키운  e.coli의 transformation efficiency를 비교했을 때 18도에서 키운 e.coli의 transformation efficiency가 더 높다고 합니다.   그래서 자료조사를 해봤는데 명확한 이유를 찾기가 힘들더라구요..   혹시 아시는분 있을까요?

transformation 후 dilution 하여 plate에 spreading을 진행할때 얼마나 dilution을 해야되는지 모르겠어서 질문드립니다. 보통 농도 몇짜리를 몇으로 희석해서 plate에 분주하시나요? 다른분들이 하는 예시를 알아야 제가 계산할수 있을거 같아 질문드립니다

Transformation 실험을 하는데, DNA plasmid 500ng/10ul 이 있는데,  Complete cell에는 DNA plasmid를 1pg-100ng 첨가 하라고 되어 있는데,  10pg를 첨가할려면 농도를 어떻게 희석 해야 할까요? ㅠ   또, DNA plasmid가 TE bfr에 담겨 있다는데, 희석은 DW로 해도 될까요? 

안녕하세요 E.coli competent cell 제작 과정중 glycerol로 washing 과정을 거친후 GYT를 분주하는걸로 protocol이 알려져있는데 GYT를 넣어주는 이유를 알수있을까요?

amp가 E.coli에서 colony selection을 하기위해 항생제를 넣어주는걸로 알고있는데요. yeast로 ransformation 과정을 진행중입니다 yeast 에서의 Amp plate도 같은 원리로 사용하는건가요..? E.coli에서만 amp plate를 꺼보고 YPD amp plate는 써본적이 없어서 질문드립니다.

sequencing 맡기려고 plasmid 추출부터 다시하려고 항생제 배지를 만들어 배양하는 과정입니다. 1) 균주중 한개는LBA-k에서 키워서 냉장고에 놔두었던 상태로 같은 LBA-k에 계대배양해 키우려고 했는데 자라지 않습니다. 계속 잘 자라오던 것이 자라지 않으니 균이 죽었다고 해야하는건지...

vector를 균주에 transformation 시켜놓은 상태인데요. vector가 잘들어갔는지 확인하기 위해서 colony PCR, gDNA extraction 하여 confirm PCR을 진행하려고 합니다. 또한 master plate에 screening 시켜서 확인도 해야된다고 배운거 같은데요 이론은 알겠는데 transformation 시킨뒤 다음부터 어떻게 진행을 해야되는건지 잘 알지 몰라서 질문드립니다. transformation 시킨 colony를 pick하여 seed 후 competent cell을 제작한 후 해야 되는건지.... 다음 순서를 알고 싶어 질문드립니다.