석사 한학기차 신입 대학원생입니다. 시퀀싱을 보내는데 Pcr product와 프라이머를 동봉하여 보냈습니다 Basic seq이었고 샘플 농도와 프라이머 또한 넉넉하게 보냈습니다 그런데 결과를 확인 했는데 평소 보던 결과와 달라 확인해 보니... 샘플 종류를 pcr product 가 아닌 plasmid로 선택 하여 주문을 했더군요.. 이럴 경우 시퀀싱을 다시 보내야 하는 거겠죠.. 처음엔 샘플 농도가 너무 낮아서 그런거라는 생각이 들었는데 다시 확인해보니 아니더군요.. Pcr product의 경우 결과 확인할때 snap gene 에서 보면 forward, reverse 시작점이 정해져 있는데 그게 아닌 결과가 나와서... Plasmid seq은 보내 본적도 없어서 어떻게 봐야 할지 모르겠습니다.. 혹시 이 경우 law 데이터에서 시작점 설정을 다시 하면 데이터를 볼수 있을까요.. 혹시 이런 경험이 있으신 분이 있는지..ㅠㅠ 다시 시퀀싱을 보내는 방법 밖에 없는지 어떻게 해야 하는지 모르겠습니다..ㅠㅠ

  안녕하세요. 분자쪽은 아무것도 모르지만 실험을 진행하게 된 예비 대학원생 입니다.!! 제가 DNA까지는 뽑았는데 PCR을 진행하려 여러 프로토콜을 찾아봤는데 궁금한게 있어서 질문합니다.  master mix 2x 가 있으면 프라이머(F,R), 주형DNA,뉴클리아제프리워터 만 있으면 되는거 맞나요?   만약 맞다면 마스터 믹스는 2X그대로 사용하는게 아닌 몇배 희석해서 사용해야하나요?  

gibson assembly cloning을 하기 위해서 vector를 iPCR을 수행중인데 아무리 primer binding site를 바꿔서 진행을 해도 계속해서 multiband가 뜹니다.. 게다가 target site의 band가 너무 연하게 떠요.. primer desgin할 때 2nd structure까지 다 고려하고 snapgene 등을 활용해서 multibinding site 생성 여부까지 확인후 진행했지만 사진과 같은 결과만 나옵니다ㅠㅠ (위의 밴드가 target 하려는 region과 size가 맞는 밴드입니다.) (하필 multiband로 뜬 아래에 위치한 band의 size가 iPCR로 잘라내려는 부위가 사이즈가 비슷한것도 마음에 걸리네요) 어떻게 해야 PCR이 성공할 수 있을까요.. 클로닝 선배님을 살려주세요..ㅠㅠ

bacteria DNA work를 하고 있습니다   Restriction 후 concentration이 낮아 vacuum centrifuge로 농축시키는데    농축전 gel에서는 밴드가 연하게보이고, 농축후에는 밴드가 보이지않는데   제가질문드리고 싶은것은   1. 이것은 centrifuge에 무슨문제가있는걸까요? 2. Restriction 후 concentration을 높일수 있는 방법은 무엇일까요?   입니다   답변부탁드리겠습니다   감사합니다

안녕하세요, 현재 cell line 제작 중에 있습니다. virus를 이용해 transduction 시키려고 하는데요, 저희 교수님은 transfection을 이용해 integration 시키지 왜 virus를 만드냐는 말씀을 자주 하셔서요. 1. transfection을 통해서도 integration이 되는지 2. 된다면 virus을 이용할 때와의 차이점은 효율 뿐인지 3. 효율 차이가 많은지 에 대해 질문 올립니다.

Temperature sensitive mutant에 대해서 방법 하나를 봤는데요  이게 제가 제대로 이해한것이 맞는지 확인부탁드립니다 ㅜㅜ 우선 ts mutation되어있는 어떤 유전자를 넣고 그 세포를 permissive temperature에서 키우면 control과 같이 자라지만  non-permissive temperature 예를 들어 39'c에서 키우면 죽어 있는 부분을 확인해서 그 cell들을 따와서 사용하는건가요...?    

안녕하세요 5'-6-FAM(fluorescein amidite)가 결합된 antisense oligonucleotides를 mouse injection하고 target organ을 whole mount dissection으로 slide 제작하고 target cell에 antisense oligonucleotides가 들어갔는지 confocal로 확인하는 실험을 하고있습니다 염색은 DAPI, Phalloidin(actin염색, alexa fluro 647)로하고 dapi, 647, fam 채널로 찍고있습니다 문제는 injection시행하지않은 control slide에서도 fam signal이 상당히 나와서 실험군의 signal이 신뢰할만한 것인지 의문이 듭니다 control slide의 형광이 보이지않을 정도의 confocal setting에서 실험군 촬영하는 것 외에 혹시 다른 방법이 있을지요? 아니면 FAM에대한 antibody를 써보신 분이 있으신지 궁금합니다. 감사합니다

pET21b를 실험실에서 사용하고 있는데요  pET21b를 DH5a에 transformation해서 mini prep을 하면 yield가 높게 나오는데 scale을 키워서 culture한 뒤 midi prep을 하면 아이에 없다 시피 농도가 나옵니다.  다른 사람이 해도 그래서 전 연구자 실험 노트를 봐도 midi prep을 진행해본 사람이 없더라구요    답답해서 질문 남깁니다.  pET21b vector는 원래 이런건지 알고 싶습니다. 다른분도 이러신가해서요 ..ㅜㅜ 

qrt-pcr 할때 Plate를 8개의 튜브가 한줄로 연결되어있는 튜브를 사용하였었는데 실험실에 이제 튜브를 거의 다 써가고 예전 선배님들이 쓰시던 plate가 많이 남아있어서 사용하려고 하는데 의문이 있습니다. 96well pcr plate로 모두 분주후에 sealing film을 붙이는데요. 원래 사용하던 튜브로 할때는 rt-pcr 돌리기전에 centrifuge로 spin down을 시켜주는데 96well plate는 어떻게 spin down을 시켜줘야하나요? 도와주세요ㅜㅜ 

 comp cell은 DH5a를 사용중이고,  vector는 lentiV2를 이용중입니다 제가  primer 20bp크기를 insert하려는데 콜로니가 안떠서 고수님들께 자문구합니다.   DH5a는 RBC에서 구매해서 사용중이라 문제는 없는것같습니다. BsmB1으로 자르고 gel extraction 후 밴드 잘린거 확인했습니다.   comp cell 20ul에 plasmid 1.7ul넣고 transformation은 ice 20 min 42도에서 heat 45 sec ice 20 min 뒤에, S.O.C 50ul 넣고 37도  shake incubator에 1시간 배양 후  lb+amp plate에 모두 spread합니다   콜로니가 아예뜨지 않는데 어떤 단계를 확인하거나 바꿔야 할까요 vector도 바꿔보고 glass beads로  non-heat 으로도 해보고, ligation 단계에서 ATP도 넣어봤는데 콜로니가 안뜨네요ㅠㅠ  도움 부탁드립니다.ㅠ  

한 논문에서 본 실험의 시약 조성비입니다   해당 논문에선 200nM Lba Cas12a, 1uM crRNA, NEBuffer 2.5 ul, 20U RRI, RPA product9(dsDNA) 2ul, 800 nM fluorophore quencher labeled ssDNA probe로 reaction volume은 25 ul 이라고 하였습니다.    실험 초보여서 이렇게 쓰여있어 어떻게 넣어야 할 지 의문입니다.   동일한 Lba Cas12a을 찾아보니 stock의 concentration이 1uM인데 그렇다면 Lba Cas12a를 5ul 넣어 200nM 을 넣으면 되는 것 인가요? total volume은 25 ul 이기에 1/5인 5ul를 넣어서요.    RRI의 양과 논문과 같은 Probe를 사용한다면 고정적인 수치일것이고  그렇다면 만약 다른 crRNA를 사용하고자 한다면 그 crRNA의 농도에 따라 reaction volume 도 달라지는 것 아닌가요?    사진은 논문 원문입니다.    감사합니다. 

안녕하세요, real-time pcr을 배우고있는 석사학부생입니다. 이번에 conventional pcr과 real-time pcr의 차이를 찾아보고 있는 도중 real-time pcr 과정에서 Ct값을 확인해서 증폭값을 확인할 수 있는데, 내가 원하는 target template만 증폭됐는지 알기는 전기영동을 하지 않는이상 어렵지 않나요..? 그런데 다른 선배님들은 전기영동을 따로 하지 않으시더라구요.. 아직 배우고있는 과정이라 궁금한게 많습니다. 도움 부탁드립니다.

안녕하세요.  실험 중 궁금한 점이 있어 질문올립니다. viralRNA를 qPCR로 검출하는 실험 중 plateau의 RFU값이 낮게 나오는데, 원인을 모르겠습니다.   실험 과정은 1) 백신에서 추출한 viral RNA를 onestep qRT-PCR로 검출시 그래프가 잘 그려졌습니다. 2) 문제는, 실제 바이러스와 백신에서 각각 추출한 viral RNA를 twostep qRT-PCR로 검출 시 바이러스에서 추출한 cDNA의 최종 RFU값이 낮게 그려집니다. 백신에서 추출한 cDNA의 경우 최종 RFU값이 이전처럼 높게 나오구요. ct값은 오히려 바이러스에서 추출한 샘플이 높게 나옵니다. - 2번 실험에서 qPCR은 qiagen의 quantitect onestep mix에서 RT만 빼고 사용했습니다. 혹시 이게 문제가 될 수 있을까요? 의견 부탁드리겠습니다!

안녕하세요. PCR primer를 디자인할때 어떻게 고르면 잘 고를 수 있을지 질문하고 싶어서 글 남깁니다.   제가 primer-blast를 여러 조건을 넣고 돌렸는데, 사진처럼 여러 프라이머가 나옵니다.   원래 여러 프라이머가 나오는건 알지만 문제는 프라이머끼리 겹치는 부분 때문에 어떤 것을 선택하면 좋을지 잘 모르겠다는겁니다...   혹시 기준 같은 것이 있을까요? 알려주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ

고등학생입니다. 신장성 요붕증의 원인인 AVPR2 유전자의 점돌연변이를 잘라내는 모의 실험을 계획했는데요.  10-23 DNAzyme을 이용해 제거하고 AVPR2 유전자의 점돌연변이 부분을 제거하여 제거가 잘 되었는지 확인하는 실험입니다. AVPR2 유전자 돌연변이로 280번째 아미노산이 치환되어 신장성 요붕증이 발생한 것이므로 ncbi에 들어가 정상인의 280번째 아미노산을 확인한 정상인과 신장성 요붕증 환자의 염기서열을 비교해 돌연변이 위치를 파악합니다. 그 후 이 돌연변이만의 10-23 DNAzyme를 설정하고 제대로 절단됐는지 확인하고자 AVPR2 유전자의 점돌연변이 mRNA 절단 여부를 판단합니다. 잘라낸 부분의 mRNA를 증폭시키기 위한 primer를 설정하고 전기영동의 각 Lane에 대조군인 AVPR2 유전자의 돌연변이 mRNA, AVPR2 유전자의 돌연변이로 인한 신장성 요붕증 환자의 DNA, 증류수를 넣는다고 가정했습니다. 실험군으로는 직접 설정한 DNAzyme을 이용해 돌연변이를 제거한 환자의 mRNA를 넣고 프라이머 등을 넣는다고 가정했으며 RT-PCR 후 전기영동을 통해 증폭 여부를 판단하여 가설의 성립 여부 확인으로 모의 실험이 종료됩니다. 이 모의 실험에서의 오류가 있을까요??

안녕하세요. 현재 zebrafish를 double knockout 해서 만들어져있고,  이때 RNA-seq결과로 나온 특정 유전자들에 대해서 cloming을 하려고 합니다.   그런데 이때 cloning을 하려면 cDNA를 어떤 것으로 사용해야 될까요?   두 유전자가 a, b라고 한다면 wild type   ,    a-/-    ,    b-/-    ,     a+/-,b+/-     ,    a-/-,b-/-  cDNA 나 knockout 한 model에 대해서 개념이 헷갈려서  어떤 것의 cDNA를 사용하여 target gene을 뽑아야 되는지 모르겠습니다 도움 부탁드립니다!