DNA 손상으로 복제 장애가 발생하더라도, 정상적인 DNA 합성이 재개될 수 있도록 도와주는 암 억제 단백질 ATAD5의 새로운 역할이 밝혀졌다. 기초과학연구원(IBS, 원장 노도영) 유전체 항상성 연구단(단장 명경재) 강석현 연구위원 연구팀은 ATAD5가 DNA 손상 시에도 DNA 복제는 중단되지 않도록 유도하는 손상우회 신호를 부적절하게 증폭되지 않도록 조절해, 유전체 안정성을 유지하는 역할을 함을 밝혔다.

염색체 복제 과정에서 DNA 손상으로 복제 장애가 발생하면, 합성 중인 DNA를 감싸 다양한 단백질과 DNA 간의 상호작용을 매개하는 필수 단백질 증식세포항원(PCNA, Proliferating Cell Nuclear Antigen)이 유비퀴틴 단백질과 결합하여 유비퀴틴화가 일어난다. 

유비퀴틴화된 PCNA(Ub-PCNA)는 DNA 손상복구 단백질들을 손상 부위로 끌어와 복제가 계속될 수 있도록 유도하지만, 이는 부정확하고 비효율적이다. 그래서 탈유비퀴틴화 효소를 통해 Ub-PCNA에서 유비퀴틴이 제거되어야 정상적인 DNA 합성을 재개할 수 있지만, 이러한 Ub-PCNA 탈유비퀴틴 과정은 지금껏 규명되지 않아왔다.

이에 IBS 연구팀은, ATAD5가 탈유비퀴틴화의 핵심 인자임을 규명했다. 다양한 돌연변이를 이용해 ATAD5의 N-말단 부위가 DNA에 결합된 Ub-PCNA를 인식하고, 탈유비퀴틴화 효소인 UAF1-USP1 복합체를 불러들여 Ub-PCNA를 변형 전의 PCNA로 환원시키는 탈유비퀴틴화 과정을 설명했다. 특히 돌연변이 ATAD5 단백질을 발현하는 세포를 이용해, ATAD5가 PCNA 탈장착 과정과 탈유비퀴틴화 과정을 동조화시켜 핵 내에 Ub-PCNA가 쌓이지 않도록 조절함으로써 DNA 손상우회의 부적절한 증폭과 활성화를 막음을 확인했다.

또한 ATAD5 단백질과 탈유비퀴틴화 효소 USP7-USP11 간의 새로운 상호작용을 발견하여 이들이 UAF1-USP1 복합체와 함께 다중 유비퀴틴화 PCNA의 효율적 탈유비퀴틴화에 기여함을 확인했다.

더 나아가, 생쥐 모델을 통해 탈유비퀴틴화 효소와의 결합을 방해하는 ATAD5의 돌연변이가 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화를 억제하고, 생쥐 피부의 UV에 의한 DNA 손상을 증가시킴을 확인해 DNA 복제 및 손상복구 과정이 어떻게 연동되어 유전체 안정성을 유지하는지 이해하는 중요한 단서를 찾았다.

강석현 IBS 연구위원은 “향후, ATAD5와 탈유비퀴틴화 효소 복합체의 구조적 특성을 밝히고 그 생화학적 활성과 연계하여 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴 과정을 효과적으로 제어할 수 있는 방법을 찾을 예정이다.”라고 앞으로의 연구계획을 밝혔다.

이 연구 결과는 세계적인 미국국립과학원회보 (PNAS, IF 9.4)에 2024년 8월 13일(한국시간 오전 4시) 온라인 게재됐다.

논문/저널/저자

ATAD5 functions as a regulatory platform for Ub-PCNA de-ubiquitination/ PNAS (2024)

Eunjin Ryu(류은진)†, Juyeong Yoo (유주영)†, Mi-Sun Kang (강미선)†, Na Young Ha (하나영), Yewon Jang (장예원), Jinwoo Kim (김진우), Yeongjae Kim (김영재), Byung-Gyu Kim (김병규), Shinseog Kim (김신석), Kyungjae Myung (명경재), and Sukhyun Kang (강석현)* †공동제1저자, *교신저자

연구내용 보충설명

ATAD5 단백질이 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화 과정에 참여함은 알려져 있었으나 그 작용 기전은 불명확했다. 본 연구에서는 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴을 매개하는 주요 효소인 UAF1-USP1 단백질이 DNA에 결합한 상태의 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화는 효율적으로 촉매하나, DNA에서 분리된 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화는 그렇지 않음을 발견하였다. 따라서, Ub-PCNA 탈유비퀴틴화는 DNA상에서 일어나야 한다. 반면, ATAD5 단백질은 PCNA를 DNA로부터 분리시키는 단백질 복합체의 주요 구성인자이다. 이번 연구에서 생화학적 및 세포 분석학적 실험을 통해 ATAD5 단백질이 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화 과정에 참여함으로써 Ub-PCNA가 DNA로부터 분리되기 전에 효율적으로 탈유비퀴틴화 될 수 있도록 하여 Ub-PCNA가 탈유비퀴틴화 과정을 회피해 부적절하게 증가하는 것을 막음을 보였다. DNA에 결합한 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화를 촉진하기 위해 ATAD5 단백질의 N-말단 부위에는 UAF1-USP1, Ub-PCNA 및 DNA와 결합할 수 있는 부위가 각각 존재하고 이들 부위에 돌연변이가 생길 경우 세포 내 Ub-PCNA 양이 부적절하게 증가해 UV나 H2O2 등 DNA 손상 인자에 대한 민감도가 증가함을 확인할 수 있었다.

연구 이야기

[연구 과정 및 성과 차별점]

이 연구는 PCNA라는 단백질의 유비퀴틴화가 DNA 복제 과정에서 어떻게 조절되는지를 설명하고, 이를 통해 DNA 손상 복구의 새로운 조절 기작을 제시하고 있다.

PCNA는 염색체 복제시 DNA 클램프 역할을 하며, 복제 과정에서 장애물이 발생하면 단일 또는 다중 유비퀴틴화되어 손상된 DNA 우회를 돕는다. 복제 장애물이 해결된 후에는 PCNA가 탈유비퀴틴화되어야 효율적인 DNA 합성을 재개할 수 있다.

이번 연구의 목표는 유비퀴틴화된 PCNA(Ub-PCNA)의 탈유비퀴틴화에 참여하는 인자들을 확인하여 그 작용 과정을 밝히고, Ub-PCNA의 탈유비퀴틴에 문제가 생길 경우 어떠한 유전체 불안정성이 초래되는지를 탐색하는 것이다.

이러한 연구를 위해, 정제된 ATAD5 N-말단 부위, DNA에 결합한 PCNA 및 PCNA 유비퀴틴화 효소와 탈 유비퀴틴화 효소 등을 이용해 Ub-PCNA 탈유비퀴틴화 과정을 효과적으로 모니터링할 수 있는 시험관 내 분석 방법을 확립하였다. 또한 돌연변이 ATAD5 단백질만을 발현하는 세포주 및 생쥐를 만들어 ATAD5에 의한 탈유비퀴틴 과정이 망가질 때 일어나는 다양한 형질들을 명확히 분석할 수 있었다. 

ATAD5 단백질은 염색체 복제후 PCNA를 DNA로부터 떼어내는 PCNA 탈장착 복합체의 중요한 구성 단백질이다. 이번 연구는 ATAD5의 N-말단 부위가 DNA에 결합된 유비퀴틴화된 PCNA(Ub-PCNA)를 인식하고, 탈유비퀴틴 효소를 불러들여 Ub-PCNA를 탈유비퀴틴화 하는 과정을 설명했다. 본 연구를 통해 ATAD5의 N-말단부위의 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화에 있어서의 기능이 각 아미노산 잔기 수준에서 명확히 결정되었다. 또한, 탈유비퀴틴화 효소의 직접적인 기질인 아닌 ATAD5가 왜 Ub-PCNA의 유비퀴틴 과정에 참여하는지 논리적으로 설명할 수 있는 근거를 제시하였다. ATAD5는 PCNA 탈장착 과정과 탈유비퀴틴화 과정을 동조화시켜 핵 내에 Ub-PCNA가 쌓이지 않도록 조절함으로써 DNA 손상복구 시그널의 부적절한 활성화를 막는다. 이를 통해 DNA 손상복구 기작과 정상적 DNA 복제 사이의 효율적 전환을 유도함으로써 유전체 안정성이 확보될 수 있다. 또한, ATAD5와 USP7-USP11 간의 새로운 상호작용을 발견하여 이들이 UAF1-USP1과 함께 다중 유비퀴틴화된 PCNA를 더 효율적으로 탈 유비퀴틴화할 수 있음을 확인했다.

ATAD5의 특정 돌연변이는 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화를 억제하여, DNA 손상에 대한 민감도를 증가시킨다. 이는 시험관 내 및 생체 내 모델에서 확인되었다. 돌연변이 ATAD5 단백질을 발현하는 세포는 DNA 손상인자들에 의해 DNA 손상이 더 많이 일어나고 더 쉽게 사멸하였다. 돌연변이 ATAD5 단백질을 가지고 있는 생쥐의 피부에 UV를 조사할 경우 더 많은 DNA 손상이 일어났다. 이 연구는 DNA 복제 및 수선 과정의 조절기작의 이해에 있어 중요한 단서를 제공한다.

[향후 연구계획]

ATAD5와 탈유비퀴틴화 효소복합체의 구조를 분석하여 그 구조적 특성과 이번 연구에서 밝힌 생화학 세포분석학적 연구 결과와의 연관성을 연구할 예정이다. 이러한 구조적 특성과 연계하여 Ub-PCNA 의 탈유비퀴틴 과정을 효과적으로 제어할 수 있는 방법을 찾아 임상 분야에서의 응용가능성을 탐색해보고자 한다.

[그림1] ATAD5 단백질과 UAF1-USP1 탈유비퀴틴화 효소에 의한 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화 조절이 유전체 안정성에 기여함.
야생형 (WT) 혹은 UAF1-USP1에 결합하지 못하는 돌연변이 ATAD5를 가진 생쥐의 피부를 UV로 조사한 후, 피부세포에서의 DNA 손상 정도를 TUNEL 분석방법으로 확인하였다. 돌연변이 ATAD5 생쥐의 DNA 손상이 약 세 배 정도 높다. [사진=기초과학연구원]

[그림 2] ATAD5 단백질은 DNA에 결합한 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화를 촉진함.
ATAD5는 UAF1-USP1 탈유비퀴틴화 효소와 상호작용하여 DNA에 결합한 Ub-PCNA의 탈유비퀴틴화를 촉진한다. ATAD5는 PCNA를 DNA로부터 분리하는 PCNA의 탈장착 복합체의 주요인자기도 하며, Ub-PCNA의 DNA 분리와 탈유비퀴틴화를 동조화시킴으로써 핵질내에 Ub-PCNA가 부적절하게 쌓이지 않도록 한다. [사진=기초과학연구원]