단백질-DNA 결합

DNA는 방사선이나 화학물질, 혹은 복제 과정에서의 오류로 인해 손상됩니다. 이때 단백질들이 손상 부위를 즉각적으로 인식하고 결합하여 복구 시스템을 가동합니다. 그리고, 어떤 유전병이나 암은 단백질의 구조가 변해 DNA에 제대로 붙지 못하거나, 혹은 너무 강하게 붙어서 발생합니다. 또한, 단백질의 변이나 약물 처리가 DNA-단백질의 인식 및 결합 능력을 떨어뜨려 암과 같은 질병을 유발하는지 확인할 수 있습니다.

분자 생물학 연구에서 단백질-DNA의 결합을 확인하는 실험 방법들

단백질은 음전하를 띠는 DNA 전하의 끌림으로 결합할 수 있고, 또한 단백질의 입체 구조가 DNA의 특정 염기 서열과 맞물려서 결합할 수 있습니다.

1. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay, gel shift)
단백질과 DNA의 결합 여부를 확인합니다. 단백질과 결합한 DNA는 전기영동 시 느리게 이동합니다. 실험 방법이 간단하고, 확실하지만 in vitro 환경이라 생체 상황과는 다를 수 있고, 방사성 동위원소를 사용합니다.

2. ChIP (Chromatic Immunoprecipitation)
항체(Antibody)를 이용해 특정 단백질과 결합된 실제 세포 내 결합 부위를 확인합니다. 살아 있는 세포 내 실제 결합 부위를 알 수 있지만, 실험 과정이 복잡하고 숙련된 기술이 필요합니다.

3. DNA Footprinting
단백질이 붙은 부위는 효소에 의해 잘리지 않아, 정확한 결합 사이트를 알 수 있습니다. DNA의 어느 염기서열이 붙는지 염기 단위로 정밀 분석이 가능하지만, 방사성 동위원소를 사용하는 경우가 많습니다.

4. Luciferase Assay
단백질이 DNA에 붙어 유전자를 발현시키면 활성(형광)을 측정합니다. 결합이 실제로 유전자 기능을 조절하는지 확인이 가능합니다.

5. 스트렙타비딘(Streptavidin)-아가로즈(agarose) Pulldown Assay
비오틴(Biotin)과 스트렙타비딘(Streptavidin) 사이의 결합력을 이용합니다. 비오틴으로 표지한 DNA를 미끼로 결합하는 여러 단백질을 웨스턴 블랏(Western blot)을 이용해서 정량적으로 분석할 수 있지만, 비특이적 결합이 생길 수 있습니다.

이번 연재에서는 스트렙타비딘-아가로즈 Pulldown Assay에 대해서 소개하겠습니다. 먼저 타깃 DNA 염기서열을 비오틴으로 표지 합니다. 비오틴은 스트렙타비딘에 강하게 붙습니다. 스트렙타비딘에 DNA를 붙이고, 거기에 단백질 lysate을 넣습니다. 단백질과 DNA가 결합할 수 있게 조건을 맞춰줍니다. 워싱(Washing)을 통해서 DNA에 붙지 않은 단백질을 제거합니다. DNA에 붙은 단백질을 elution 하고 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏으로 단백질과 DNA가 결합했는지 확인합니다.

스트렙타비딘-아가로즈 Pulldown Assay

1. DNA 탐침 (Probe) 준비
5' 말단에 비오틴이 붙은 50 bp 정방향(Sense) 프라이머와 비오틴이 없는 역방향(Antisense) 프라이머를 같은 양으로 섞습니다(노트 1). 100°C 수조에서 1시간 가열 후, 상온에서 45분간 서서히 식혀 5′-비오틴화된 이중가닥 DNA(5′-biotinylated dsDNA)를 준비합니다.

2. 단백질 추출(Protein Lysate Preparation)
세포를 스크래퍼로 모아 원심분리합니다. 펠렛(pellet) 부피의 7배에 해당하는 차가운 KETN lysis 버퍼(buffer) (100 mM KCl 포함, 노트 2)을 넣고, 얼음 위에서 20분간 반응시켜 단백질을 추출합니다. 단백질 추출 후 같은 양의 ET 버퍼를 넣어 최종 KCl 농도를 50 mM(단백질-DNA 결합의 최적 이온 강도)로 맞춥니다.

3. 결합 및 침강(Binding & Pulldown)
희석된 단백질 추출물(약 400 µg), 준비된 이중가닥 DNA(4 µg), 그리고 스트렙타비딘-아가로즈 비즈(Agarose beads, 20 µl)를 섞은 다음, 4°C에서 회전 혼합기(Rotator)를 이용해 2시간 동안 반응시킵니다(노트 3). 네거티브 컨트롤(negative control)로 희석된 단백질 추출물과 스트렙타비딘 아가로즈 비즈만을 섞은 다음, 같은 방법으로 반응시킵니다(노트 4).

4. 세척, 회수, 그리고 분석(Wash & Elution & Analysis)
2시간 후, 6K rpm에서 1분간 회전(노트 5) 시킨 후 상층액(결합하지 않은 단백질)을 제거합니다. KET 버퍼로 아가로즈 비즈를 3회 반복 세척하여 비특이적 결합 단백질을 제거합니다(노트 6). 끝으로, 비즈에 1X 로딩(loading) 샘플 버퍼를 넣고 100°C에서 5분간 가열하여 DNA에 결합했던 타깃 단백질을 분리합니다(노트 7). 웨스턴 블랏으로 타깃 단백질의 양을 확인합니다. 전체 단백질 (Input), Flow Through (결합 안 된 단백질), 그리고 비오틴-DNA를 넣지 않은 샘플 (단백질 추출물과 아가로즈 비즈만 포함) (노트 4)과 비교해서 타깃 단백질과 DNA 결합을 평가합니다.

실험이 실패 시 대안: Flag-HA 시스템을 이용한 타깃 단백질-DNA 상호작용 분석

전체 세포 추출물 상태에서 단백질과 DNA 결합이 명확히 확인되지 않는다면, 타깃 단백질을 먼저 정제하여 반응시키는 방법이 있습니다. 타깃 단백질에 Flag-HA 태그를 한 다음, M2 비즈(anti-Flag 항체)를 이용해 타깃 단백질의 순도를 높입니다. 그런 다음, Flag peptide가 포함된 elution 버퍼를 사용하여 M2비즈에 붙은 타깃 단백질을 분리해 냅니다. 이렇게 정제된 타깃 단백질을 위에서 설명한 비오틴이 표지 된 DNA와 함께 스트렙타비딘 비즈에 넣고 4°C에서 2시간 동안 반응시킵니다. KET 버퍼를 사용하여 결합하지 않은 단백질을 3회 워싱하고 Glycine(pH 2.5)를 사용하여 비즈에서 최종 결합된 타깃 단백질을 elution 합니다.

노트

1. DNA 길이는 일반적으로 50-200 bp 정도로 합니다. 너무 짧으면 결합이 약하고, 너무 길면 구조적 변형이 발생합니다.
2. KETN(100mM KCl, Tris, EDTA, NP40, pH8), ET(Tris and EDTA, pH 8), KET(Tris and EDTA with 50mM KCl). 단백질 분해를 막기 위해 버퍼에 저해제(Inhibitors)를 넣습니다.
3. 반응 시간은 1-4시간 혹은 overnight를 4°C에서 합니다. 너무 짧으면 결합이 약하고, 너무 길면 비특이적 결합이 증가합니다.
4. 네거티브 컨트롤로 아가로즈 비즈와 단백질의 비특이적 결합을 확인할 수 있습니다.
5. 원심분리 속도를 저속으로 해야 합니다. 속도가 너무 빠르면 타깃 단백질이 물리적 힘에 의해 떨어져 나갈 수 있습니다.
6. 아가로즈 비즈를 대신해서 Dyna 비즈를 사용할 수 있습니다. Dyna 비즈는 자성을 띠고 있어 외부 자석을 이용해 분리할 수 있습니다. 가격은 Dyna 비즈가 더 비쌉니다.
7. 가열하지 않고 Glycine(pH 2.5)을 이용하여 단백질을 분리할 수 있습니다. Glycine(pH 2.5)를 이용하는 것이 백그라운드가 상대적으로 낮습니다.