Temperature sensitive mutant에 대해서 방법 하나를 봤는데요  이게 제가 제대로 이해한것이 맞는지 확인부탁드립니다 ㅜㅜ 우선 ts mutation되어있는 어떤 유전자를 넣고 그 세포를 permissive temperature에서 키우면 control과 같이 자라지만  non-permissive temperature 예를 들어 39'c에서 키우면 죽어 있는 부분을 확인해서 그 cell들을 따와서 사용하는건가요...?    

안녕하세요. 대학교 학부 실험생입니다. 다름이 아니라 최근에 전기영동 실험을 하는데 Hind3와 Nde1으로 cut하는 결과값이 계속 잘 안나와서 스트레스를 받아서 질문글을 남깁니다. 사용하는 백터는 Pet23b 이며   insert가 다른 플라스미드 3가지(앞에3개), 뒤에는 하나가 안나왔지만 Hind3와 Nde1으로 double cut한 plasmid 3가지 입니다. 여기서 뭔가 이상하게 나와   Plasmid , Hind3처리, Nde1처리, Hind3+Nde1 처리한 순입니다. 해당사진으로 Nde1이 이상해 cut이 안나는거 같아 Nde1으로 농도만 다르게 한체 실험한 결과  Plasmid, Nde1(1), Nde1(1.5), Nde1(2) 순의 결과가 나왔습니다.()<-괄호 안 숫자는 제한효소 양입니다. Nde1의 띠가 자꾸 이상하게 나오는데 band가 2곳에서 생기는게 아닌거보면 잘리는거같기도하고 의문점이 너무 강하게 듭니다. 질문 1. Hind3가 잘못된게아닌 Nde1이 안잘린게 맞는건가요?? 아니면 둘다 cut되었는데 다른곳에서 잘못되어 결과가 이상하게 나온건가요?? 1-1. Nde1이 컷이 안되었다면 어째서 band가 한곳에서만 나오는건가요?? 2. Nde1과 Hind3를 처리할때 D버퍼에서 활성도차이가 Nde1(75~100), Hind3(10~50)이라 차라리 single cut을 두번하는게 나을까요?? 2-1. Single cut을 두번한다면 에탄올침전법을 이용하여 분리하면 된다는데 해당방법에 대한 설명을 조금더 해주실 수 있을까요? 혼자 연습해보니  유실이 너무 많이되는거 같습니다. 제 지식이 너무좁아 부끄럽지만 질문 글 읽어주셔서 감사합니다.

mini prep 하려고 plate에 spreading 해놓은걸 깜빡해서 4도씨 냉장고에서 4일 정도가 지나버렸는데 이걸로 prep을 해도 괜찮은걸까요?

DNA 또는 RNA lysis 실험을 할 때 실험대에 호일을 깔고 실험을 하는데요.   전임자 선배님한테 물어봤는데 본인 전임자가 그냥 호일 깔라고 해서 깔았다고 말하더라고요.   저는 이유를 알고 싶어서 찾아봤는데 "얼려진 혈액 샘플에서 높은 질의 DNA 또는 RNA를 얻으려면 알루미늄 블록에서 녹이는 방법이 좋다."라는 문장이 있더라고요 (출처 https://www.nature.com/articles/s41598-021-96567-2)   진짜로 저 이유 때문인가요?   그런데 저는 얼린 샘플을 알루미늄 블록에서 녹이는 것이 아니라 진짜 실험대 위에 호일을 깔고 호일 깔려진 실험대 위에서 vial rack 놓고 kit 용매들 놓고 실험하거든요. 이렇게 보면 알루미늄 호일은 샘플 녹이는 용도가 아닌 단지 깔끔하게(?)하기 위해서 쓰는 용도처럼 보이는데...뭔가 특별한 이유가 있을까 싶어서 질문합니다.

안녕하세요! 이상한 plasmid로 인해 실험에 차질이 생겨 조언을 얻고자 질문 올립니다.  plasmid prep 후에 nano drop으로 측정한 농도가 일반적인 sample의 1/10 이상 낮게 나왔습니다. (일반적으로 적어도 100ng/ul 이상은 나오는데 10ng/ul대입니다) 그래서 1% agarose gel에 plasmid를 걸어보니 supercoil form과 linear form으로 추측되는 band, 이 2개 band가 거의 비슷한 진하기로 나오더라구요. 제한효소 처리하였을 때는 깔끔하게 잘 잘리구요! 제한효소 처리해서 괜찮으면 어떤 form이든 plasmid를 사용하는 데 있어서 문제가 되진 않는다는 의견을 봤는데요, 제 경우에는 plasmid 농도가 너무 낮게 나와서 실험에 이용하기가 힘듭니다ㅠㅠ  다른 sample과 함께 prep을 진행하였는데 항상 이 sample 하나만 이러한 결과가 나오는 걸로 봐서는 prep 과정의 문제는 아닌 것 같습니다. 그리고 이 sample도 수율이 높았던 적이 있었는데 그 때의 plasmid를 gel에 걸어보니 지금 수율이 낮게 나오는 것과 전혀 band 패턴이 다르더라구요. supercoil form이 가장 많은 일반적인 plasmid band 패턴이었습니다! 수율이 낮은 것과 plasmid band 패턴이 이상한 것이 관련이 있을까요? 아무리 서치해봐도 속시원한 답이 나오지 않네요,, 혹시 이런 경우가 있었던 분이 계시다면 조언 부탁드립니다..!

안녕하세요 저는 초파리를 모델동물로 연구하고 있는 대학원생입니다. single fly pcr을 하려고 하는데, OR로 gDNA를 뽑으면 농도가 대략 1000ng/ul 정도 나오는데요, 실제로 실험에 사용할 233 {nos-cas9-mSA, Pax-GFP} attp40 초파리 라인을 한마리씩 뽑으면 농도가 200ng으로 나와요.  인젝션 보내고 제가 찾는 라인 screening 할때 한 마리씩 single fly pcr하려고 하는데, 농도가 낮으니까 pcr도 잘 밴드가 안 뜹니다. 원래 single fly pcr방법으로 gDNA 뽑을 때 초파리 라인 마다 농도가 다른가요?? 제가 사용하는 방법은 1X SB buffer를 30ul넣고 호모게나이저로 약 2분간 갈고 37도에서 30분간 incubation 시키고 95도에서 5분간 둔 후에 최고 스피드로 원심분리하고 바로 얼음에 꽂아서 농도 측정 후 pcr하는 것으로 하고 있습니다.   혹시 single fly pcr할 때 gDNA 뽑는 다른 방법이나 제 방법에서 고칠 점이 있을까요?

dna 추출 버퍼를 만들고 있습니다. 참고하는 논문에서 100ml 버퍼를 만들때 PVP-40 1%를 만들기 위해서 pvp-40 1g을 넣었습니다. 랩실에서 가지고 있는건 PVP와 PVP-10입니다,   분자량이 PVP=360,000 PVP10=10,000 PVP40=40,000인걸 알고 있는데   어떻게 계산해서 PVP10을 넣어야 할지 잘 모르겠습니다   도와주세요ㅠㅠ

실험 설계 과정에서 질문드립니다. 제가 RNA extraction, cDNA synthesis, qPCR을 같은 날에 모두 진행하려고 하는데요. 저는 -20도씨 보관 중이던 cDNA로 PCR해본 적 밖에 없어서.. cDNA 합성 후 바로 qPCR을 진행해도 되나요? cDNA 합성 직후는 cDNA의 온도가 어느 정도 올라가있는 상태일텐데 이때 냉동보관 중이던 primer를 바로 첨가해줘도 되나요?

칫솔과 구강상피세포에서 각각 DNA를 추출하려 합니다. 숟가락으로 구강상피를 긁어서 침을 뱉은 것과, 치약 없이 양치한 칫솔을 NaCl 0.4g, 세제(계면활성제) 1.4g, 증류수 30ml 혼합한 용액에 넣고 50도, 10분간 방치해두었습니다. 그 후, 차가운 에탄올 4ml를 천천히 분주하여 떠오르는 DNA를 확인하는 실험을 진행했습니다. 구강상피세포에서는 DNA 추출량이 많았으나, 칫솔에서는 DNA가 거의 추출되지 않았습니다. 그 이유가 무엇인지 여쭤보고 싶습니다.

0.8% agarose gel에 sample을 넣고 elution했을 때 확연하게 1 band였고 그 부분만 잘라서 gel extraction 후에 checking을 했는데 2 band로 나타났습니다. 전에도 이런 현상이 있었는데 해당 샘플로 sequencing 보냈을 때에도 mix 없이 잘 읽혔거든요 .. 왼쪽 사진이 elution하기 전이고 오른쪽 사진이 elution 한 뒤에 2 band로 나타난 모습입니다. 1 band가 elution 후에 2 band로 나타나는 이유가 뭘까요ㅠㅠ

안녕하세요.. 문득 궁금한게 있어 질문 드립니다. gDNA extraction이나, Plasmid extraction 할 때 사용하는 키트들이 구분이 되어있는데 gDNA 뽑으려는 균이 plasmid를 가지고 있다고 가정을하면 gDNA extraction 할 때 Plasmid도 같이 추출이 가능한가요?

50년 이상 된 조직이고 에탄올에 보존되어 왔습니다..   qiagen blood and tissue kit을 활용하여 추출하고자하는데..   전처리과정등 DNA 추출 수율을 높이기 위한   방법이 없을까요?

  대학원 박사과정입니다. 부사수에게 mini-prep을 시켜 놓았는데 어제 저녁에 seeding 해놓은 것을 오늘 아침 냉장고에 넣고 내일 mini-prep 한다고 말을 하는데 저는 박테리아 상태가 좋을때 뽑는 것이 좋다고 말했지만 부사수는 냉장고에 넣어 둔다고 상태가 안좋아지냐며 내일 하면 안되냐고 물었는데 귀찮아서 내일로 미루려는거 같아 좀 짜증을 냈습니다. 그런데 막상 생각해보니 purity가 나빠질 것 같진 않고 정량값도 낮아질까?라는 의문이 들어 보다 확실하게 알아두고 알려주기 위해 글을 썻습니다. 혹시 논리적 근거를 알려주실 수 있을까요? 아니면 제 생각이 틀린건지?

안녕하세요 miniprep 관련 질문드립니다. 제가 얼마전에 prep을 하면서 마지막 elution을 30 uL정도로 했는데 최종 DNA volume이 100 uL가 정도가 나왔더라고요. (제가 마지막 ethanol washing 후 잔여 ethanol을 완벽히 제거하지 않아서 였습니다.)   따라서 DNA만 다시 분리하고자 elution 용액(DNA+DW+ethanol)에 miniprep sol3 용액을 과량 섞어준 뒤 다시  prep column에 내렸거든요. (제가 알고있는 이론으로는 DNA가 column에 붙은 원리가 pH때문이라 알고있어서 sol3랑 섞어주면 column에 잡힐 거라고 생각했습니다.)   그런데 다시 elution 하니까 DNA recovery가 하나도 되질 않았더군요. 혹시 이유가 무엇있까요? 짐작가는게 없어서 질문드립니다. 원래부터 DNA 양이 적었던건 아닙니다. column에 다시 내리기 전에 DNA 농도를 측정했었는데 ethanol이 섞여있긴 해도 DNA농도가 적지는 않았었거든요.   답변 주시면 감사드립니다.

plasmid를 midi prep할 때  마지막 단계에서 ethanol을 넣고 centrifuge한 후 ethanol을 제거하고 d.w.로 suspension을 해주는데요 원래 ethanol을 pipette으로 최대한 제거해주고 말려야하는데 상등액만 제거하고 ep tube 밑에 좀 고여있는 상태로 놔두었습니다. 5시간정도 상온에 냅뒀는데 ethanol은 거의 그대로 있고 pallet이 사라진 것 같아서요..   혹시 ethanol에 dna pallet이 녹을 수 있나요? dna 자체는 ethanol에 insoluble한 것으로 알고있는데.. 

농도계산법 : 흡광도 측정 값 ⅹ희석비율(%)ⅹDNA 측정 상수 값 (50) /단위 ㎕로 환산. DNA 를 총 500 ㎕를 맞췄다. 그리고 5 ㎕ DNA 를 1,000 ㎕ 물로 희석하여 비율은 200 이다. A 260 = 0.064 과 A 280 = 0.039 이다. DNA 의 농도와 순도는? 0.064 x 200 x 50 = 640 ㎍/ml = 0.64 ㎍/㎕ x 445 ㎕ = 284.8 ㎍을 갖고 있다. 순도(Purity)는 0.064/0.034 = 1.88 이다. 그러므로 단백질 등의 오염 순도가 높다. DNA양을 구하려면 640에 0.005를 구해야하는것이 아닌가요? 그런데 왜 뜬금없이 445가 나온건지 이해가 안됩니다 445가 어떻게 나왔을까요....?

농도계산법 : 흡광도 측정 값 ⅹ희석비율(%)ⅹDNA 측정 상수 값 (50) /단위 ㎕로 환산. DNA 를 총 500 ㎕를 맞췄다. 그리고 5 ㎕ DNA 를 1,000 ㎕ 물로 희석하여 비율은 200 이다. A 260 = 0.064 과 A 280 = 0.039 이다. DNA 의 농도와 순도는? 0.064 x 200 x 50 = 640 ㎍/ml = 0.64 ㎍/㎕ x 445 ㎕ = 284.8 ㎍을 갖고 있다. 순도(Purity)는 0.064/0.034 = 1.88 이다. 그러므로 단백질 등의 오염 순도가 높다. 여기서 445 는 대체 왜곱하는건가요? 양을 구하려는건가요?

농도계산법 : 흡광도 측정 값 ⅹ희석비율(%)ⅹDNA 측정 상수 값 (50) /단위 ㎕로 환산. DNA 를 총 500 ㎕를 맞췄다. 그리고 5 ㎕ DNA 를 1,000 ㎕ 물로 희석하여 비율은 200 이다. A 260 = 0.064 과 A 280 = 0.039 이다. DNA 의 농도와 순도는? 0.064 x 200 x 50 = 640 ㎍/ml = 0.64 ㎍/㎕ x 445 ㎕ = 284.8 ㎍을 갖고 있다. 순도(Purity)는 0.064/0.034 = 1.88 이다. 그러므로 단백질 등의 오염 순도가 높다. 여기서 445 는 대체 왜곱하는건가요?

Mouse의 꼬리로 부터 gDNA를 추출해 genotyping하는 실험 중 궁금한 것이 생겨 질문 드립니다. Proteinase K를 사용하고 하루동안 incuvate 시켜놓은 샘플에다가  50ul의 saturated NaCl(6M)을 첨가하였고 원심분리 후 상층액을 취하여  DNA를 얻어냈습니다. 그런데 왜 포화 NaCl을 첨가했을때 DNA만 용해되고 나머지 물질은 불용성 물질이 되는지 궁금합니다. 또한 genotyping 한 결과 정상 밴드와 KO된 밴드를 제외한 밴드는 HT에서만 나오는 이유는 무엇일까요? 이 밴드를 줄이려면 어떻게 해야할까요? 도와주시면 정말 감사하겠습니다  

이미 정제되어있는 500ng/ul 정도의 DNA 샘플들이 있습니다. 하지만 저는 더 높은 농도의 샘플을 원하기때문에 이 샘플들을 합쳐서 높은 농도로 만들려고 합니다(ug수준). 어떤 방법이 좀 더 손실이 적고 효과적인가요? column을 이용해서 할려니 column의 수용력? 에는 한계가 있어서 안될것같고… 샘플들을 합쳐서 에탄올 침전법으로 침전시킨 뒤, 다시 elution하는 방법을 이용하면 제가 원하는 농도만큼 얻어낼 수 있을까요?? 조언좀 부탁드립니다.