신뢰가 가는 연구를 위해서는 재현성이 중요합니다. 특히, 바이러스를 이용한 실험에서 Lentivirus Packaging 과정의 성공 여부와, 복사 수(copy number) 조절을 통한 유전자 발현량을 조절하기 위해서 바이러스 적정(Titrating)이 꼭 필요합니다. 바이러스 적정에는 형광 마커 유전자, 항생제 저항 유전자 혹은 세포의 염색을 검출하는 방법 등이 있습니다. 방법에 따라 다르지만 적정을 하는데 대략 2~10일 정도 걸립니다. 따라서 빠르게 적정하는 방법의 필요성이 높아지고 있습니다. 이번 연재에서는 정확하고, 빠르고, 간단한 lentiviral stock을 이용하는 Lenti-X-qRT-PCR Titration 방법에 대해 소개하겠습니다. 적정 키트를 이용해서 신속히 RNA 정제를 한 다음, qRT-PCR과 SYBR 기술을 이용하여 바이러스 RNA 유전체 함량을 측정합니다 [노트 1]. 이 키트를 사용하면 바이러스 정제와 타깃 세포 감염 사이의 시간을 줄여, 같은 날 두 가지 작업(바이러스 정제와 타깃 세포 감염)을 모두 수행할 수 있습니다. 또한, 바이러스 감염성을 감소시키는 시간의 지연과 동결 주기(freeze-thaw cycles)를 피할 수 있습니다. 그리고, 보다 일관된 결과를 위해 MOI (Multiplicity of infection)로 타깃 세포를 감염시킬 수 있습니다. 결과적으로 재현성 높은 실험 결과를 얻을 수 있습니다.  

그림 1. 재현성=엄격성+투명성 [출처 1].

전체적인 실험을 간단히 줄여서 설명하면, 바이러스를 만드는 세포에서 원심 분리를 통해 세포와 잔해를 제거한 다음, 바이러스 슈퍼넌트(supernatant)를 모읍니다 [노트 2]. 소량의 슈퍼넌트를 이용하여, 바이러스 RNA 정제 키트로 지놈믹 바이러스 RNA를 정제합니다 [노트 3]. 바이러스 RNA 샘플을 연속 희석하여 qRT-PCR을 통해 각 희석에 대한 임계값 사이클(threshold cylce, Ct)  값을 결정합니다. 샘플 희석을 통해 RNA 복사 수는 Lenti-X RNA 컨트롤 템플레이트(5x10^8 copies/μl)의 연속 희석으로부터 만든 표준 곡선에서 Ct 값에 해당하는 복사 수를 찾아 결정합니다. 또한, 독립적인 방법으로 IFU (infectious Unit) 값을 결정할 수도 있습니다(IFU/ml). 독립적으로 구한 IFU 값은 준비한 바이러스 슈퍼넌트의 qRT-PCR 적정 값(copy/ml)을 기준으로 슈퍼넌트에 대한 상대적  IFU 값을 결정하고, 감염 실험을 위한 MOI를 결정할 수 있습니다. 

그림 2. Lenti-X qRT-PCR titration kit을 사용한 lentivirus supernatants titrating 절차 [출처 2].

실험방법

1. 1. 세포에서 lentiviral 슈퍼넌트를 따서, 원심분리기에서 2000 rpm에서 5분간 돌립니다. 
2. 2. Nucleos Spin RNA Virus Kit를 사용하여 150 μl의 슈퍼넌트에서 RNA를 정제합니다 [노트 4].
3. 3. RNase-free 물을 사용해서 RNA를 녹여서 분리한 다음, DNase I를 처리합니다. 
4. 4. qRT-PCR을 위해서 충분한 양의 master 믹스를 준비합니다 [노트 5]. 
5. 5. Lenti-X RNA 컨트롤 템플레이트의 표준 곡선 (standard curve)을 만들고, 정제된 바이러스 RNA  샘플을 연속적으로 희석 [노트 6]하고, EASY Dilution Buffer를 넣습니다. 
6. 6. qPCR를 위해 웰에 23 μl의 MRM (Master Reaction Mix)을 넣습니다.
7. 7. 각 샘플의 2 μl를 23 μl의 웰에다 넣습니다. 
8. 8. qPCR를 실시합니다.

노트 

1. 1. 적정 (titration)은 4시간 정도 걸립니다.
2. 2. 바이러스 RNA 분리를 위한 샘플로서 슈퍼넌트를 사용합니다.
3. 3. qPCR는 미량의 오염 DNA와 RNA도 증폭하여, Ct 및 복사 수 값에 영향을 미칠 수 있기 때문에 정제한 RNA는 DNase I를 처리하여 잔류 플라스미드 DNA를 제거합니다. 이를 통해, lentivirus 생산 시 transfection 한 plasmid DNA의 잔여물의 영향 없이 정확하게 정량할 수 있습니다.
4. 4. 필요한 경우 더 작은 볼륨(5~100 μl)도 사용할 수 있습니다.
5. 5. 실험에 필요한 최소량 보다 약 10% 더 준비합니다.
6. 6. 희석을 할 때 3 μl의 원액 샘플을 27 μl의 버퍼에 넣고, 다음 10배 샘플 희석은 27 μl 버퍼에 이전 희석의 3 μl를 넣습니다.

출처

1. [1] https://research.uh.edu/the-big-idea/university-research-explained/reproducibility-rigor-and-rigmarole/
2. [2] https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/Lenti/Lenti-X%20qRT-PCR%20Titration%20Kit%20User%20Manual%20%28PT4006-1%29_050819.pdf