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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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Q. 전기영동할 때 DNA marker가 삐뚤삐뚤하게 내려와요
안녕하세요! 전기영동할 때 DNA marker (ladder)관련해서 질문드립니다. 맨 왼쪽은 100bp짜리 ladder이고 dye가 포함되어있는거라 2ul 로딩하였고 두번째 lane은 1kb짜리이고 dye가 포함되어있지 않은거라 6X loading dye와 비율 맞추어 섞은 뒤 2ul 로딩하였습니다. 100V로 한시간 running하였는데 100bp짜리는 가지런하게 내려오는데 1kb짜리는 왜 저렇게 사선으로 내려올까요?ㅠㅠ 해결방법 아시는분~! ㅠㅠ 젤은 0.8% agarose입니다!
회원작성글 jeongjjang..  |  02.06
Q. midi prep 이후 plasmid electrophoresis했을 때 이상한 밴드가 나옵니다. 첨부파일
선생님들 안녕하십니까? 학부생입니다. 현재 plasmid를 DH5a cp cell에 transformation해서 midi prep한 다음 confirm하는 과정을 진행중인데요. 이상한 밴드가 계속 나와서 머리가 아픕니다...   gel은 0.7%고 non-cut plasmid입니다. plasmid가 맞는지만 적당히 확인하기 위해 cut은 안했고요. 사진에서 2번레인이 이전에 쓰던 것이고 (stock) 3,4 번레인이 새로 midi한건데  위쪽의 supercoil이나 nick 이런 밴드는 알겠는데 밑에 100-300bp?에 이상한 밴드가 눈에 보일정도로 진해졌네요. 자세히 보면 맨 윗밴드도 진해진 것 같고요. 이 밑에 밴드가 뭔지 모르겠습니다. 이전 랩에서 midi하면서 이런 밴드를 본 기억이 없는데.. contamination된건지?    260/280값이 조금 높게 나오기는 하는데 (1.9이상) 이건 stock midi했을 때에도 마찬가였습니다. 아마 midi에 쓰는 buffer가 오래된 거라 그런 것 같은데.. 그걸 감안해도 눈에 보이지 않던 밴드가 진해져서 머리가 아프네요.   제가 생각하기에는 gDNA나 RNA가 섞여있거나 (당연히 Sol1에 RNase A 처리하고 4도씨 보관, 실험중에도 ICE보관하면서 했습니다) plasmid denaturation이 되어서 single strand가 나왔거나(이전에도 똑같이 inverting하고 lysis 5분했는데 왜..) 하는 것 같은데 이걸 어떻게 해야 할 지 모르겠습니다.  transfection할 때 사용할 거라 이상한 것 같으면 처음부터 그냥 새로운 CP cell 까서 buffer까지 새로 바꿔버려야 할지... RNase나 enzyme cut을 시도해봐야 할지 고민입니다. 만약 RNA contamination이라면 RNase를 처리하고도 293T에 transfection 할 수 있는지도 궁금합니다. 사용한 midi kit는 N*****B**** kit입니다.  이전에 Q사에서는 이런게 보이지 않았던 것 같은데.. 아무리생각해도 잘 모르겠네요. Neutralization 이후 ICE incubation과정이 없어서 그런건지..   도와주세요 선생님들.. 
회원작성글 큰곰인형  |  02.05
Q. Maxi prep yield가 낮은 이유를 잘 모르겠습니다...
안녕하세요. 인턴으로 일하고 있는 대학생입니다.   이번에 두 종류의 Plasmid를 Maxi prep 하게 되었는데요. 하나는 1800ng/ul에 purity는 1.91로 잘 나왔지만   다른 plasmid는 315ng/ul에 purity는 1.90, 260/230은 2.15로 결과가 심하게 차이가 났고, 이번에 다시 문제의 Plasmid들만 다시 2번의 maxi를 더 했으나 둘 다 purity는 1.90에 300ng/ul 언저리로 나와 질문드리고 싶어 작성하게 되었습니다..   실험의 경우, protocol 진행에 있어 1800ng/ul과 300ng/ul 두 pL의 다른 점은 없었습니다. 16시간 배양 후, 첫 centri에서의 pellet은 1800ng/ul의 pL이나 문제의 pL이나 모두 같은 양이 추출되었으나, 마지막 TE로 녹이기 전 Centri에서의 pellep 양은 확연한 차이가 발생하였습니다.   특히나, 개인적으로 궁금한 점은 흡광도에서 A260과 A280값이 1800ng/ul = 37, 19 300ug/ul = 6.3, 3.3 이렇게 나오는데, 이 경우 DNA의 양 뿐만이 아니라 Protein의 양도 적게 나왔으니, pL이 transfection 된 양이 적은 것이 아니라 protocol 진행에 미스가 났다고 봐도 되는걸까요..!   또한, pL 종류에 따라 최종 Yield 차이가 많이 날 수도 있는건가요??  
회원작성글 푸이잉  |  02.02
Q. 전기 영동 후 gel purification
전기 영동 후 밴드를 잘라서 EP tube에 넣고 냉장고에 보관 후 약 20시간 후에 gel purification을 시작해도 될까요?
회원작성글 링가링가링  |  02.01
Q. promega genome dna 추출이 안되는 이유가 있을까요ㅠ
promega genome dna purification 키트 사용해서 진행했는데 프로토콜에서 protein precipitation solution 넣고 ice에 넣고 centrifuge 돌린후에 상등액 옮겨서 isoprophenol 넣고 centrifuge 돌리면 pellet이 생겨야하는데 아무리해봐도 pellet 없습니다.. cell양이 적은가해서 양도 늘려서 해봤는데 pellet이 다운이 안되는데 제가 놓친 부분이 있을까요..?
회원작성글 말하는걈쟈  |  02.01
Q. 전기영동 사진 분석 첨부파일
안녕하세요 이제 막 랩실에 들어와서 연구실 생활을 하고있는 학부생입니다!  DNA purification 후 얻은 dna로 전기영동을 진행하던 중 질문이 있어서 사진과 함께 질문 드립니다!   Q1. 주황색 박스 안에 있는 밴드는 왜 휘어져있는것인지 궁금합니다! 전기영동 진행 중 책상에 큰 충격은 없었습니다. Q2. 파란 작스 안에 있는 밴드들은 대체로 밑부분이 옴폭 들어가있는데 이같은 개형은 왜 발생되는지 궁금합니다. Q3. 자주색 박스와 초록색 박스안에 밴드가 끝부분에서 두개씩 있는걸 볼 수 있는데 자주색 박스의 반 갈라짐과 초록색 박스의 반 갈라짐이 조금 다른 모습을 보이는데 밴드가 끝부분에서 반으로 갈라지는 이유와 갈라지는 모양이 조금씩 다른 이유가 궁금합니다.   제가 이론이 조금 미숙하여 모르는 부분이 많습니다 알려주신다면 열심히 참고하여 공부하겠습니다, 감사합니다. 혹 전기영동과 관련된 추천 서적이 있다면 추천 부탁드립니다!
회원작성글 생명사냥꾼  |  01.30
Q. 특정 Colony만 plasmid yield가 낮게 나올 수도 있나요?
안녕하세요. DH5-alpha cell에 FLAG vector를 넣어 transformation 시킨 후, 배지에 키워 콜로니가 생겼고 거기서 약 5개정도의 colonly를 따서 각각 50ml tube에 10ml LB + Ampicillin을 넣고 overnight하였습니다. 이후 가장 잘 자란 놈만 골라서 glycerol stock을 만들고 그 놈을 다시 LB culture 하여 miniprep을 하였는데 DNA 농도가 50ng/ul밖에 되질 않네요... PLKO 등의 벡터를 예전에 뽑았을 땐 200ng/ul정도는 나와줬는데... 특정 Colony만 plasmid yield가 낮게 나올 수도 있는 걸까요 아니면 해당 벡터가 원래 수율이 낮은걸까요..?
회원작성글 대학원생1122  |  01.30
Q. 갑각류 DNA추출 시 깨짐 도와주세요~
다른 DNA는 잘들 뽑히는데 유독 갑각류에서만 DNA가 깨져서 스미어하게 나옵니다 ㅠㅠ.. 다른 sample들보다 PCR도 잘 안되고 NGS시에도 contig가 짧습니다. 혹시 DNA 추출에 내공이 있으신 분들은 어떻게 하시나요?   * 해양 갑각류에서 속살로 하면 기생충이 나오고, 껍질로 하면 뿌옇게 섞이지 않은 탄산칼슘(으로 추정되는)이 나오더라구요. 농도나 순도도 정확히 않은것같아 찝찝하고요..   뭐라도 좋으니 아무 조언이라도 부탁드립니다..   
회원작성글 아라온  |  01.16
Q. gel extraction 질문드립니다
gel extraction을 진행할때 UV에 비춰보면 제가 원하는 size에서의 band와 밑에 훨씬 더 두꺼운 band가 뜨는데요. 원하는 사이즈의 band를 자르는건가요? 밑에 로딩되어 내려온 두꺼운 사이즈의 band를 자르는 건가요?
회원작성글 분자생물학도  |  01.07
Q. lentivirus용 package plasmid의 전기영동
안녕하세요, 우선 즐겁고 행복한 연말연시 보내시길 바랍니다. 다름이 아니라 lentivirus를 위한 package plasmid도 electrophoresis를 할 수 있는지 여쭤보고자 질문 드립니다! size만 알면 할 수 있는지요..? 미리 감사드립니다!
회원작성글 Tngzz  |  2022.12.31
Q. Avastin 몰수 구하는 방법
Avastin 분자량 : 149,196.82g/mol 몰수 (n) = 질량 (w) / 몰질량 (g/mol)인데요... 1mol에 149,196.82g 이 있다는 거잖아요? 그럼 제가 이걸 5mg/kg으로 투여를 하려고 하는데, 어떻게 계산을 해야하는지 궁금합니다.
회원작성글 medi92  |  2022.12.30
Q. 몰수 구하는 방법
몰수 구하는 공식을 공부하는 중에 궁금해서 여쭤봅니다. 분자량 = 몰질량 = 화학식량 = 원자랑이며, 몰수 (n) = w (질량) / M (몰질량) Avastin 몰질량 (=분자량) : 149,196.82 g/mol 식에 대입하면, Avastin 투여량 : 5mg/kg 이러한 정보로 Avastin 몰수 (n)을 구하는 방법을 알고 싶습니다.
회원작성글 medi92  |  2022.12.30
Q. DNA purification 농도..
안녕하세요, dna purification실험 관련해서 질문드립니다.      qiagen dna purification kit 사용해서 dna purification을 했습니다. (elution시 모든 샘플에서 동일하게 50ul of EB 사용했고요)   nanodrop을 사용해서 0.001 wt% dna solution의 concentration을 측정했습니다.  concentration측정시 base는 purification할때 사용한 elution buffer로 잡았고요,  purification전 dna concentration측정했을 때는 약 12ng/ul (1.67 260/280), purification 후 dna concentration은 약 21ng/ul(1.72 260/280)가 나왔습니다..;     이런 결과가 한 번이 아니라 여러 번 반복적으로 나왔는데요.. 위의 결과 외에도,    concentration of 0.01 wt% dna solution: purification 전: 102.7ng/ul (1.81 260/280), purification 후: 107.5ng.ul (1.90 260/280) 와 같은 결과가 나와서 당황스럽네요.    nanodrop이 고장났나(?) 싶어서 qubit으로도 재확인해보았는데요,    qubit으로 측정시 purification 후의 0.001 wt% dna concentration은 20ng/ul (1.81 260/280), 0.01 wt% dna concentration은 95ng/ul (1.90 260/280)으로, 각각 purification 전의 농도(12ng/ul (1.67 260/280), 102.7ng/ul (1.81 260/280))보다 여전히 높거나, 약간 낮은 수준입니다.   이전에 purification 실험을 진행했을 때는 purification전의 농도가 purified solution보다 제법 높았던 것 같은데..  혹시 실험과정에서 제가 어떤 실수를 한 건지, 혹은 다른 이유가 있는지..  알려주시면 정말 감사하겠습니다..!   두서없이 긴 질문글, 끝까지 읽어주셔서 감사합니다.       
회원작성글 기라델리  |  2022.12.26
Q. 시약 구매
실험을 좀 해보고싶은것들이 생겨서 시약좀 알아보는데  개인이 구매를 못하는 겁니까?
회원작성글 래핀  |  2022.12.25
Q. 전기영동 시 DNA band, RNA band가 1개, 2개인 부분에 대해 질문드립니다.
안녕하세요.. 초짜 연구원입니다.   DNA, RNA 추출해서 잘되었는지 확인하는과정으로 전기영동할때, 1개, 2개의 밴드가 나와야 잘된거다 라는 부분은 이해하였고 전기영동 시 DNA가 total DNA 느낌이라 1개 band RNA는 18S, 28S 해서 2개, 5S까지 해서 3개의 band가 보통 정상이다라는 부분은 이해하였으나   왜 DNA 추출되는 길이가 다르고 할텐데 1개의 밴드로 보이는지 18S, 28S RNA가 추출된 길이가 여러가지 일텐데 어떻게 딱 2개의 밴드로 보이는지 궁금합니다. 추출할때는 온전한 길이의 18S, 28S RNA가 많아서 각각 1개의 밴드를 형성하는 건지 어떻게 찾아보거나 이해해야하는지 궁금합니다.
회원작성글 흰털누누  |  2022.12.22
Q. cDNA 농도가 너무 낮아서 RNA로 transcription 하기 위한 mixture
cDNA을 추출해서 350ul을 확보 했는데요 농도를 쟤니까 37.8ug/ml이 나오더라구요 만들어야할 mixture의 농도는 1ug으로 RNA을 만들려고 하는데요 1ug = 1000ng  1000/37.8 = 26.45ul인데 mixture kit에서 total volume이 20ul 이거든요... kit에 있는 각각의 조성도 양이 적어서 어떻게 하는게 나을까요?....ㅠㅠ
회원작성글 medi92  |  2022.12.07
Q. DNeasy Plant Mini kit 관련
안녕하십니까. 신참 대학원생입니다. 능숙하지 않다보니 실수가 많은것 같습니다. 때문에 간혹 DNA 농도가 낮거나 ratio가 엉망징창인 경우가 있어 Nano Drop 측량이 항상 무섭습니다... 우선 세가지 궁금한점이 있어요. - 점액질이 많아 lysis버퍼를 넣고 샘플이 뭉치는 경우에 어떻게 해야 할까요? 잘 풀리게 voltexing, tapping을 해도 될까요? 그 후에 RNase를 넣어도 될까요? - 프로토콜에는 없지만 마지막 단계에서 AE buffer를 넣기 전에 한번 건조하는 시간이 필요하지 않을까요? - 프로토콜 상에는 AE buffer 를 100ml 첨가하라고 되어있는데 50ml를 첨가해도 문제가 없을까요? 읽어 주셔서 감사합니다.
회원작성글 잘뽑고싶어요  |  2022.12.06
Q. EZ-Pure™ Plasmid Prep Kit. Ver. 2, EZ-Pure™ Gel Extraction Kit. Ver. 2 실험 질문
제가 실험 수업에서 아가로스 겔 전기영동 하고 EZ-Pure™ Plasmid Prep Kit. Ver. 2,  EZ-Pure™ Gel Extraction Kit. Ver. 2 가지고 실험 했는데 교수님이 그냥 다짜고쩌 실험 보여주고 다른 학생들에게 가려서 실험 과정은 보지도 못하고 생각없이 받아적기만 하고 실험했더니 결과도 잘 안나와서 근본적인 실험 목적과 제대로 실험 했을 때의 결과를 모르겠네요... 도와주시면 감사하겠습니다. 
회원작성글 gerjoi  |  2022.12.06
Q. Real time PCR 기초 질문 입니다.
안녕하세요. Real time PCR을 막 배우게 된 초보 연구원입니다. 다름이 아니라 housekeeping gene은 모든 세포에서 일정하게 발현되는 유전자로 알고 있는데요. 제가 실험에 사용한 gene이 actin-B이거든요. 근데 Ct 값이 28 부근에서 떠서요. 원래는 어느 Ct 값에서 뜨는게 정상인지에 대해 여쭤보고 싶습니다.
회원작성글 medi92  |  2022.12.02
Q. 전기영동 gDNA
구강상피세포를 kit로 추출해 1.2% agarose gel에 135v 20분 Dna농도를 뒤로 갈수록 많아지도록 내렸습니다. 로딩샘플을 만들면서도 확인하고 겔에 넣기 전에도 다시 확인하면서 로딩했는데 3번이나 결과가 이상합니다. Ratio 값이 1.9인 것과 1.8인 차이에 의해서 일어날 수 있는 일인가요? 5번째보다 6번째 well에 더 많은 양의 gDNA를 넣었는데 왜 5번째가 더 밝게 보일까요…
회원작성글 631  |  2022.11.21
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