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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > etc.
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Q. confocal시 fam 관찰
안녕하세요 5'-6-FAM(fluorescein amidite)가 결합된 antisense oligonucleotides를 mouse injection하고 target organ을 whole mount dissection으로 slide 제작하고 target cell에 antisense oligonucleotides가 들어갔는지 confocal로 확인하는 실험을 하고있습니다 염색은 DAPI, Phalloidin(actin염색, alexa fluro 647)로하고 dapi, 647, fam 채널로 찍고있습니다 문제는 injection시행하지않은 control slide에서도 fam signal이 상당히 나와서 실험군의 signal이 신뢰할만한 것인지 의문이 듭니다 control slide의 형광이 보이지않을 정도의 confocal setting에서 실험군 촬영하는 것 외에 혹시 다른 방법이 있을지요? 아니면 FAM에대한 antibody를 써보신 분이 있으신지 궁금합니다. 감사합니다
회원작성글 tkdnsel  |  08.09
Q. CRISPR/Cas12a 반응을 위한 시약 조성비에 관한 질문입니다. 첨부파일
한 논문에서 본 실험의 시약 조성비입니다   해당 논문에선 200nM Lba Cas12a, 1uM crRNA, NEBuffer 2.5 ul, 20U RRI, RPA product9(dsDNA) 2ul, 800 nM fluorophore quencher labeled ssDNA probe로 reaction volume은 25 ul 이라고 하였습니다.    실험 초보여서 이렇게 쓰여있어 어떻게 넣어야 할 지 의문입니다.   동일한 Lba Cas12a을 찾아보니 stock의 concentration이 1uM인데 그렇다면 Lba Cas12a를 5ul 넣어 200nM 을 넣으면 되는 것 인가요? total volume은 25 ul 이기에 1/5인 5ul를 넣어서요.    RRI의 양과 논문과 같은 Probe를 사용한다면 고정적인 수치일것이고  그렇다면 만약 다른 crRNA를 사용하고자 한다면 그 crRNA의 농도에 따라 reaction volume 도 달라지는 것 아닌가요?    사진은 논문 원문입니다.    감사합니다. 
회원작성글 자가격리  |  08.09
Q. CRISPR Cas9 knock-out 후 gene 도입 관련 질문드립니다.
안녕하세요, Crispr Cas9 knock-out 시스템을 랩에 구축하려 공부중인 대학원생입니다. 궁금한 점이 있어 질문드립니다.   guideRNA는 shRNA와는 다르게 반드시 CDS만을 target해야 하는 것으로 이해했습니다.   Cas9과 gRNA를 expression하는 vector를 transfection하는 system으로 knock out을 진행하고자 하는데요, 이를 통해 knock out이 발생한 cell에서는 Cas9과 target의 CDS에 대한 gRNA가 계속 발현하게 될텐데,   이 cell에 만약 WT 혹은 mutant의 target gene을 plasmid를 통해 도입시켜 준다면, 도입시켜준 gene에 대한 knock out도 발생하게 될것으로 예상되는데, 실제로 그러한지 궁금합니다. 제가 이해한 바가 맞는지...   그리고 이러한 현상을 피하기 위해서 반드시 doxycyclin-dependent하게 발현하는 cas9과 같은 제품을 사용해야 하는지도 알고 싶습니다.
회원작성글 웨스턴공장매니저  |  08.02
Q. facs 실험에서 휘발성물질 사용 하는법
facs실험을 할때 휘발성 물질(beta-mercaptoethanol)이 들어간 샘플을 측정하고 싶은데 기계안에 휘발성 물질이 들어가면 부식시킬수 있어서 사용하지 말라고 들은적이 있습니다.   그런데 많은 논문에서 휘발성 물질이 들어간 버퍼를 이용해서 샘플을 많이 찍었습니다.   어떻게 논문을 따라서 휘발성물질이 들어간 샘플을 facs로 분석할수 있을까요?
회원작성글 오르골  |  07.27
Q. RT-qPCR 시 비교군 설정
동물 조직에서 RNA를 isolation후에 cDNA 합성까지 하였습니다 ct값 비교를 위해 rt-qpcr을 해야돼는데 비교군을 R-, R+, RNA로 설정(중합효소의 유무와 cDNA를 대신하여 RNA로 mater mix 제조)하였고 프라이머(NTC, gapdh를 사용) 비교한 결과 R+에서 ct값이 15~16이 나왔고 나머지 R-, RNA에서 31~32의 값이 나왔습니다. 이론상  R-, RNA에서 증폭되지 않는 값이 나오거나 높은값이 나오도록 하는것이 옳바른 실험의 결과인데 굳이 비교군을 R-, R+ 여기에 RNA까지 설정하는 이유가 무엇인지 궁금합니다. 아직 배우고있는 입장이라 질문자체에서 오류가 있을수도있지만.. 혹시 이해하셨다면 답변 부탁드립니다. 
회원작성글 anbound  |  07.26
Q. NCBI에서 Organism 찾는법
너무너무너무 기초적인 질문인거 같은데... 원하는 organism을 어떻게 찾나요? taxid 번호라도 찾고싶습니다ㅠㅠ Methanobrevibacter ruminantium 의 organism이 뭘까요 ㅠㅠ제 위의 분들이 전부 이런 실험을 안해서 너무 힘드네요ㅠㅠ  
회원작성글 살려줘요  |  07.21
Q. Fluidigm 실험에서 STA primer, LSP primer 이 뭔지, 어떻게 만드는지 등이 궁금합니다.
Fluidigm 실험을 하려는 대학원생입니다.  플루다임에 대해 공부를 하고 있습니다.  Fluidigm 실험에서 STA primer, LSP primer 이 뭔지, 어떻게 만드는지 등이 궁금합니다.
회원작성글 원작생실이  |  07.15
Q. 오래된 mgcl2 수분 흡수
랩실에 conical tube에 담겨진 mgcl2가 가루가 있는데, 물을 많이 흡수한것처럼 끈적거립니다. 그리고 무게를 측정할때도 힘듭니다. 원래 mgcl2가 쉽게 물을 흡수해서 끈적거리나요? 이런 상태면 사용하지 말아야 할까요 아니면 괜찮을까요
회원작성글 오르골  |  07.13
Q. pvp와 pvp40 농도 변환
초보 대학원생입니다   dna 추출 버퍼를 만들고 있습니다. 참고하는 논문에서 100ml 버퍼를 만들때 PVP-40 1%를 만들기 위해서 pvp-40 1g을 넣었습니다. 랩실에서 가지고 있는건 PVP와 PVP-10입니다,   분자량이 PVP=360,000 PVP10=10,000 PVP40=40,000인걸 알고 있습니다.   PVP40 1g을 대체해서 PVP를 0.11g을 넣으면 될까요? (분자량 360,000*0.11=약 40,000)   아니면 몰농도를 생각해서 PVP 9g을 넣으면 될까요? (1/40,000=A/360,000   -> A=9)
회원작성글 오르골  |  07.13
Q. 식물 광회복 효과, 광분해 효소 관련하여 질문드립니다
안녕하세요 식물을 대상으로 한 광회복 실험을 진행하려 하는 고등학생입니다!  네이버 백과를 찾아보니 '거의 모든' 식물에 광분해 효소(photolyase)가 있다고 나와있는데, 저희가 물에서 사는 식물을 대상으로 실험하고 그들의 광합성량을 측정하는 방식으로 진행할 거라 혹시라도 광회복을 하지 못하는 식물이 있을까 하여 질문드려요!
회원작성글 mintsilver  |  07.11
Q. 딸기 dna 추출 실험에서 소금, 세제, 에탄올의 사용에 관해 질문 드립니다
학교에서 dna추출 실험을 하게 되어서 여러 자료들을 읽어 보았는데 소금, 세제, 에탄올의 사용에 대해 궁금한 것들이 있어 질문하게 되었습니다. 1. 물은 약한 양전하를 띠기 때문에 nacl이 이온화 되어 만들어진 na+(물보다 강한 양전하를 띰)이 dna의 음전하와 결합하여 물에 용해되지 않게 하는 것이 맞는지 궁금합니다. 2. 세제가 dna를 제외한 모든 것을 녹여서 dna만 남게 하는 것이 맞나요? 3. 에탄올이 물과 dna의 수소 결합을 방해하는 동시에 na+과 dna의 결합을 강하게 해주는 용도로 쓰이는 것인가요?
회원작성글 라리루오  |  07.07
Q. 전기영동 밴드끌림을 해결하고 싶어요 첨부파일
순서대로 marker/ negative / sample 1 / 2 / 3 / positive / positive 입니다. 양은 marker만 2 ul넣고 나머지는 5 ul씩 넣었어요 0.5x TSE buffer를 썼고 겔은 2% 아가로스, 핵산염색약은 greenstar 썼습니다. 100V에서 50 min 내렸구요   어떨때는 일자로 잘내려오고, 어떨때는 사진처럼 내려오는데 주로 사진처럼 내려올때가 많습니다. 버퍼를 새로 만들어서 해도 저렇게 될때가 많아요. 겔도 진짜 열심히 저어주는데.. 안식히고 부어서 그럴까요? 제발 이유를 알고싶어요
회원작성글 윤버찌  |  07.06
Q. 플라스미드 prep 문제
안녕하세요. 최근 기초적인 실험을 배우고 있는 학부생입니다. 현재 dna 플라스미드를 추출해 제한효소로 처리해야 하는데, 플라스미드를 추출하는 과정에서 문제가 생겨 여쭤봅니다. 먼저 첫 번째 실험에서는 플라스미드 추출에 문제가 없었습니다. 그런데, 용량이 부족하여 추가로 실시한 플라스미드 프랩에서 추출이 제대로 일어나지 않았고, 그 뒤로 몇주째 실패하고 있는 상황입니다. 성공했을 때와 똑같은 키트를 사용하고 있고, 항생제 배지를 이용해 세균을 길렀기 때문에 세균의 문제일 가능성은 낮다고 생각합니다. 그래서 실험 과정 중 저의 미숙함으로 인해 문제가 생겼을 것이라 생각하고 반복해서 실험을 진행하였지만, 결과가 계속 나오지 않아 질문드리게 되었습니다. 우선 실험 과정은 kit에 동봉되어 있는 설명서를 보고 진행하였습니다. 제가 생각하는 문제점은 먼저 s2 buffer를 넣었을 때 용액이 파란색으로 변하지 않는 것과 s3 buffer를 넣었을 때 흰색 침전물이 생기는 것 정도가 차이점인 것 같은데, 첫 번째는 blue mix buffer를 사용하지 않아서 그런 것이고 2번째는 단순히 염이나 단백질 같은 불순물이라 생각하였습니다. 혹시 추가적으로 점검해보면 좋을 부분이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 qkqh1  |  07.06
Q. #급함
제가 세특실험으로 브로콜리 dna추출실험을 개인적으로 하려하는데요 괜찮나요? 선생님이 실험이 간단해야한다고 해서요! 목표과는 생명공학과입니다. 그리고 실험할때 어느부분을 더 살리면 좋나요? 이번에 처음인데 주변에서 알려주는 사람이 없어 힘들어요. 그리고 덧붙여 생명공학과 관련된 또좋은 실험 적어주시면 좋을 것 같아요! (욕설.비방.허위답변금지)
회원작성글 따뚜비  |  07.05
Q. 전기영동에서 젤농도와 로딩하는 dna 양 질문!
1.33% 아가로즈 젤에 dna 2ul와 로딩다이 1ul 섞어서 로딩하였더니 밴드가 두개 나왔습니다. 두개중 하나는 컴브에 있었습니다.   이런 경우에 1.3% 아가로즈 젤을 다시 만들어서 똑같은 양의 dna를 로딩하는게 좋을까요 아니면 dna 1ul에 전기영동 틀 안의 tae 1ul를 섞어서 희석후, 로딩다이 1ul와 섞어서 로딩해도 문제 없을까요  
회원작성글 오르골  |  07.03
Q. 5X->1X로 희석..질문 드립니다.
안녕하세요. 실험 초짜인데요.. 5x loading buffer를 1x로 희석해야 하는데 1:5비율로 하는것이 맞는지 여쭈어봅니다ㅠㅠ
회원작성글 김민지1  |  06.27
Q. 농도 계산 도와주세요
안녕하세요 생화학 실험실 학부생입니다...   DNA를 주문을 했는데 4 nmol의 상태로 왔습니다. 이것을 10 ng/uL로 희석하려면 water를 얼마나 넣어야 하나요?   계산하는 법도 같이 알려주시면 감사하겠습니다 !
회원작성글 뭘하지  |  06.26
Q. InDel marker를 이용한 PCR product인데 밴드가 안나와요... 첨부파일
안녕하세요 많은 분들의 의견을 듣고 싶어 이렇게 글을 남깁니다..  제가 이번에 한 식물의 indel marker의 염기서열을 보고 oligo primer를 주문하였으며,  pcr 조건으로는  아래와 같이 진행하였습니다. 95℃- 5min  1cycle -------------- 94℃-30sec 55.2, 49.3, 44.8, 41.8, 40.0 ℃-30sec 72℃-40sec  32cycle -------------------------- 72 ℃-10min  1cycle  ----------------------- 4℃-∞  1cycle 100V, 55min 전기영동, gel 농도 1.5% 처음  45℃ 동일 조건으로 진행하였을 때는 밴드가 희미하게 여러개 보였으나. 이번에 gradient로 진행하니 저번에 나왔었던 45℃대의 여러 밴드들도 안보이고 단일밴드로 나왔습니다.. ladder의 경우 잘 나왔으며, loading dye도 찍혀 있어 겔 밖으로 pcr product가 빠져나가진 않은거 같은데  왜 band가 안나왔을까요,, 이럴 때 해결은 어떻게 하시는지 많은 조언 감사드립니다. 부디 많은 의견 남겨 주시면 감사드리겠습니다.. 추가로 band가 많이 구불 거리는데 이부분,,어찌 해결하는게 좋을까요?  전기영동 v를 낮추고, 시간을 늘리면 될까요?    
회원작성글 해조칼슘풍덩  |  06.24
Q. PAGE 에서 두 ladder가 너무 다른 위치에 나옵니다.
안녕하세요, 바이오 전공자는 아니지만 요즘 DNA 를 이용한 여러 실험을 진행하고 있는 유기합성 전공자입니다. 최근에 PAGE 로 oligonucleotide 의 ligation 진행정도를 monitoring 하다가 이상한 현상을 발견했습니다.  사진에 보이는 첫번째 lane 2와 lane 7은 서로 다른 ladder 입니다. lane 2 는 bioneer 의 10 bp ladder이고 lane 7 은 Thermo 의 ultra low range ladder입니다. 근데 얘네들의 basepair 위치 차이가 상당합니다.  저는 기존에 Bioneer 제품을 쓰고 있었는데 보시는 것 처럼 윗 부분에  smearing 하는 현상이 있어서 이를 개선해보고자 thermo 제품을 구매하였습니다. 근데 bp 위치가 기존과 크게 차이가 나며 이를 바탕으로 해석했을 때 제 샘플들이 이론적인 길이보다 훨씬 길어보인다는 문제가 있습니다.  ladder에서 왜 이런 차이가 나는 걸까요?  홈페이지에는 둘다 Agarose gel 용이라고 되어 있는데 제가 page 에서 사용해서 그럴까요?  그렇다면 둘 중에 더 정확한 ladder는 무엇일까요? 이럴경우 standard oligo  샘플 (이미 길이를 정확히 알고 있는) 을 같이 run 해봐야 될까요? 잘 아시는 선생님들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.  
회원작성글 서박  |  06.24
Q. DNA 를 chloroform 으로 뽑는 방법에 pellet이 찌꺼기가 섞인건가 색이 있습니다.
저희 실험실에서 DNA 를 chlroform 으로 뽑는 방법은 다음과 같습니다.    DNA extraction buffer 700uL + 샘플링 넣은 2ml 튜브를 넣기( 구슬 2개+ sample)  Tissue Lyser 에 buffer 넣은 2ml 튜브를 넣어 갈기- 1분 30초 4. 갈아진 2ml tube 는 후드에서 β-Meracaptoethanol 13ul 와 PVP(polyvinylpyrro lidone) 작은 수저 1/2 정도 넣기   2ml tube는 Incubation에서 10분 70°C ,   centrifuge (원심분리) 로 13000rpm 10분 ,   이후 갈아진 2ml tube 600uL 상층액 + Chloroform 600uL (C tube에 넣기) 이후 13000rpm 10분   (C) 상층액 500uL + Isopropylalcohol 500uL   냉동실 30분이 지난 후 13000rpm 10분 원심분리 70%(실험용) 에탄올 700uL에서 2~3반복 washing           여기 까지 진행하는데 DNA pellet 색깔이 노란색, 주황색으로 보이며 찌꺼기가 남아있습니다. 찌꺼기가 안생기도록 최대한 주의하면서 상층액을 땄습니다.  사진은 washing 하기 전 입니다. 이토록 색이 나는데 이유가 무엇일까요?  실험 방법에 오류가 있거나 잘못된점이 있으면 알려주세요.                           
회원작성글 원작생실이  |  06.23
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