mixed cellulose ester membrane filter (MCE) 여과지 필터에 아세톤을 멸균여과해도 될까요? 현재 PTFE는 없고 MCE와 CA가 있는데,, 이 중에 뭘 사용하는게 좋을까요??  

cas9 방법으로 cell에 형광이 발현되도록 GFP gene을 삽입하였습니다. transfection 후 나온 cell에서 gDNA를 뽑아서 일부분을 PCR로 확인하였는데  막상 현미경으로 보면 GFP가 발현이 잘 되지 않고 있습니다. 그래서 gDNA을 뽑은 것을 시퀀싱을 보내고 싶은데 전체 길이가 3kb정도 됩니다. PCR primer를 사용하지 않고 랜덤하게 Primer를 5~6개정도 짜서 전체 시퀀싱을 하고 싶은데 이게 맞는 방법인가요?    

CRISPR/Cas9 system으로 유전자 cloning 진행 중 입니다. target gene이 포함 된 vector는 제작이 완료된 상태고 다음 단계를 진행하려고 합니다.   delivery system을 lentivirus로 선정하여 진행하고자 하며, 가지고 있는 vector 정보는 아래와 같습니다. cloning vector : lentiCRISPR V2-GFP packaging, envelop vector : VSVG, psPAX2   알아보니 lentivirus production에 사용하는 reagent 정보를 알 수 있을까요? reagent 정보에 vector 별 비율이 나온다고 하는데 적절한 reagent를 선정하지 못하고 있습니다.   HEK293T cell에 진행하려고 하는데 혹시 lipofectamine과 lentivirus용 reagent가 효율 차이가 많이 나는지도 궁금합니다.   참고하신 protocol 정보가 있으시다면 혹시 공유 부탁드려도 될까요? 감사합니다.   atonaema@kangwon.ac.kr

제가 Lentiviral 벡터를 클로닝 중인데, 클로닝이 너무 안되어서 질문 드립니다. 실험실에 가지고 있는 pLenti-vector를 이용하여 클로닝 중인데요. insert로 넣을 단편은 PCR로 증폭이 잘 되지 않아, 업체에 의뢰해서 gene 합성을 하였습니다. (벡터에 포함된 상태로 수령)  합성되어온 insert는 제한효소로 잘라서 gel extraction하여 정제하였습니다. pLenti-vector 역시 동일한 제한효소로 잘라서 gel extraction 후 정제하였습니다.  정제 후 insert(950 bp), vector(7.5kb) 모두 전기영동하여 순도확인하였고, 클로닝 진행하였습니다. competent cell은 NEB stable을 사영하였고, transformation 후 콜로니가 30개 정도 떴습니다. 그 중 콜로니 19개를 따서 colony PCR을 수행하니 증폭되는 밴드가 약하기는 하지만, 모든 콜로니에서 타겟 사이즈에 밴드가 증폭되는 것을 확인하였습니다. 이때 까지만 해도 수월하게 진행될 줄 알았는데...ㅠㅠ 그 중 콜로니 4개를 따서 mini prep해서 제한효소로 잘라보니 타겟 사이즈로 잘리는 게 하나도 없습니다. 상대적으로 크기가 작아 잘리는 양이 적을 수도 있을 것 같아 양을 많이 잘라서 로딩해서 확인해 봐도 동일하네요. control에서는 잘리는 밴드가 확인이 되구요. mini prep한 plasmid로 PCR 해 보면 증폭되는 양이 적긴 하지만 타겟사이즈 밴드가 보이기는 합니다. 물론 다른 밴드도 같이 증폭되기는 하지만... 몇 번을 다시 클로닝을 해도 동일한 양상으로 나타나는데 이럴 경우 어떻게 해야 될까요? 거의 3달째 이러고 있으니까 답답하네요. 그냥 업체에 클로닝 서비스 맡길까 생각도 들구요. 이런 경우는 어떤 부분을 확인해 봐야 될까요?

안녕하세요 이제 막 2달된 대학원생입니다... 저희 실험실은 cancer cell 을 주로 다루는데 이때까지 아무도 해보시지 않으신 SH-SY5Y cell 을 제가 처음으로 맡아서 하게 되었습니다.. 그래서 더더욱 공부도 더 해보고 하고있는데요.. 세포주은행에서 p.26 을 받아서 subculture 해 왔었는데 bacteria contamination이 되어서 stock 도 다 버리게 되었습니다..ㅠㅠ  심지어 같은 인큐베이터를 쓰시는 다른분의 cell 마저도 오염 되어서 죄책감이 진짜 이만저만이 아닙니다....하.... 저희 실험실에서 아무도 한번도 이런적이 없다고 하는데 왜 저만 이렇게 자꾸 세포가 오염이 되는걸까요 ㅠㅠㅠ 진짜 너무 스트레스 받네요.... 이번에 세포주은행에서 p.19 로 다시 한번 세포를 분양받았습니다.. 진짜 이번마저도 그렇게 되면 대학원 생활 어떻게 해야할지 모르겠습니다 ㅜㅜ Media, trypsin, DPBS, cell freezer 등등 필요한 것들은 다 버리고 새로 만들어서 다시 한번 해보려고 합니다... 다른분들과 하는 방법도 다 똑같은 것 같은데 대체 무엇이 문제일까요....실험 진행도 안되고 다른분한테 피해까지 끼치고 진짜 멘탈이 나가버릴것같네요... 어떻게 하면 cell contamination 을 줄이면서 심기일전 할 수 있을지.. SH-SY5Y cell 은 어떻게 cell culture 를 하면 좋을지 제가 다시 심기일전 할 수 있게 도와주세요.... 항생제 농도를 더 높여야 할지 어떨지 ㅜㅜ 여러가지 방법 등등이요!!도와주세요!!! Media 는 DMEM (low glucose) + F12 + 10% FBS + 1% P/S(항생제) + 1% non-essential amino acid 를 사용하고 있습니다. 참고로 media contamination 은 인큐베이터에 넣어보고 확인했을 시 문제는 없었습니다...

세포 동결보존을 할 때 세포 수를 정해놓고 보관을 하는데 그 이유가 궁금합니다

Paraffin block 제작 중에 문제가 생겨 글 올립니다. 파라핀 블럭 제작후에 시간이 지나면 저렇게 하얗게 ? 변하는데 저렇게 변하는 이유가 무엇인지 알수있을까요? 또한 저렇게 되면 결과에 문제가 생기나요? 조직병리 고수님들 도와주세요,,ㅠㅠ

실험을 하던 중 문득 궁금증이 생겨 질문드립니다. PBS와 DMSO를 1:1비율로 섞었을 경우 층분리가 일어나나요?

안녕하세요.   보통 1주 정도 주는 순화기간에 45%나 60% 고지방 식이사료를 주었을 때, 문제점 같은 것들이 있나요?

MSC adipogenesis 실험하는데 oil red o staining 실험을 하게 되었는데 회사에선 해본적 없는 실험이고 관련 자료가 없어 실험방법을 찾아보았는데 이게 맞는 방법인지 확인해주시면 감사하겠습니다!   1. 4% formaldehyde 1ml 넣어주고 10분간 RT 2. PBS로 2번 washing 3. ORO 1ml 넣고 15분간 RT 4. 증류수로 한번 washing 해서 제거하고 증류수 1ml 넣고 관찰.   뭘 더 추가해야하거나 해야할 게 있을까요..?   ORO solution이어서 녹일 필요는 없어보입니다. 시그마 사의 O1391-250ml 을 쓸겁니다!

Agarose 도 바꿔보고 TBE도 새걸로 바꿔보고 워싱도 잘해봤는데 하얀 잡 먼지같은 것들이 젤에서 안없어집니다 대체 정체가 뭘까요? ㅠㅠ 깔끔하게 하려면 어떡해야하나요? 애초부터 TBE에 떠다니는 애들인 것 같기도 하구요

cas9 방법으로 cell에 형광이 발현되도록 GFP gene을 삽입하였습니다. transfection 후 나온 cell에서 gDNA를 뽑아서 일부분을 PCR로 확인하였는데  막상 현미경으로 보면 GFP가 발현이 잘 되지 않고 있습니다. 그래서 gDNA을 뽑은 것을 시퀀싱을 보내고 싶은데 전체 길이가 3kb정도 됩니다. PCR primer를 사용하지 않고 랜덤하게 Primer를 5~6개정도 짜서 전체 시퀀싱을 하고 싶은데 이게 맞는 방법인가요?    

학교에서 LB agar 평판배지를 만들고, 손과 스마트폰에 있는 세균을 면봉으로 채취한 후, 면봉을 수돗물에 담궈두었다가 그 물을 백금이로 streaking하는 방법으로 실험을 진행했습니다. 하루동안 배양하고 꺼내 보았는데 streaking한 모양대로 균이 자라지 않고 밑에 사진 처럼 한 군데 몰려 있었습니다. 그런데 저 균이 몰려있는 위치가 1차 도말한 곳도 아니고 아예 엉뚱한 곳이라서 외부의 세균이 유입되어서 그것만 자란 것 같습니다. ㅠㅠ 나와있는 방법대로 차근차근 따라갔는데 도대체 왜 실험이 실패한건지 모르겠습니다. 어떻게 해야 성공시킬 수 있을까요.. 뭐가 문제 였던 건지 한 번만 도와주시면 감사하겠습니다.

세포 동결보존을 할 때 세포 수를 정해놓고 보관을 하는데 그 이유가 궁금합니다

안녕하세요 이제 막 2달된 대학원생입니다... 저희 실험실은 cancer cell 을 주로 다루는데 이때까지 아무도 해보시지 않으신 SH-SY5Y cell 을 제가 처음으로 맡아서 하게 되었습니다.. 그래서 더더욱 공부도 더 해보고 하고있는데요.. 세포주은행에서 p.26 을 받아서 subculture 해 왔었는데 bacteria contamination이 되어서 stock 도 다 버리게 되었습니다..ㅠㅠ  심지어 같은 인큐베이터를 쓰시는 다른분의 cell 마저도 오염 되어서 죄책감이 진짜 이만저만이 아닙니다....하.... 저희 실험실에서 아무도 한번도 이런적이 없다고 하는데 왜 저만 이렇게 자꾸 세포가 오염이 되는걸까요 ㅠㅠㅠ 진짜 너무 스트레스 받네요.... 이번에 세포주은행에서 p.19 로 다시 한번 세포를 분양받았습니다.. 진짜 이번마저도 그렇게 되면 대학원 생활 어떻게 해야할지 모르겠습니다 ㅜㅜ Media, trypsin, DPBS, cell freezer 등등 필요한 것들은 다 버리고 새로 만들어서 다시 한번 해보려고 합니다... 다른분들과 하는 방법도 다 똑같은 것 같은데 대체 무엇이 문제일까요....실험 진행도 안되고 다른분한테 피해까지 끼치고 진짜 멘탈이 나가버릴것같네요... 어떻게 하면 cell contamination 을 줄이면서 심기일전 할 수 있을지.. SH-SY5Y cell 은 어떻게 cell culture 를 하면 좋을지 제가 다시 심기일전 할 수 있게 도와주세요.... 항생제 농도를 더 높여야 할지 어떨지 ㅜㅜ 여러가지 방법 등등이요!!도와주세요!!! Media 는 DMEM (low glucose) + F12 + 10% FBS + 1% P/S(항생제) + 1% non-essential amino acid 를 사용하고 있습니다. 참고로 media contamination 은 인큐베이터에 넣어보고 확인했을 시 문제는 없었습니다...

mixed cellulose ester membrane filter (MCE) 여과지 필터에 아세톤을 멸균여과해도 될까요? 현재 PTFE는 없고 MCE와 CA가 있는데,, 이 중에 뭘 사용하는게 좋을까요??  

제가 Lentiviral 벡터를 클로닝 중인데, 클로닝이 너무 안되어서 질문 드립니다. 실험실에 가지고 있는 pLenti-vector를 이용하여 클로닝 중인데요. insert로 넣을 단편은 PCR로 증폭이 잘 되지 않아, 업체에 의뢰해서 gene 합성을 하였습니다. (벡터에 포함된 상태로 수령)  합성되어온 insert는 제한효소로 잘라서 gel extraction하여 정제하였습니다. pLenti-vector 역시 동일한 제한효소로 잘라서 gel extraction 후 정제하였습니다.  정제 후 insert(950 bp), vector(7.5kb) 모두 전기영동하여 순도확인하였고, 클로닝 진행하였습니다. competent cell은 NEB stable을 사영하였고, transformation 후 콜로니가 30개 정도 떴습니다. 그 중 콜로니 19개를 따서 colony PCR을 수행하니 증폭되는 밴드가 약하기는 하지만, 모든 콜로니에서 타겟 사이즈에 밴드가 증폭되는 것을 확인하였습니다. 이때 까지만 해도 수월하게 진행될 줄 알았는데...ㅠㅠ 그 중 콜로니 4개를 따서 mini prep해서 제한효소로 잘라보니 타겟 사이즈로 잘리는 게 하나도 없습니다. 상대적으로 크기가 작아 잘리는 양이 적을 수도 있을 것 같아 양을 많이 잘라서 로딩해서 확인해 봐도 동일하네요. control에서는 잘리는 밴드가 확인이 되구요. mini prep한 plasmid로 PCR 해 보면 증폭되는 양이 적긴 하지만 타겟사이즈 밴드가 보이기는 합니다. 물론 다른 밴드도 같이 증폭되기는 하지만... 몇 번을 다시 클로닝을 해도 동일한 양상으로 나타나는데 이럴 경우 어떻게 해야 될까요? 거의 3달째 이러고 있으니까 답답하네요. 그냥 업체에 클로닝 서비스 맡길까 생각도 들구요. 이런 경우는 어떤 부분을 확인해 봐야 될까요?

약물방출과 관련한 HPLC 측정을 위해 sample을 준비했습니다. 해당 약물의 solubility가 MeOH나 EtOH, DMSO 등에는 존재하지만 water에 insoluble하다고 나와있습니다. 그래서 DMSO에 우선적으로 녹인 후 PBS에 2차 희석을 진행했는데요.. 측정시 자꾸 drug이 뭉치는 건지 흔들림이 매우 크게 잡힙니다. 용매를 아예 바꾸자고 하니 제형에서 liposome을 이용하다보니 구조 자체가 파괴되고, 생체에 적용시킬 예정이다보니 toxity도 있어 쉽게 바꿀 수도 없습니다. 심지어 한 약물은 EtOH에서 시간에 따라 파괴되는 것이 확인되기도 했습니다. 이런 경우 어떤 방법을 사용하시나요?

안녕하세요.   보통 1주 정도 주는 순화기간에 45%나 60% 고지방 식이사료를 주었을 때, 문제점 같은 것들이 있나요?

80% 아세톤을 만들때 99.9% 아세톤에 증류수를 혼합하면 될까요??