cas9 방법으로 cell에 형광이 발현되도록 GFP gene을 삽입하였습니다. transfection 후 나온 cell에서 gDNA를 뽑아서 일부분을 PCR로 확인하였는데  막상 현미경으로 보면 GFP가 발현이 잘 되지 않고 있습니다. 그래서 gDNA을 뽑은 것을 시퀀싱을 보내고 싶은데 전체 길이가 3kb정도 됩니다. PCR primer를 사용하지 않고 랜덤하게 Primer를 5~6개정도 짜서 전체 시퀀싱을 하고 싶은데 이게 맞는 방법인가요?    

CRISPR/Cas9 system으로 유전자 cloning 진행 중 입니다. target gene이 포함 된 vector는 제작이 완료된 상태고 다음 단계를 진행하려고 합니다.   delivery system을 lentivirus로 선정하여 진행하고자 하며, 가지고 있는 vector 정보는 아래와 같습니다. cloning vector : lentiCRISPR V2-GFP packaging, envelop vector : VSVG, psPAX2   알아보니 lentivirus production에 사용하는 reagent 정보를 알 수 있을까요? reagent 정보에 vector 별 비율이 나온다고 하는데 적절한 reagent를 선정하지 못하고 있습니다.   HEK293T cell에 진행하려고 하는데 혹시 lipofectamine과 lentivirus용 reagent가 효율 차이가 많이 나는지도 궁금합니다.   참고하신 protocol 정보가 있으시다면 혹시 공유 부탁드려도 될까요? 감사합니다.   atonaema@kangwon.ac.kr

제가 Lentiviral 벡터를 클로닝 중인데, 클로닝이 너무 안되어서 질문 드립니다. 실험실에 가지고 있는 pLenti-vector를 이용하여 클로닝 중인데요. insert로 넣을 단편은 PCR로 증폭이 잘 되지 않아, 업체에 의뢰해서 gene 합성을 하였습니다. (벡터에 포함된 상태로 수령)  합성되어온 insert는 제한효소로 잘라서 gel extraction하여 정제하였습니다. pLenti-vector 역시 동일한 제한효소로 잘라서 gel extraction 후 정제하였습니다.  정제 후 insert(950 bp), vector(7.5kb) 모두 전기영동하여 순도확인하였고, 클로닝 진행하였습니다. competent cell은 NEB stable을 사영하였고, transformation 후 콜로니가 30개 정도 떴습니다. 그 중 콜로니 19개를 따서 colony PCR을 수행하니 증폭되는 밴드가 약하기는 하지만, 모든 콜로니에서 타겟 사이즈에 밴드가 증폭되는 것을 확인하였습니다. 이때 까지만 해도 수월하게 진행될 줄 알았는데...ㅠㅠ 그 중 콜로니 4개를 따서 mini prep해서 제한효소로 잘라보니 타겟 사이즈로 잘리는 게 하나도 없습니다. 상대적으로 크기가 작아 잘리는 양이 적을 수도 있을 것 같아 양을 많이 잘라서 로딩해서 확인해 봐도 동일하네요. control에서는 잘리는 밴드가 확인이 되구요. mini prep한 plasmid로 PCR 해 보면 증폭되는 양이 적긴 하지만 타겟사이즈 밴드가 보이기는 합니다. 물론 다른 밴드도 같이 증폭되기는 하지만... 몇 번을 다시 클로닝을 해도 동일한 양상으로 나타나는데 이럴 경우 어떻게 해야 될까요? 거의 3달째 이러고 있으니까 답답하네요. 그냥 업체에 클로닝 서비스 맡길까 생각도 들구요. 이런 경우는 어떤 부분을 확인해 봐야 될까요?

궁금한 점이 있어 질문 드립니다. ^^ gel extraction 을 퀴아젠 키트(qiaex ii gel extraction kit)로 하려합니다. 프로토콜을 보니 스핀컬럼 사용이 없던데 gel extraction 할 때 스핀컬럼 사용하는거 아닌가요?  잘 모르겠어서 질문드립니다. 프로토콜 첨부 합니다.  

안녕하세요. PCR을 하기 위해서 primer를 제작하려고 합니다. 이 전에 프라이머를 디자인할 때는 해당 속의 서열이 있어서 그대로 활용했지만, 이번에 분석하려는 부분은 NCBI에 전혀 등록되어 있지 않아, 가장 가까운  종들을 alignment해서 프라이머를 디자인하려고 합니다.   여기서 궁금한 점은 서로 다른 14개 종들의 서열을 alignment하였고, 또 가장 가까운 서열을 기반으로 해서 14개 종들 중 공통적인 universal한 부분을 찾았습니다. 그 후, universal한 부분에 포워드 프라이머, 리버스 프라이머를 각각 디자인 해서 최종적으로 프라이머를 주문하면 된다는데, 방법을 모르겠습니다.   첨부한 파일에 노란색 박스로 표시한 부분이 universal한 부분이라고 생각해서 표시해두었습니다.  이 후, 각 universal한 부분에 프라이머를 짠다는 말이 이해가 되지 않습니다.총 2193bp에서 119개의 Universal 부분을 찾았는데, 그럼 각 구간마다 포워드 리버스 프라이머를 짠다는 말인건가요....?? 전문가분들, 도움 부탁드립니다!!!

안녕하세요.    많은 샘플에 대해 (n>200~400) whole exome sequencing을 하려고 합니다.  샘플이 많아서 정확성도 중요하지만 가격이 상당히 신경쓰입니다.  국내 업체 중 WES sequencing service의 가격을 알고 싶습니다.  몇 군데에 전화해 봤더니 가격을 알려면 여러 가지 정보를 드려야 하는데 아직 프로젝트 초기라 확답을 못 드렸더니 결국 상담이 안 되었습니다.  선배님들 경험 위주로 대략 가격만 말씀해 주시면 큰 도움이 되겠습니다.  감사합니다. 

clolony pcr을 할때 negative control은 그냥 배지를 키운거를 넣고 다른것과 똑같이 polymerase, dNTP등 넣고 Forward랑 Reverse primer 넣는거 맞나요? 저번 실험한거에는 NC에 밴드가 하나도 없는데 이번에는 밴드가 있어서요.. (전실험에 뭐넣고 pcr했는지 몰라서요..)

Comparison between indel frequencies at endogenous and integrated site 이해가 힘듭니다.. indel frequency는 어떤 것인지 이해가 가지만 endogenous site와 integrated stie의 차이를 잘 모르겠습니다.  

안녕하세요. 생명공학부 학부생입니다. 이번에 새로 pyroseqeucning 에 대해 배우게 되었는데, 찾아봐도 이해가 가지 않는 부분이 있어 질문 드립니다. 1. emPCR을 하기 이전에, 한개의 bead에 한개의 DNA fragment (adaptor 포함) 붙인다는데, 어떻게 딱 한개만 붙는건가요? 2. 1세대 Sanger sequencing 과는 달리, pyrosequencing은 ddNTP에 의해 terminating 되는 형식이 아니라 A, T, G, C 의 염기를 번갈아가며 한차례씩 넣고 신호를 측정하면서 sequencing을 하던데, 그럼 굳이 emPCR을 이용해 bead에 붙은 한 종류의 fragment 의 양을 늘릴 필요가 있나요? 한가닥 가지곤 신호의 세기가 약하기 때문인가요? 항상 답변해 주시는 분들 고맙습니다. 답변해주시면 감사하겠습니다.

프로토콜에는 50ul에 10pmoles/ul 농도 프라이머를 2ul 넣으라고 되어 있는데 그럼 총 20pmole이 들어가는 거잖아요? 1uM으로 희석되어 있는 프라이머를 쓰려고 하는데 그럼 총 20ul의 프라이머를 넣어야 하는 건가요? Pmole/ul과 uM은 단위가 같다고 해서 헷갈리네요ㅠㅠ

특정유전자 deletion하는 과정에서 제한효소를 사용할수있는게 제한적이라 sbf1대신 pst1을 사용합니다(sbf1은 사용불가하기에). 나중에 벡터 제한효소처리할때 사용하는 제한효소를 pst1을 사용하면 되는거지요?아니면 sbf1을사용해야하나요?

제목 그대로 NCBI에서 cds Fasta 서열을 모아서 얼라인먼트를 했는데, 몇 번을 계속 해봐도 공백이 3배수로 나오지 않는 부분이 있습니다.   1개, 2개, 4개, 5개 등등.... MEGA X, Bioedit 다 사용해서 clustal w, clustal muscle 해보는데도  공백이 이상합니다. 모든 서열 시작은 ATG로 시작하는데, 어떻게 해야 할 지 모르겠습니다.....

현재 같은 클로닝만 4개월 중입니다. Ligation을 처음으로 2개월동안 하고 너무 실패만 해서 성공할수밖에 없을꺼라고 하던 gibson을 구매를해서 하고 있는 중입니다... 하지만 2개월동안 콜로니를 본적이 없습니다.. 방법을 이렇습니다. 1. Vector 와 insert를 gel elution 하여 사용합니다. 2. 1:3 / 1:4 / 1:6 / 1:9 를 pmol 단위로 농도 계산하여 넣습니다.. 3. Gibson 2x marster mix (neb) 제품 5ul 넣어서 총 10ul 만들고 50도에서 1시간 incubation 시킵니다. 4. Dh5alpha 컴셀 50ul에 dna 3ul 넣고 30분 ice에 두고 1분 42도 heatshock 시키고 lb 넣어서 1시간 동안 배양시킨뒤 배지에 pallet 잡아서 spreading 합니다.. 도대체 어디가 문제인걸까요,,

RNA에서 RT를 통해 합성한 cDNA의 amplification을 진행중인데요, 아래와 같은 궁금한 점들이 있어 질문 올립니다.   1. cDNA를 합성한 후, PCR을 통한 amplification을 진행할 때 꼭 Taq origin polymerase를 사용해야하는 이유가 있나요? 현재 NEB사의 Q5 polymerase를 사용하고 있는데, 여러 방면으로 해봐도 충분한 양의 amplicon이 확인되지 않아서요, 그치만 taq polymerase를 사용했을 때는 proofreading이 되지 않는 점 때문에 사용이 망설여집니다. Proofreading이 가능한 taq origin polymerase가 있는 것은 알고 있으나 현재 실험실에 구비되어 있지 않아 되도록 갖고 있는 제품 내에서 실험을 진행하고 싶어서요.   2. cDNA 농도 확인이 별도로 필요한가요? cDNA 합성 후에 nanodrop 등을 통해서 sample의 농도를 확인해야 하나요? 대부분의 protocol을 보면 별도의 정량 없이 amplification을 진행하는 것으로 보이는데, 해당 과정을 통해 농도를 확인하고 실험을 진행하는 것이 amplicon을 생성하는 과정에서 더 수월한 점이 있는 지 궁금합니다.

유전자 표기법에 대해서 배웠는데 궁금한 점이 있어 질문드립니다. Leu2를 selection marker로 사용해서 형질전환을 했는데 그럼 형질전환 후 유전자 표기법에는 wild-type으로 써야 하나요, mutant-type으로 써야 하나요? 형질전환되서 없었던 유전자가 생긴건데 이게 mutant인가요? mutant가 어디까지를 말하는건지 모르겠습니다...

휴대폰 및 필기구에 있는 (주변에서 흔히 볼 수 있는)균주를 배양하여 어떤 구균 혹은 바실러스인지 찾아보고 천연 항생물질로 세균 증식을 막을 수 있을지에 대한 실험인데 님들이 보기엔 어때요..? 참고로 고등학교 2학년입니다