유전자 전달 실험의 핵심: Transfection

유전자 기능이나 단백질 발현을 분석하기 위해서는 플라스미드 DNA 혹은 siRNA (small interfering RNA, [노트 1])를 세포 안으로 넣어야 합니다. 이 과정을 transfection이라고 합니다. 

이번 연재에서는 화학적 방법으로 transfection을 할 때 가장 많이 쓰이는 대표적인 시약, Lipofectamine과 PEI (Polyethylenimine)를 비교해 보겠습니다. 실험에는 HEK293 (Human Embryonic Kidney cells) 세포를 사용했습니다. 세포주마다 반응이 다르기 때문에, 실험 전 소규모로 여러 조건을 비교해 최적의 조건을 찾는 과정이 꼭 필요합니다.

Lipofectamine

Lipofectamine은 “Lipid (지질)” + “transfection” + “Amine”의 합성어입니다. 즉, 지질 기반 아민성 화합물로 유전자 전달을 돕는 시약입니다.
양전하 (+)를 띠는 “Lipofectamine 2000”이 음전하 (-)를 띠는 DNA를 감싸 복합체를 형성하고, 이 복합체가 세포막과 융합되어 세포 안으로 들어가 핵 (nucleus)까지 이동합니다.
“Lipofectamine 2000”의 장점은 높은 전달 효율이지만, 단점은 가격이 비싸다는 점입니다. 이후에 출시된 “Lipofectamine 3000”은 더 높은 효율과 낮은 독성을 보여줍니다.
“Lipofectamine 2000”는 750 µl에 $545.65입니다 [출처 1]. 

실험 과정 [그림 1]

Day 1. 
HEK293 셀을 6-well plate에 1:3.5 비율로 희석합니다 [노트 2]. 

Day 2. 
1 µg DNA에 2 µl “Lipofectamine 2000” 비율 [1:2 ratio]
A. 100 µl Opti-MEM에 4 µl “Lipofectamine 2000”을 넣고 실온에서 5분 기다립니다.
B. 100 µl Opti-MEM에 2 µg DNA를 넣습니다.

• 희석한 DNA (B)를 희석한 “Lipofectamine 2000” (A)에 넣고, 실온에서 5분 기다립니다. 
• 5분 기다리는 동안 6-well plate의 배지를 제거하고, 항생제 없는 새로운 배지 1 ml를 넣습니다. 
• 5분 후,  혼합물 (B+A)을 한 방울씩 떨어뜨리면서 6-well plate를 앞뒤로 천천히 흔듭니다. 
• 4-6시간 후, 배지를 제거하고 항생제가 있는 새로운 배지로 교체합니다. 

이후 37°C에서 1-3일 배양합니다. 

그림 1. “Lipofectamine 2000”을 이용한 transfection [본인]

Polyethylenimine (PEI)

PEI는 다수의 아민기(+)를 가진 고분자 물질입니다. PEI의 (+전하)가 음전하를 띠는 DNA와 결합하여 복합체를 형성하고, 이를 세포로 전달합니다.
PEI에는 “branched”와 “linear” 형태가 있습니다 [노트 3].  
PEI는 Lipofectamine 보다 훨씬 저렴하므로 대량의 DNA를 전달 실험에 자주 사용됩니다. [실전 실험 프로토콜 101] 6. Stable cell line 만들기에서도 “PEI (branched)”를 사용했습니다 [출처 2]. 

실험 과정

Day 1. 
HEK293 셀을 6-well plate에 1:3.5 비율로 희석합니다 [노트 2]. 

Day 2. 
1 µg DNA에 2.5 µl “PEI (branched)” 비율 [1:2.5 ratio]
A. 150 µl DMEM에 2 µg DNA를 넣습니다.  
B. 150 µl DMEM에 5 µl “PEI (branched)” (2.5 µg “PEI (branched)”/1 µg DNA)를 넣습니다.
희석한 “PEI (branched)” (B)를 희석한 DNA (A)에 천천히 넣고, 실온에서 15분 기다립니다 [노트 4].
기다리는 동안 6-well plate의 배지를 제거하고, 항생제가 포함된 새로운 배지 1.7 ml를 6-well plate에 넣습니다 [노트 5].
5분 후,  혼합물 (B+A)을 한 방울씩 떨어뜨리며 6-well plate를 앞뒤로 천천히 흔듭니다. 

• Day 3. 
• 다음 날, 배지를 제거하고 새로운 항생제가 포함된 배지로 교체합니다. 

37°C에서 1-2일 배양합니다. 

“Lipofectamine 2000”과 PEI 비교

“Lipofectamine 2000”는 siRNA와 플라스미드 DNA모두에 효과적으로 작용하지만, PEI는 siRNA 전달 효율이 낮거나, 특정 플라스미드 DNA에서 세포 내 전달이 잘되지 않는 경우가 있었습니다. 따라서, PEI를 사용할 때는 반드시 테스트 실험을 먼저 하는 것이 좋습니다.

비용 면에서 보면 “Lipofectamine 2000”을 이용한 실험은 “PEI (branched)” 보다 약 480,992 배 더 비쌉니다. 

예를 들어, 플라스미드 DNA 2 µg을 사용할 때, “PEI (branched)”는 5 µg이 필요하고, “Lipofectamine 2000”은 4 µl가 필요합니다. “PEI (branched)” 100 g은 약 20,000,000회 실험할 수 있으며, “Lipofectamine 2000” (750 µl)는 187회 실험할 수 있습니다. 

“PEI (branched)” 100 g 가격은 $121 [출처 3]이고, “Lipofectamine 2000” (750 µl)은 $546.65입니다. 즉, PEI는 1회 실험 비용은 $0.00000605, “Lipofectamine 2000”의 1회 비용은 $2.91로 약 480,992 배 차이가 납니다 [노트 6]. 

“Lipofectamine 2000” vs “PEI (branched)” 비교

1. 1. 짧은 이중가닥 RNA로, 세포 내에서 특정 mRNA (messenger RNA)를 인식해 분해함으로써 해당 유전자의 발현을 억제합니다. 
2. 2. 1:3.5로 희석한다는 의미는 1 well (100% confluent)을 3.5 well로 나누어 약 28.6% confluent로 만듭니다. 이렇게 하면 다음 날 세포가 70-90% confluent 상태가 됩니다.   
3. 3. 개인적인 실험 결과에 의하면, “PEI (linear)”는 낮은 농도의 DNA transfection에 효율적이고, “PEI (branched)”는 높은 농도에서 더 효율적이었습니다. “PEI (linear)”는 약간 더 독성이 있었습니다. 4°C에 보관을 하고 사용하기에는 “PEI (branched)”가 “PEI (linear)”보다 더 안정했습니다. 
4. 4. PEI를 빠르게 넣으면 큰 응집체가 생기므로, PEI 용액을 DNA 용액에 천천히 첨가해야 합니다. 
5. 5. “PEI (branched)”의 경우는 항생제가 포함된 배지를 사용할 수 있고, transfection 다음 날 배지를 교체하면 됩니다. 반면, “Lipofectamine 2000”은 4-6시간 후에 배지를 갈아야 합니다. 
6. 6. 계산식: 

   PEI: 100,000,000 µg / 5 µg = 20,000,000회 -> ($121 / 20,000,000 회 = $0.00000605)
   “Lipofectamine 2000” (750 µl) -> 750 µl / 4 µl =187.5회 -> ($545.65 / 187.5회 =$2.91).
   즉, “Lipofectamine 2000”이 PEI보다 약 480,992배 더 비쌉니다 ($2.91 / $0.00000605 = 480,992).   

출처
1. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11668030
2. https://www.ibric.org/bric/trend/bio-series.do?mode=series_view&beforeMode=latest_list&newsArticleNo=8867956&articleNo=8882807&title=%5B%EC%8B%A4%EC%A0%84+%EC%8B%A4%ED%97%98+%ED%94%84%EB%A1%9C%ED%86%A0%EC%BD%9C+101%5D+%236.+Stable+cell+line+%EB%A7%8C%EB%93%A4%EA%B8%B0#!/list
3. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/181978?srsltid=AfmBOopz0D4AMh78hQcmiOI0PWLG0A8K3HIEQJFlr9L8DIFnKAVYAsoK&utm_source=chatgpt.com