bacteria DNA work를 하고 있습니다   Restriction 후 concentration이 낮아 vacuum centrifuge로 농축시키는데    농축전 gel에서는 밴드가 연하게보이고, 농축후에는 밴드가 보이지않는데   제가질문드리고 싶은것은   1. 이것은 centrifuge에 무슨문제가있는걸까요? 2. Restriction 후 concentration을 높일수 있는 방법은 무엇일까요?   입니다   답변부탁드리겠습니다   감사합니다

pET21b를 실험실에서 사용하고 있는데요  pET21b를 DH5a에 transformation해서 mini prep을 하면 yield가 높게 나오는데 scale을 키워서 culture한 뒤 midi prep을 하면 아이에 없다 시피 농도가 나옵니다.  다른 사람이 해도 그래서 전 연구자 실험 노트를 봐도 midi prep을 진행해본 사람이 없더라구요    답답해서 질문 남깁니다.  pET21b vector는 원래 이런건지 알고 싶습니다. 다른분도 이러신가해서요 ..ㅜㅜ 

안녕하세요. 현재 zebrafish를 double knockout 해서 만들어져있고,  이때 RNA-seq결과로 나온 특정 유전자들에 대해서 cloming을 하려고 합니다.   그런데 이때 cloning을 하려면 cDNA를 어떤 것으로 사용해야 될까요?   두 유전자가 a, b라고 한다면 wild type   ,    a-/-    ,    b-/-    ,     a+/-,b+/-     ,    a-/-,b-/-  cDNA 나 knockout 한 model에 대해서 개념이 헷갈려서  어떤 것의 cDNA를 사용하여 target gene을 뽑아야 되는지 모르겠습니다 도움 부탁드립니다!

1번 3번 5번이 각가 다른 Vector이고 Ligation 시킨 sample이고 2번 4번 6번이 각각 그 Vector를 digestion 시킨 상태의 Vector를 컨트롤로 걸어둔것입니다. 여기서 든 의문이 Control로 잘린 Linear한 Vector DNA를 넣어줬는데 왜 Band가 Ligase 처리한 Vector DNA[Circular form]보다 더 아래에 있는가 궁금해서요.. 혹시  1.Vector DNA + Insert DNA[159bp]의 Size가 당연히 더 크기 때문? 2.Restriction 처리가 한쪽만 일어나서 한쪽 부분의 Vector와 Insert만 붙어서 Ligation이 실패한것 인건가요?

안녕하세요. vector를 BamHI, XhoI으로 double digestion하고 있습니다. (vector에 다른 Bam, xho site는 없습니다.) 그런데 RE처리 할 때 Bam,Xho로 한번에 처리하니 extra band가 생기고, 이상해서 1. Bam 2. purify (pcr purification , D.W 40 Elu)  3. Xho  이 순서로 digestion 했습니다. 이때 2번과정 이후 EP를 내려보니 3개의 band가 형성되었는데, 3번 Xho 효소를 처리한 후, 다시 EP를 내려보니 하나의 band만 남은 것으로 확인되었습니다.   결과는 이렇게 나왔습니다.   1. BamHI이  star activity가 있다고 알고 있는데 그래서 enzyme을 너무 과량으로 넣어서 그런건가요?   2. Bam -> purify -> xho 까지 하고 나니 band가 다시 정상적인 size의 band로 나왔는데 이것도 왜그런 것인지 모르겠습니다. 3. 이 sample들 모두 버리고 다시 xho, Bam순서로 진행해야 할까요?

석사를 앞두고 인턴을 하고 있는 학부생입니다.. 다름이 아니라 gene cloning이 계속해서 실패하고있는 과정에서 어디서부터 잘못되었는지 trouble shooting을 해야할 것 같아서 Vector prep부터 다시 시작해 Restriction enzyme을 처리 해 준 후 (EcoRI, XhoI 처리) Uncut Vector와 같이 전기영동을 걸어 내려줬는데, 사진에서 보이듯 덜 잘려진것 같은 형태로 band가 보여서 이럴 때 gel extraction 과정은 필수인지 아니면 gene clean과정으로도 충분한지 혹시 경험이 많으신 분들이 보시기엔 어떠신지 궁금해서 여쭤봅니다

안녕하세요. 조금씩 실험을 배워보고 있는 학부생입니다. 다름이 아니라 mcherry를 클로닝해 배양하던 중 이상한 일이 발생해 여쭤보고 싶습니다. 연구실에서 설명을 듣기로는, mcherry는 유도체를 넣어 억제자의 역할을 제어해줘야 mcherry 유전자가 형광단백질을 발현하는 것으로 알고 있습니다. 그런데 피젯 벡터에 mcherry 유전자를 cloning 했더니 모든 세균에서 붉은 색 빛이 났습니다. 혹시 다른 유전자가 cloning되었나 생각도 해보았지만, size, 색이 전부 비슷하고 무엇보다 다른 유전자는 보유하고 있지 않아 착오로 잘못 넣을 일은 없는 것 같습니다. 왜 이런 일이 발생했을까요...? 제가 혼자 생각해보기에는 mcherry 유전자를 삽입할때 억제부위는 cutting하여 삽입해 이런 결과가 나온 것 같은데, 이 추측이 맞을까요? 또 dh5는 cloning vector로 알고 있는데 왜 형질이 발현되었을까요? 

안녕하세요. cloning 초보 대학원생입니다. 저는 5.6 kb 크기의 vector와 717 bp의 insert dna를 합성중입니다. 브릭 검색을 통해 혼자 trouble shooting을 해왔습니다. 하지만 도저히 궁금증 해결이 안되서 여기에 남깁니다 ㅠ ㅠ! 실험 진행은 아래와 같은 방법으로 하였습니다. 717 bp의 insert를 Taq pol PCR을 통해 증폭을 시킨 뒤 gel cut후 gle elution 과정을 거쳐 insert DNA를 준비했습니다. Vector는 promega의 pTargeT Vector를 사용하여 ligation 합니다.  그 뒤 전기영동을 통해 insert가 크기에 맞는 선명한 밴드가 뜨는지 확인하고 계산 비율을 맞추어 1:3으로 4°C 3시간 ligation 진행했습니다.  ligation 후 DH5a e.coli에 transformation을 진행합니다. com cell 50ul에 DNA 2ul 넣어준 뒤 ice에서 30분 incubation하고 42°C heat shock 30초 진행한 뒤 ice에 2분 incubation 후, LB 배지 950ul 추가하여 37°C 150rpm에 1시간 30분 배양하였습니다. 배지를 도말할때는 0.1M IPTG 4ul + X-gal 40ul 를 LB amp plate에 도말하여 말려준 뒤, 1. negative (vector만 transformation 된 com cell로 진행한 것) 를 가장 먼저 도말 한 뒤,  2. sample (vector+insert dna) 을 도말하고 마지막으로 3. postive (amp 항생제 내성을 가진 dna+com cell) 를 도말하였습니다. 실험 과정 중 도말봉 및 실험도구는 알코올램프를 통해 멸균작업을 반드시 해주었습니다.  이후 37°C 배양기에 O/N 하였고, 다음날 plate를 확인하여보니  모든 plate에서 colony가 한 개도 뜨질 않았습니다. blue colony도 하나도 뜨질 않았습니다. 두 달 전에 같은 vector와 insert로 동일한 실험을 했을 때는 blue colony와 white colony가 잘 떴었는데요, 오늘은 하나도 나타나질 않습니다. 왜 이런 문제가 일어나는걸까요 ㅠㅠ.  고수님들 제발 도와주세요...  

안녕하세요! 단도직입적으로, 검은색 화살표 밴드가 궁금하여 글을 쓰게 되었습니다. lane 1~5: plasmid DNA를 BamHI으로 1 cut (~5000bp, 다른 plasmid DNA들임) lane 1*~5*: 1~5 plasmid DNA를 그냥 건 것   <해석> 보라색 화살표: supercoil form 파란색 화살표: nicked DNA 빨간색 화살표: BamH1 cut plasmid DNA 검은색: ???? (nick DNA는 어차피 BamHI으로 잘리면 없어짐. 무엇보다 파란색 화살표 밴드랑 크기가 다름!!!) 한 가지 가설은, gDNA가 BamHI에 의해 잘려서 생긴거..? 무엇일까요 형님들? 참고) alkaline lysis method prep함. digestion은 검증된 퀄의 enzyme으로 충분히 함 (어차피 supercoil크기의 밴드가 1~5엔 없음)

A라는 cell에서 B라는 gene의 promoter를(대략 -3 kb 까지) 이용하여 pGL3 vector에 넣을 예정입니다. 해당 promoter를 확보하기 위해 제가 생각한 이 과정이 맞는지 여쭤보고 싶습니다.   1. 제가 확보할 promoter의 각 말단에 제한효소를 붙여 primer 제작 2. A cell에서 RNA뽑은 후 -> cDNA 합성 -> PCR(이때 1에서 제작한 프라이머 사용) 3. pGL3 vector에 ligation   이 순서로 3 kb의 promoter assay를 진행하면 될까요?? promega의 manual에는 lucifer vector에 대해서만 주로 나와있는 것 같은데, 그 전 단계인 insert(promoter)확보에 관한 protocol이나 공부할 수 있는 자료가 없는 것 같아서요ㅠㅠ 혹시 자료 있으시거나 해당 과정을 아시는 분은 전반적인 과정에 대해 설명해주실 수 있으신지요,,ㅠㅠ

안녕하세요!  지금 TA cloning 중인데 먼저 plasmid 뽑아서 enzyme cutting을 해봤는데 사이즈에 맞게 밴드가 잘 떠서 sequencing을 보냈습니다. 그런데 결과에 vector만 뜨네요ㅠㅠ  뭐가 잘못됐을까요ㅠㅠ?

Plasmid prep 과정 후 Restriction enzyme처리해서 Insert DNA와 Vector DNA를 확인하던 과정에서 원하는 Insert DNA는 안나오고 이상한 밴드가 나왔는데 이 band의 정체가 뭔가여? 혹시 prep kit가 오염되어서 나오는 결과인가요??

선배가 준 vector가 있는데 vector MCS 어느 위치에 넣었는지 모르겠습니다. insert는 fragment 두개라서 gene 합성을해서 각각 만든 뒤 ligation하였다고 들었습니다. 그런데 insert sequence를 보면 양쪽 말단에 enzyme site가 없습니다. 이런 경우 어떤 방법으로 cloning을 한 것일까요? 업체에 의뢰하여 진행한 것일까요?

Cloning한 insert 중 염기 하나가 mutation일어나서 아미노산이 바꼈습니다.(Glutamic acid -> Glycine) 아미노산의 polarity를 볼 수 있는 프로그램이나 사이트 알고계신분 있으실까요??

안녕하세요. gene cloning을 위해 실험을 하고 있는 학생입니다. 현재 vector, insert 1은 준비가 되었는데, insert 2가 제한효소 처리만 하면 사라져서 여쭤보고 싶습니다. insert 2는 플라스미드를 pcr 한 dna로 insert 1과 size도 비슷합니다. 또한 pcr 프로덕트를 gel elution한 후 nano drop하면 분명히 존재하고, 순도 또한 insert 1과 크게 차이나지 않는데 제한효소 처리만 하면 smear조차 나타나지 않고 아예 검은 구멍으로 나타납니다... 사용한 dna 분량은 1ug으로, 일단 내일은 2ug으로 늘려 사용해보려고 합니다. 혹시 추가적으로 조작해보면 좋을 조건이 있을까요?

저희가 사용하는 벡터에서 발현량이 만족할 만큼 나오지 않아 copy number를 건드려볼까 생각하며 벡터를 찾고 있습니다. 그런데 위 그림에서는 low copy라고 되어있는데 막상 들어가서 ori를 확인해보면 아래 그림과 같이 high copy number라고 나와있습니다... 무엇이 옳은것인지 학부생의 단계에서는 판단하기 어려워 다른 조절자가 있는건지 찾아보고 있지만 아직 성과가 없어 이곳에 질문 드립니다.